多态性短串联重复基因座等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及核酸的检测方法，具体涉及一种高度多态性短串联重复基因座的等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用
背景技术
在法医学领域，基于DNA的分型技术广泛用于个体识别、同一认定、亲权鉴定等实践工作中。其中，短串联重复(short tandem repeats，STR)的发现和发展在DNA分型中起着重要作用。短串联重复是由2-7个碱基对作为核心重复单位，串联形成的一类微卫星DNA。由于核心重复单位的拷贝数在人群中存在差异，导致同一STR基因座具有多个等位基因，是STR基因座遗传多态性的基础。研究显示，在人基因组中，一半左右的STR基因座在群体中存在多态性。然而，由于STR基因座的GC含量、重复序列及拷贝数、插入缺失、侧翼序列及单核苷酸多态性，特别是STR基因座在人群中的多态性和杂合度，使得只有极少数STR基因座能够应用于法医学的研究和实践工作。
STR的分型，目前最常用的是应用PCR扩增STR基因座，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以通过放射自显影、银染和荧光标记等技术进行STR分型。目前，最常采用的是荧光标记技术进行STR分型。简单地讲，将荧光分子标记STR基因座特异正向或反向引物的5’端，使得扩增产物带有荧光。在法医学STR基因座的等位基因命名中，一个等位基因通常以其核心重复序列的拷贝个数命名；对于含有不完整拷贝数的等位基因，采用“完整拷贝个数.不完整拷贝的碱基个数”的方式命名。在STR分型过程中，通常以等位基因梯作为标准品对未知等位基因型进行认定。等位基因梯是人群中检测到的等位基因的混合物，是STR基因分型的重要标准品。等位基因梯的制备有多种方式，包括以含有特定等位基因的DNA样品作为模板通过PCR扩增后按比例混合制备成等位基因梯，也可先将各等位基因分别插入克隆载体，再按照比例混合克隆载体后通过PCR扩增获得等位基因梯或先以各克隆载体为模板通过PCR得到各等位基因产tttt物后按比例混合而制成等位基因梯。
一般地，检测单个STR基因座不能满足法医学实践的要求。为提高检测系统的效能，通常同时检测分析多个非连锁遗传的STR基因座。目前，一个复合PCR扩增体系通常可以同时检测分析20个左右的STR基因座。在目前的STR复合分型系统中，多条常染色体未被纳入到常规检测范围内(如第14号染色体)，明显降低了STR复合分型系统的系统效能。在STR复合分型系统中，若检测的STR基因座能覆盖更多的常染色体，甚至覆盖所有常染色体，将明显地提高STR复合分型系统的效能。
目前，对第14号染色体上的STR基因座研究和报道较少。虽然以往的研究报道表明第14号染色体上存在大量的STR基因座，然而哪些STR基因座多态性高，适合法医学研究和应用仍未见系统性的报道。因此，系统性筛选14号染色体上的STR基因座，鉴定多态性高、适合法医物证学研究和应用的STR基因座是非常有必要。同时，制备其等位基因梯，可用于DNA分型。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术存在的缺陷，提供一种核酸的检测方法，具体涉及一种高度多态性短串联重复基因座的等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用。
本发明基于发明人在长期的研究中发现的人第14号染色体短串联重复D14S739具有高度多态性并提出了其等位基因梯，同时获得了其在人群中的法医学参数。本发明D14S739基因座具有高度多态性，可以被广泛的应用于个人识别、同一认定、亲权鉴定等遗传检测的实践工作，具有非常高的法医学价值。
具体的，本发明的第一个方面提供了一种等位基因梯，包含至少10个核心重复序列长度为92～128个碱基或碱基对的短串联重复D14S739的等位基因的核酸片段。
作为进一步优选的方案，所述等位基因梯包含14个短串联重复D14S739的等位基因，其核心重复序列次数为21～34次。
作为更进一步优选的方案，所述的等位基因梯的核酸片段的核心重复序列为ttttSeq No.1～14。
作为更进一步优选的方案，所述的短串联重复D14S739来自于人第14号染色体。
本发明中，等位基因梯的核酸片段的核心重复序列分别为Seq No.1～14。
本发明中，短串联重复D14S739的PCR扩增引物对为Seq No.15～16。
本发明的第二个方面提出了包含至少10个核心重复序列长度为92～128个碱基或碱基对的短串联重复D14S739的等位基因的核酸片段的等位基因梯的制备方法，包括如下步骤：
