一种构建mRNA5’端信息文库的方法

一种构建mRNA5’端信息文库的方法

　　技术领域tt

　　本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种构建mRNA5’端信息文库的方法。tt

　　背景技术tt

　　基因的表达调控最主要的方式是转录调控，即启动子顺式作用元件与转录机器互tt作的调控。位于转录起始位点(TSS)上游的核心启动子包含了与转录机器互作的最主要的tt作用元件，因此启动子的准确鉴定对研究基因表达调控至关重要。不同的转录起始位点，会tt导致基因使用不同的5’UTR。5’UTR对mRNA的翻译起始至关重要，是翻译效率调控的最主要tt靶标区域之一。绝大多数基因都有2个以上的转录起始位点，系统鉴定mRNA的转录起始位tt点，一方面可以鉴定核心启动子元件，另一方面可以确定mRNA的5’UTR，是研究基因表达的tt有力方式，适用与基因调控网络研究。tt

　　最早人们研究5’UTR序列信息，是采用5’RACE方法(B.C.SchaeferVolume227,ttIssue2,May1995,Pages255–273)，但是通量较低，构建克隆耗时较长。第1个高通量获得tt转录起始位点预测方法是帽分析基因表达法(CAGE)，该方法是由最早的Sanger测序法发展tt而来的，并能通过cDNA克隆获得完整的RNA帽子结构。该方法虽然对转录起始位点的预测有tt效，但需要大量高质量的RNA并且获得的转录起始位点很短，仅是20～21个核苷酸长度。tt

　　通过高通量的二代测序技术(NGS)发展，CAGE方法得到改进，经研究发现，通过该tt方法可以获得整个基因组范围内复杂的转录起始位点分布和独特的启动子。CAGE与RNA测tt序技术结合后衍生出了以CAGE策略为基础的DeepCAGE法、CAGEscan法(如图1)、nano-CAGEtt法(如图2)、以及PEAT法。nanoCAGE法解决了CAGE法需要大量RNA的缺点，可以通过放大技术tt从10ng的总RNA量获得转录起始位点的映射。PEAT法和CAGEscan法双末端测序可以获得转tt录起始位点映射以及转录起始位点下游区间，具有良好的连通性并能促进识别特殊的转录tt本；此外，双末端测序缓解了对单个短读取重复区的校对，通过RNA测序可以获得序列的重tt复特性。尽管这些方法结合了NGS技术，克服了一些CAGE方法的不足，但存在一定的弊端，例tt如，nano-CAGE法扩增循环数较多，易引入偏好性；在检测扩增结果过程中的有些操作步骤，tt可能影响了转录起始位点出现的频率；没有特异性，编码RNA和非编码RNA都可以鉴定；而且tt这些技术步骤多、不易操作。tt

　　发明内容tt

　　为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种CAGE-seq测序文库的构建方tt法，其包括如下步骤：tt

　　1)用DNaseI处理RNA样品，获得无DNA污染的RNA；tt

　　2)富集含polyA尾巴的mRNA，将富集到的含5’端帽子结构的RNA进行去帽子结构，tt加5’接头，所述的5’端接头是gnomegen公司的RNA-SeqLibraryPreparationKitforttWholeTranscriptomeDiscovery，货号为K02421中提供的，然后片段化处理样品；tt

　　3)使用随机引物对片段化处理的样品进行逆转录，合成cDNA；tt

　　4)采用步骤2)的gnomegen公司试剂盒中的PCR体系，试剂盒中与5’端接头匹配的tt引物，进行PCR扩增，得到CAGE-seq测序文库，只有5’端连接有接头的序列，才能扩增出文tt库。tt

　　上述步骤2)具体包括：tt

　　(1)用Ambion公司，货号为61005的Oligo(dT)25磁珠富集含polyA尾tt巴的mRNA；tt

　　(2)用thermoFisher公司，货号为EF0654的fastAP酶处理mRNA，将不含5’端帽子结tt构保护的RNA去磷酸化，5’端变为羟基，使其后续无法加上5’接头；tt

