中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库及其构建方法和应用。
背景技术
进入21世纪，水产养殖业向多品种、高投入、高密度、集约式、工厂化的方向快速发展，但频繁暴发的传染性病害时刻威胁着该产业的健康可持续性发展。目前，水产养殖生物病害防治主要方法有药物防治、免疫防治和生态防治等，并逐步向高效、低毒、无残留和无公害的方向发展。而化学药物仍是目前水产动物病害防治最直接和最有效的一种手段。我国渔药产业基础薄弱、水产养殖生物病害防治技术滞后与养殖户用药知识匮乏等因素，导致大部分养殖户使用价格低廉、残留严重的农药及化工原料，造成了水体的严重污染。此外，抗生素、激素类等药物在水产养殖过程中的应用，虽然对病害控制起到一定作用，但在很大程度上破坏了水环境及动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，进而导致外源性效应菌和内源性致病菌大量增殖，由此造成了潜在的更大病害。滥用药物将导致致病菌株产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大、流行性更广的致病微生物,长期使用化学药品势必导致病原生物抗药性的增加。随着科技的发展和人类经济文化水平的提高，人们对食品安全和环境安全提出了更高的要求，化学药物正逐渐被生物制品所替代。
作为一种无脊椎动物，中国明对虾依靠其仅有的先天免疫系统实现对外界病原微生物的免疫。中国明对虾在海水这一复杂微生物环境中的正常生长、繁殖，说明其免疫系统能够有效抵御外界病原微生物的侵袭。抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)是一种脂多糖结合蛋白，是鲎、蟹虾类等甲壳动物体内中广泛存在的一类抗菌肽，通过结合脂多糖，调节细胞的脱颗粒作用，引起一系列级联反应，从而在甲壳动物的体液免疫中发挥着重要作用。在前期研究中，申请人所在项目组从中国明对虾血细胞中克隆到ALF全长cDNA序列(FcALF)，研究发现在鳗弧菌等病原刺激下，FcALF在mRNA水平上的表达发生剧烈变化，提示FcALF在对虾应对外界病原感染过程中，发挥着重要作用(Liu,FS,等，MarineBiotechnology，2005,7(6):600-608)。有报道发现人工合成LBD结构域的短肽具有明显 的抗菌活性。但是人工合成的费用很高，而且人为的突变LBD结构域的部分氨基酸进而合成相应的短肽用于后期的研究，盲目性太强。通过建立突变体文库的方法进行大规模的筛选，对于高效地筛选以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库，其特征在于，LBD突变体文库的基本结构为SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质。
一种中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库的构建方法：
①设计扩增中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域保守氨基酸序列对应核苷酸序列的In-fusion引物(LBD_DF与LBD_DR)，并进行PCR扩增相应的核苷酸序列；
②设计扩增分泌表达载体pCT7-CHISP6H的In-fusion引物(V_LBDF与V_LBDR)，并进行PCR扩增相应的核苷酸序列；
③将步骤①的PCR扩增产物目的片段(LBD_DF/LBD_DR)和步骤(②)载体片段(V_LBDF/V_LBDR)利用In-fusion的方法构建重组表达质粒文库；
④将步骤③中的质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，构建SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质的中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库。
所述步骤④中大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
一种中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库的应用，所述文库在用于筛选以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽中的应用。
所述中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽可用于制备革兰氏阴性菌的抗菌类药物。
所述中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽可用于制备抗菌肽、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂。
本发明所具有的优点：本发明以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域保守氨基酸序列为基础，选取pCT7-CHISP6H为基础质粒构建中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库。同时分析了利用该文库进行抗菌活性多肽筛选的可行性，为高效的筛选以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽提供指导。
附图说明
图1为本发明实施例提供的PCR扩增LBD片段和pCT7-CHISP6H载体片段的实验结果。其中，M为D2000DNA Marker；1为pCT7-CHISP6H载体PCR扩增结果；2为LBD片段的PCR扩增结果。
图2为本发明实施例提供的随机检测30个克隆中23个阳性克隆核苷酸序列比较分析结果。
图3为本发明实施例提供的随机检测30个克隆中23个阳性克隆编码氨基酸的特征比较分析结果。