1)通过引物分别PCR扩增短串联重复D14S739的等位基因，分别经DNA纯化获得含有短串联重复D14S739的等位基因的核酸片段；
2)将步骤1)制备得到的核酸片段分别接入克隆载体，经过DNA连接反应、感受态细胞转化以及克隆鉴定，获得含有串联重复D14S739的各等位基因核酸片段的克隆载体；
3)将步骤2)制备的各克隆载体通过荧光标记的短串联重复D14S739的特异性引物PCR扩增，扩增产物经核酸纯化试剂盒纯化并核酸定量后按照一定比例混合；
或将步骤2)制备的各克隆载体按一定比例混合，并通过荧光标记的短串联重复D14S739的特异性引物PCR扩增，获得荧光标记的目的DNA片段，并经核酸纯化试剂盒纯化；
4)将步骤3)制备的产物经95℃变性5分钟后，立即置于-20℃环境10分钟，获得短串联重复D14S739的等位基因梯。
作为进一步优选的方案，可通过如下步骤得到短串联重复D14S739的等位基因：
1)使用荧光标记的短串联重复D14S739的特异性引物经PCR扩增和毛细管电泳分析，通过大规模的人群调查，获得短串联重复D14S739的等位基因在人群中的分布；
2)计算短串联重复D14S739的等位基因的数目，并计算各等位基因的分布频率以及D14S739的杂合度、个人识别概率和非父排除概率；
3)含有短串联重复D14S739的特定等位基因的代表性DNA样品，通过使用tttt短串联重复D14S739的特异性引物PCR扩增，扩增产物经DNA测序鉴定；
4)分别收集经鉴定含有代表短串联重复D14S739的特定等位基因的DNA样品。
作为进一步优选的方案，通过前述等位基因梯的制备方法制备得到包含至少10个核心重复序列长度为92～128个碱基或碱基对的短串联重复D14S739的等位基因的核酸片段；
作为更进一步优选的方案，短串联重复D14S739的等位基因梯的荧光标记分子是Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6-FAM。
本发明的第三个方面涉及一种基于前述制备方法制备得到的含有短串联重复D14S739各等位基因核酸片段的克隆载体库。
本发明的第四个方面涉及一种所述等位基因梯的应用，基于所述等位基因梯对短串联重复D14S739进行基因分型。
本发明的第五个方面涉及一种包含至少10个核心重复序列长度为92～128个碱基或碱基对的短串联重复D14S739等位基因的试剂盒。
作为更进一步优选的方案，所述试剂盒还包括短串联重复D14S739的PCR扩增引物及PCR扩增相关试剂。
作为更进一步优选的方案，所述短串联重复D14S739的PCR扩增引物为SeqNo.15～16。
作为更进一步优选的方案，所述试剂盒在核酸样品分析中的应用，所述的核酸样品可来自于毛发、粪便、血、血液制品、肌肉组织、细胞、尿液、唾液、口腔粘膜细胞、精液、阴道分泌物、羊水、皮肤组织、绒毛组织、骨或牙齿。
与现有技术相比，本发明公开的人14号染色体上存在的STR基因座D14S739的具有高度多态性，通过分析其在人群中的等位基因数目及评估其法医学参数并制备等位基因梯，可以被广泛的应用于个体鉴别、同一认定、亲权鉴定等遗传检测的实践工作，具有非常高的法医学价值。
附图说明
1、图1为26个STR基因座在染色体上的位置。
2、图2为制备D14S739的等位基因梯的毛细管电泳图谱。
3、图3为利用D14S739的等位基因梯对一个三联体案例的基因分型图谱。
具体实施方式
虽然发明内容部分已将本发明的原理进行了详细的描述，应该清楚地理解的是，下面将结合具体的实施方式进一步阐明本发明的技术内容，所述实施例不是意在限制本发明的保护范围，而是意图更加详尽地公开本发明的技术内容。如果任何的修改和/或改变对本领域的技术人员来说是显而易见的，也将包含在本发明的构思之中。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
(一)、STR基因座的筛选
在TRDB数据库中，选择人第14号染色体，核心重复序列为简单重复序列，GC含量为20-55％，核心重复序列的次数小于或等于30次并大于或等于8次，插入缺失为0，匹配率为90％；筛选后获得386个STR基因座；进一步通过OLIGO软件考察短STR基因座的侧翼序列的同源性、GC含量，引物设计适合度以及在染色体上的定位，确定26个STR基因座作为候选STR基因座(如图1所示)；
(二)、引物设计及特异性分析
使用Primer5软件分别设计26个候选STR基因座的引物对，并通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物；分别使用26对引物，以2800M DNA(Promega公司)作为模板进行PCR扩增；扩增产物通过凝胶电泳分析，确定各引物对的有效性和特异性，获得26个STR基因座的特异性引物；