　　(3)将步骤(2)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；tt

　　(4)用enpicentre公司，货号为T81050的TAP酶将含5’端帽子结构的mRNA进行去帽tt子结构处理，5’端变为单磷酸基团；tt

　　(5)将步骤(4)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；tt

　　(6)将步骤(5)得到的样品5'端加接头，得到加5’接头的mRNA片段；tt

　　(7)将步骤(6)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；tt

　　(8)将步骤(7)得到的样品在95℃温育5min，进行片段化处理，用GnomeSizettSelector纯化片段化后样品。tt

　　将上述方法获得的测序文库用Illumina公司Hiseq3000/2500或Next500测序仪进tt行双端测序，双端测150个碱基。tt

　　本发明技术方案的流程参见图3。tt

　　本发明与现有技术相比，有如下优点：tt

　　(1)本发明在5’RACE基础上添加了高通量测序，并在建库过程中添加了PolyA捕获tt纯化样品，能更好地富集全长mRNA；tt

　　(2)本发明通过fastAP酶(NEB)处理mRNA，将不被5’端帽子结构保护的mRNA去磷酸tt化，5’端变为羟基，使其后续无法加上5’接头；用TAP酶(enpicentre)将含5’端帽子结构的ttmRNA进行去帽子结构处理，5’端变为单磷酸基团，便于5'端加接头，得到加5’接头的mRNA片tt段；然后进行片段化处理，使mRNA的长度变短，从而使逆转录后得到的带有5'接头序列的产tt物几率增大；配合使用gnomegen公司的PCR体系，使得PCR扩增后得到的测序文库带有更多tt的5'端信息。对于鉴定整个细胞内mRNA的转录起始位点，从而获得准确的启动子信息和5’ttUTR信息更有帮助，是研究基因表达的有力方式，适用与基因调控网络研究。tt

　　(3)本发明简化现有CAGE-seq文库构建方法，从而解决之前步骤多且不易操作的tt问题；整合了相关RNA-seq建库试剂盒，使实验流程化，便于经验少的人员也能成功操作。tt

　　附图说明tt

　　图1CAGEscan文库构建流程。tt

　　图2nano-CAGE文库构建流程。tt

　　图3本发明CAGE文库构建流程。tt

　　图4PCR产物电泳图tt

　　1为1kbplusMarker(从下至上共11条带，依次为100bp、200bp、300bp、400bp、tt500bp、700bp、1000bp、1600bp、2000bp、5000bp、10kb)2为建库样品。tt

　　图5PCR产物筛选后库电泳图tt

　　1/2/4/5为建库样品，不同筛选片段，4泳道在300-500bp条带有富集，是选择上机tt的样品；3为1kbplusMarker(同图4)。tt

　　图6是将本发明方法获得的有效测序数据比对到参考基因组上的统计结果tt

　　图6A是为小鼠脑组织样本的CAGE-seq测序reads分布图；图6B是同样的小鼠脑组tt织样本RNA-seq测序reads分布图；tt

　　由图可知本方法能很好的富集含5’cap的有效片段，有67.4％的数据富集在5’UTRtt区，而普通转录组方法仅有1.7％。由结果显示，在CAGES-seq结果中测序样本在5‘UTR区有tt非常好的富集。tt

　　图7是将本发明方法应用到不同物种中的测序数据结果tt

　　7A是模式植物拟南芥的CAGE-seq结果，7B是小鼠的CAGE-seq结果，由图可知本方tt法能很好的在不同物种中富集含5’cap的有效片段。tt

　　具体实施方式tt

　　通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施tt例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。tt

　　所有实施例中的有关DNA和RNA基本操作均参考《分子克隆：实验室操作指南》(金tt冬雁等译，科学出版社，北京(1998))和《精编分子生物学指南》(颜子译，科学出版社，北京tt(1998))。分子操作中所用的酶和特殊试剂在之后括号中均注明了相应的公司。tt

　　【实施例1】捕获样品tt

　　取20μgRNA，加入DnaseI酶(promega)消解，消解掉RNA样品中的DNA，防止基因组tt污染。纯化后RNA，使用60μlOligo(dT)25调取带有polyA尾巴的mRNA。磁珠纯tt化mRNA步骤可以按照Ambion公司提供的标准流程。两轮洗脱后的样品回溶到20μl10mMttTris-HCl中。tt