图4为本发明实施例提供的随机检测30个克隆中23个阳性克隆编码氨基酸等电点的比较分析结果。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
本发明方法包括以下步骤：
1)中国明对虾抗脂多糖因子LBD突变体文库基本结构的设计；
2)将步骤1)设计的结构利用In-fusion的方法与分泌性表达载体pCT7-CHISP6H进行连接，导入大肠杆菌DH5a感受态细胞，过夜培养后，挑取克隆构建突变体文库；
3)随机挑取步骤2)中的克隆，进行测序分析；并对测序结果为阳性的质粒转化表达宿主，检测其菌株生长情况，菌株不能正常生长的为高效的筛选以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽。
实施例1
中国明对虾抗脂多糖因子LBD突变体文库中基因编码蛋白的基本结构，如SEQ IDNO.1中氨基酸序列所示，
MKIQRLVALAAAVSLSIGLSGCAASA
该文库中插入基因的核苷酸序列如SEQ No.2所示，其5′端和3′端分别具有起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)。
ATGAAGATTCAACGACTTGTTGCCCTCGCGGCTGCGGTGTCACTGAGCATCGGGTTGAGCGGGTGCGCTGCCTCCGCC
其中，单下划线为编码信号肽的核苷酸序列，双下划线为编码6*His标签的核苷酸序列，波浪线为LBD结构域成熟肽对应的核苷酸序列(其中B代表A、T、G、C；D代表A、G、C)。
(a)序列特征：
●长度：171bp，其中有效长度1-171bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工设计合成
(f)特异性名称：gene
实施例2
1)中国明对虾抗脂多糖因子LBD突变体文库的构建
①设计扩增中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域保守氨基酸序列对应核苷酸序列的In-fusion引物(LBD_DF与LBD_DR)，并进行PCR扩增相应的核苷酸序列；
②设计扩增分泌表达载体pCT7-CHISP6H的In-fusion引物(V_LBDF与V_LBDR)，并进行PCR扩增相应的核苷酸序列；
③将步骤①的PCR扩增产物目的片段(LBD_DF/LBD_DR)和步骤②载体片段(V_LBDF/V_LBDR)利用In-fusion的方法构建重组表达质粒文库；
④将步骤③中的质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，构建中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域突变体文库。
具体为：
LBD_DF
CATCACCATTACTGCBGCTTCBACGTGBCACCGDAAB
LBD_DR
TGGGCACCACATGCGACCCCBGAB
V_LBDF
CGCATGTGGTGCCCATAGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGCT(下划线为与LBD_DF/LBD_DR扩增产物匹配的15bp序列)
V_LBDR
GCAGTAATGGTGATGGTGATGGTGGGCGGAGGCA(下划线为与LBD_DF/LBD_DR扩增产物匹配的15bp序列)
LBD片段扩增PCR反应体系为50μl，如下：
由于引物LBD_DF与LBD_DR的3’端有20bp的反向重复序列，故而在PCR反应过程中无需加入模板。
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
pCT7-CHISP6H载体片段扩增PCR反应体系为50μl，如下：
PCR扩增程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，共32个循环；最后72℃延伸10min。
利用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分析(图1)，切胶回收与预测大小一致的片段，LBD片段大小为80bp左右，利用NanoDrop测定回收片段浓度(35ng/μl)；pCT7-CHISP6H的片段大小为2800bp左右，利用NanoDrop测定回收片段浓度(72ng/μl)。
根据
2)突变体文库质量检测
以T7-F/T7-ter(T7-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7-ter：5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCG-3’)为引物对，随机选择30个克隆利用PCR方法进行检测，结果发现30个克隆插入大小均与预测大小一致。将PCR检测阳性克隆经摇菌后进行DNA测序，对测序结果进行分析如下：①实际获得的阳性突变体为23个；②提前终止的有2个；③组氨酸标签移码的为1个；④具有组氨酸标签，而发生译码错误的有4个。获得的23个突变体核苷酸序列多重比对结果如图2所示，其对应编码氨基酸序列比对结果如图3所示。进一步对获得的突变体编码蛋白的pI进行预测，结果显示突变体的等电点介于9.42至10.55之 间，如图4所示。
3)文库质粒的诱导表达和检测
抽提测序结果正确的23个阳性克隆质粒(具体序列如图2所示)，分别转化BL21(DE3)pLysS中，利用24孔细胞培养板，37℃条件下，在含有100μg/mL氨苄青霉素的1mL LB液体培养基中摇菌(如表1所示)，24h后仅有5个孔中的LB液体培养基变浑浊，其他孔中的LB液体培养基非常清澈，说明筛选到的23个克隆有18个具有抑制大肠杆菌生长作用。
通过构建该突变体文库以及对文库中随机30个克隆进行质量检测，筛选到了18个具有抑制大肠杆菌生长作用的突变体。利用该突变体文库，筛选以中国明对虾抗脂多糖因子LBD结构域为基本骨架的抗菌活性多肽比例达到18/30＝60％。
表1初筛23个阳性克隆在24孔板中的分布情况