PCR反应体系为：
PCR热循环条件为：94℃/5分钟→30个循环(94℃/30秒，59℃/30秒，72℃/30秒)→72℃/10分钟→4℃保持；
(三)、多态性STR基因座选择
在26个引物对中，每个引物对的正向引物或反向引物的5’-端标记6-FAM荧光分子；收集32个无关健康个体的血痕，分别通过Chelex-100法分离DNA；以分离的DNA作为模板，分别使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行毛细管电泳和ID软件分析，以分子量标准物CC5(Promega公司)作为确定PCR产物的大小(序列所含碱基个数)，获得各STR基因座的等位基因的数目；通过PowerStats v1.2软件计算26个STR基因座在32个样品中的等位基因的数目、杂合度、个人识别概率和非父排除概率；再根据等位基因数目、杂合度、个人识别概率和非父排除概率，分析得出第20号候选STR基因座具有最多的等位基因(9个等位基因)、最高的个人识别概率和非父排除概率；经过对第20号候选STR基因座在染色体上的位置分析，第20号候选STR基因座定位在人第14号染色体14q31.1，该位置在国际上被命名为D14S739；因此，按照国际惯例，第20号STR基因座称之为D14S739；
PCR反应体系为：
PCR热循环条件为：94℃/5分钟→29个循环(94℃/20秒，59℃/1分钟，72℃/30秒)→72℃/40分钟→4℃保持；
(四)、D14S739的法医学参数评估
收集480个无关健康个体的血痕，分别通过Chelex法分离DNA。按照实施例五和六的方法制备含有STR基因座D14S739的9个等位基因的等位基因梯；以分离的DNA作为模板，使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增；D14S739tttt的正向引物序列为GAGTGTATTAGGGTTTTCCAGAAGAAC，反向引物序列为CAGCATACCAGCAGCAGATCTT，其中反向引物的5’-端标记6’-FAM荧光分子；PCR产物进行毛细管电泳和ID软件分析，DNA样品的基因分型以分子量标准物CC5(Promega公司)和含9个D14S739等位基因的等位基因梯为标准，确定样品的基因型；在对468个样品分析中，6个新的D14S739基因座的等位基因被发现；通过PowerStats v1.2软件计算D14S739的14个等位基因在人群中的分布频率及D14S739的杂合度、个人识别概率和非父排除概率；
PCR反应体系为：
PCR热循环条件为：94℃/5分钟→29个循环(94℃/20秒，59℃/1分钟，72℃/30秒)→72℃/40分钟→4℃保持；
经计算，D14S739基因座的法医学常数为：
(五)、D14S739等位基因克隆文库制备
收集含有代表特定等位基因的DNA样品，使用引物对扩增目的等位基因；正向引物序列为CAATTATAAGTCTGGTGCCTACTTCA，反向引物序列为TTGAACTGAAACACTGGCTCTT；PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，并使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物；回收产物按照制造商的说明书接入pMDTM19-T(Takara公司)载体，通过领域技术人员已知DNA连接反应、感受态细胞转化以及克隆鉴定分子生物学技术，获得各等位基因的克隆载体；各等位基因的克隆载体通过DNA测序对各等位基因序列进行分析，获得各等位基因的序列信息；通过DNA测序验证，获得分别含有14个等位基因的克隆载体，形成D14S739基因座的等位基因文库；
PCR反应体系为：
PCR热循环条件为：94℃/5分钟→32个循环(94℃/20秒，59℃/1分钟，72℃/30秒)→72℃/40分钟→4℃保持；
(六)、制备D14S739等位基因梯
分别以14个克隆载体作为DNA模板，进行PCR扩增；正向引物序列为GAGTGTATTAGGGTTTTCCAGAAGAAC，反向引物序列为CAGCATACCAGCAGCAGATCTT，其中反向引物的5’-端标记6-FAM荧光分子；PCR产物通过核酸纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并对纯化产物进行DNA定量；根据各纯化产物的浓度，按比例混合14个纯化产物；混合物经95℃变性5分钟后，立即置于-20℃环境10分钟，获得D14S739基因座的等位基因梯；等位基因梯的毛细管电泳图谱如图2所示；