　　下面是详细的步骤：tt

　　1.1.准备水浴锅和热混仪。tt

　　1.2.RNA样品水浴65℃加热5min后(破坏2级结构)，迅速置冰上。tt

　　1.3.取60μlOligo(dT)25到一个新的无RNA酶的EP管中。tt

　　1.4.加入100μlBeadBindingBuffer轻轻涡旋混合搅拌持续1分钟，闪甩，放在tt磁力架上静置，弃上清，用BeadBindingBuffer再重复漂洗磁珠清洗一次，移除上清。tt

　　1.5.取50μlBeadBindingBuffer悬浮磁珠，然后加入已冰浴好的50μl样品，轻tt轻混匀。tt

　　1.6.置于混匀器上持续混匀，室温孵育5min；置磁场，弃上清。tt

　　1.7.样品室温孵育时，取50μlBeadBindingBuffer到一个新的无RNA酶的EP管tt中。tt

　　1.8.接7，磁珠中加入200μlWashingBuffer轻轻涡旋混合搅拌持续1分钟，闪甩，tt置磁场，弃上清，用WashingBuffer再重复漂洗磁珠清洗一次，移除上清。tt

　　1.9.加入50μl的10mMTris-HCl到磁珠中，放置在热混仪上80℃加热2mintt(600rpm,开30s,停30s)，从磁珠上将mRNA洗脱下。tt

　　1.10.立即将离心管置于磁场，将上清转移至第8步中的离心管中。注意磁珠不要tt丢掉。tt

　　1.11.清洗磁珠，加入200μlWashingBuffer轻轻涡旋混合搅拌持续1分钟，闪甩，tt置磁场，弃上清，用WashingBuffer再重复漂洗磁珠清洗一次，移除上清。1.12.将第9步中tt的样品再次水浴65℃加热5min后(破坏2二级结构)，迅速置冰上。tt

　　1.13.将100μl已冰浴好的样品加入到已清洗好的磁珠中，置于混匀器上持续混tt匀，室温孵育5min；置磁场，弃上清。tt

　　1.14.将200μlWashingBuffer加入到磁珠中轻轻涡旋混合搅拌持续1分钟，闪tt甩，置磁场，弃上清，用WashingBuffer再重复漂洗磁珠清洗一次，移除上清。1.15.加入20μttl的10mMTris-HCl到磁珠中，放置在热混仪上80℃加热2min(600rpm,开30s,停30s)，从磁tt珠上将mRNA洗脱下。立即将离心管置于磁场，将上清转移至一新中离心管中，这是最终我们tt捕获下来的mRNA，约20μl。tt

　　【实施例2】5’端帽子结构连接5’接头tt

　　2.1将不被帽子结构保护的RNA进行去磷酸化处理tt

　　首先，选用fastAP(NEB)酶，反应体系如下，tt

　　2.2用Oligo(dT)25纯化核酸tt

　　反应完成后，用Oligo(dT)25纯化核酸，去掉反应体系中的盐离子及tt酶等，反应步骤如下：tt

　　2.2.1.将beads涡旋混匀，取60μl的beads置于1.5ml的离心管中；tt

　　2.2.2.取100μl的BindingBuffer涡旋清洗磁珠，弃上清备用，重复一次，再取50μttlBindingBuffer重悬磁珠；tt

　　2.2.3.将上述2.1获得的样品补水至50μl，加入到50μlbeads中，吹打或者涡旋混tt匀，置于旋转混合仪上孵育5min；tt

　　2.2.4.孵育5min后，将样品置于磁力架上，静置2-3min,弃上清；tt

　　2.2.5.取200μl的washbuffer清洗磁珠2次；tt

　　2.2.6.加入20μlTrisHCl，吹打混匀置于80℃，2min热混仪上洗脱tt

　　2.2.7.置于磁力架上2min,待溶液澄清后，转移上清置新的0.2ml的离心管中。tt

　　2.3打开5’端帽子结构，暴露磷酸基团tt

　　使用epicentre的TAP酶，打开5’帽子结构，暴露磷酸，为下一步的接头只连接到5’tt帽子结构做准备。tt

　　酶反应体系如下：tt

　　2.4用Oligo(dT)25纯化核酸tt

　　反应完成后，取用Oligo(dT)25纯化核酸，去掉反应体系中的盐离子tt及酶等，反应步骤如下：tt

　　2.4.1.将beads涡旋混匀，取50μl的beads置于1.5ml的离心管中；tt

　　2.4.2.取100ul的BindingBuffer涡旋清洗磁珠，弃上清备用，重复一次，再取tt50ulBindingBuffer重悬磁珠；tt

　　2.4.3.将2.3中的样品补水至50μl，加入到50μlbeads中，吹打或者涡旋混匀，置tt于旋转混合仪上孵育5min；tt

　　2.4.4.孵育5min后，将样品置于磁力架上，静置2-3min,弃上清；tt

　　2.4.5.取200μl的washbuffer清洗磁珠2次；tt

　　2.4.6.加入27μlTrisHCl，吹打混匀置于80℃，2min热混仪上洗脱；tt

　　2.4.7.置于磁力架上2min,待溶液澄清后，转移上清置新的0.2ml的PCR管中。tt

　　2.5连接5’接头tt

　　使用gnomegen公司mRNAkit中的5’adapter。反应体系如下：tt

　　反应完成后，用50μlOligo(dT)25纯化核酸，去掉反应体系中的盐离tt子及酶等，步骤同2.4，最后回溶体积20μl。tt

　　【实施例3】逆转录合成cDNAtt

　　建库流程，参考gnomegen公司RNA-seqkit操作手册。tt

　　将样品片段化处理95°℃温育5min，然后用GnomeSizeSelector纯化片段化后样tt品。将纯化的片段化产物补水到40μl加入24μlGnomeSizeSelector并且吸打5次混匀，再tt加入16μl100％Ethanol，吸打5次混匀。室温静置5min。将样品转移至磁力架，静置3min。弃tt上清。样品放在磁力架上，加入100μl70％Ethanol并吸打3次清洗。将70％Ethanol吸干净，tt将样品从磁力架上取下来，干燥5min。每个样品取10μlDEPC水回溶，并吸打5次重悬磁珠。tt慢速旋转样品2min，然后磁力架上静置3min。将10μl上清转入新的PCR管中，加入1μlRTttprimer(包含6个随机碱基及一段已知接头序列)及1μl10mMdNTP65℃5min后立即置于冰tt上，然后依次加入4μl5XFirstStrandBuffer，2μl100mMDTT，1μlReversettTranscriptase，1μlRNaseOut(fermentas)。逆转录体系在25℃孵育10min，之后加热到42tt℃，反应40min，随后加热到70℃共15min失活逆转录酶。反应可在4℃保存过夜。采用ttgnomegen公司GnomeSizeSelector纯化并洗脱于20μl无核酸酶的超纯水中。tt

　　【实施例4】PCR扩增和片段筛选tt

　　采用gnomegen公司PCR体系，在50μl反应体系中，含有20μl实施例3中获得的cDNAtt模板、1倍浓度gnomegen公司的HiFi缓冲液、25pmol的正向引物和25pmol的反向引物，不足tt体积补水。热循环的参数如下：98℃for45second；PCR循环数10-15：98℃for15second、tt60℃for30second、72℃for30second；72℃1min，4℃保温。经过15个PCR循环的建库DNAtt产物的电泳图如图4所示。加入80ulGnomeSizeSelector到50μl反应液中，吸打混匀10tt次，静置5min后，放于磁力架3min，吸取上清到新PCR管中，注意不要吸到磁珠，加10μlttGnomeSizeSelector到上清中，吸打混匀10次，静置5min后，放于磁力架上3min，弃上清，tt加入200μl70％Ethanol并吸打3次清洗。将70％Ethanol吸干净，将样品从磁力架上取下tt来，干燥5min。每个样品取20μlDEPC水回溶，并吸打5次重悬磁珠。慢速旋转样品2min，然后tt磁力架上静置3min。将20μl上清转入新的EP管中。用GnomeSizeSelector筛选的产物的电tt泳图如图5所示。用Qubit荧光仪(Invitrogen)测定文库的浓度。Illumina公司Hiseq3000/tt2500或Next500测序仪进行双端测序，双端测150个碱基。tt