PCR反应体系为：
PCR热循环条件为：94℃/5分钟→32个循环(94℃/20秒，59℃/30秒，72℃/30秒)→72℃/40分钟→4℃保持；
实施例2、D14S739等位基因梯的应用
收集经21试剂盒分型确认亲权关系的三联体(父母子)血痕样品，分别通过Chelex-100法分离DNA：以分离的DNA作为模板，使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增；D14S739的正向引物序列为GAGTGTATTAGGGTTTTCCAGAAGAAC，反向引物序列为CAGCATACCAGCAGCAGATCTT，其中反向引物的5’-端标记6-FAM荧光分子；PCR产物进行毛细管电泳，DNA样品的基因分型以分子量标准物CC5(Promega公司)和含有14个D14S739等位基因的等位基因梯为标准，确定样品的基因型；在检测的200组三联体样品，D14S739基因座的遗传规律符合孟德尔遗传规律，也没有发现基因突变；图3显示了一例典型的三联体基因分型；
收集来自100个健康个体的血痕、毛发及口腔拭子，进行同一认定检测；生物学样品经Chelex-100法分离DNA，使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增；D14S739的正向引物序列为GAGTGTATTAGGGTTTTCCAGAAGAAC，反向引物序列为CAGCATACCAGCAGCAGATCTT，其中反向引物的5’-端标记6-FAM荧光分子。PCR产物进行毛细管电泳，DNA样品的基因分型以分子量标准物CC5(Promega公司)和含有14个D14S739等位基因的等位基因梯为标准，确定样品的基因型；在检测的100个个体的样品中，所有来自同一个个体的血痕、毛发及口腔拭子的DNA分型完全一致。
以上所述的实施例，只是本发明较优的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
<110>复旦大学
<120>多态性短串联重复基因座等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用
Seq No.1
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Seq No.2
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Seq No.3
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Seq No.4
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Seq No.5
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Seq No.6
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Seq No.7
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Seq No.8
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Seq No.9
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Seq No.10
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Seq No.11
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Seq No.12
GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGATAGACAGACAGACAGACAGACGGACAGACAGATA
Seq No.13
GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGATAGACAGACAGACAGACAGACGGACAGACAGATA
Seq No.14
GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGATAGACAGACAGACAGACAGACGGACAGACAGATA
Seq No.15
GAGTGTATTAGGGTTTTCCAGAAGAAC
Seq No.16
CAGCATACCAGCAGCAGATCTT
