对T细胞表位进行优化的方法及由此制备的肽文库的组合物
技术领域
本发明涉及对T细胞表位进行优化的方法，以及通过该方法制备的肽文库的组合物，尤其涉及牛的基于表位的组合式口蹄疫疫苗。
背景技术
口蹄疫病毒(FMDV)属于一种急性、高度传染性的病毒，会感染驯养的偶蹄反刍动物，从而对易感动物与动物产品的国际自由贸易产生严重的影响。可以通过直接屠宰染病的动物或是以定期接种疫苗的方式对FMDV加以控制。其中，对于感染、恢复和口蹄疫易感动物进行屠宰是公认最优选的方法。
接种疫苗的方式是目前对于大多数口蹄疫流行地区的一种成熟且容易控制疫情的方式，利用这种方法除了具有成本效益外，也可达到医疗防疫的功效。特别是对于亚洲、中东和拉丁美洲等发展中或不发达国家，这些国家口蹄疫的疫情发生频率较高，其政府在确保其动物性食品的安全性与供给源不短缺的条件下，要求对易感染的驯养牲畜事先进行更多的常规FMDV疫苗接种。根据目前疫苗市场规模的统计，仅在中国，口蹄疫疫苗市场预计从2015年至2020年可增加约26.3％的销售金额，同时对于口蹄疫病毒，目前疫苗生产设施方面也必须符合国际兽疫局(OIE)的要求。
传统疫苗生产通常在悬浮液或在单层细胞中培养、浓缩、部分纯化病毒，并利用乙烯亚胺灭活病毒并与佐剂混合。由此制得的传统灭活疫苗已被证明能有效预防口蹄疫，但在大规模工业化生产过程中，因为不完全反应或活病毒污染等操作失误，使得传统疫苗的生产过程存在发生污染与扩散的风险。
口蹄疫疫苗的接种策略包括使用各流行病毒株分别接种，以防止不同血清型的病毒株再度感染动物。口蹄疫病毒可分为七大类免疫血清型，分别为O、A、C、SAT1(南非1型)、SAT2、SAT3和Asia 1(亚洲1型)，上述七大类免疫血清型还可细分为包括超过65种的亚型，其中有许多抗原性变异已经被确定。此外，在各个血清型中存在一些亚型，针对该血清型的传统疫苗无法提供针对个别亚型的充分保护，由此在目前单一传统疫苗的接种情况之下难以对口蹄疫进行全面控制。因此，现阶段在开发替代性的疫苗设计策略。例如已有合成疫苗的报导，但距离广范利用合成肽疫苗取代传统疫苗，在口蹄疫病情流行的国家根除口蹄疫的希望尚存距离。
基于表位的疫苗(epitope-based vaccine，EV)是一种安全、廉价的疫苗生产策略，利用这种方式所生产的疫苗易于运输、储存与接种，兼具许多其它的优点，包括能够诱导广泛的防护作用，快速的疫苗接种方式，以及提供长期的保护性免疫应答。有报道称基于表位的疫苗的设计可成功地针对多种血清型和亚型。基于表位的疫苗所面临的主要挑战在于它们源自病原体广泛变化的基因组，并且在被保护动物的免疫系统中，对于多样性表位抗原的选择，必须通过优化的过程，才能确保在一个族群的动物中都能产生强而有效的免疫应答。
根据对基于表位的免疫的认知，已经开发了针对口蹄疫病毒的B和T细胞表位的合成嵌合肽。口蹄疫病毒的早期研究确定了口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1上的主要抗原性位点之一，即暴露在表面的G-H环(氨基酸位置140至160)，其为主要的B细胞表位。而T细胞表位与主要组织兼容性复合体(MHC)分子(在牛中也被称为牛白细胞抗原(BoLA))形成具有足够亲和力的特异性结合，是引发特异于病原体的有效的适应性免疫应答所必需的。
然而基于表位的疫苗的良好设计仅通过加入T细胞表位并不足够，所选择的肽应有效覆盖整个物种的族群，并且该T细胞表位必须同时与牛上的各种MHC等位基因产生良好的相互作用。鉴于此，必须进一步阐明BoLA-DR基因的多态性对稳定的肽与MHCII分子结合，以及T细胞受体对MHC结合肽的识别的影响。
现有技术中有多种T抗原表位预测工具，但其均存在各自问题。
第一种工具是抗原表位数据库。
关于抗原表位研究，目前已有超过20万项实验资料发表。其中免疫表位数据库(Immune Epitope Database，IEDB)耗时四年时间搜集九成以上的相关文献，为该领域最具代表性的数据库之一(Vita,Zarebski et al.2010)。IEDB将抗原表位依据实验的实证结果，分类为B细胞抗原表位、T细胞抗原表位或可与MHC结合者，能辨识这些抗原表位的物种包括人类及猪、牛、羊、山羊等多种家畜。使用者可利用抗原表位结构、来源物种、MHC限制性、宿主物种等搜索条件，从该数据库查询各抗原表位的序列、实验方法等详细资料。IEDB资料完全对外开放，因此该数据库对于发展各物种与疾病的肽疫苗非常重要。
美中不足的是，IEDB多半仅知晓抗原表位的MHC限制性为MHC I类或MHC II类，但不知晓特定MHC等位基因是什么，缺少研发肽疫苗所需的这项重要信息。此外，IEDB收录的许多文献多是针对特定病原的蛋白质序列逐序合成并测试其抗原性，其中序列重复性极高，对肽疫苗研发者而言，需再通过额外方式剔除这些冗余的信息。
第二种工具是抗原表位对多态性MHC分子的结合预测。
如前所述，MHC分子的多态性残基多出现于结合抗原表位的口袋处，口袋的化学与容积特性随基因型而异，并对抗原表位的残基产生高度选择性。口袋的结合特异性可利用实验方式加以验证，例如合成各种氨基酸序列所组成的肽并测试其结合能力，藉此获得“口袋分布表”(Sturniolo,Bono et al.1999)。
目前口袋分布表资料最为齐全的是ProPred网络工具(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)。人类抗原呈递细胞所表现的MHC II分子大于90％比例由HLA-DR等位基因组成，且HLA-DR等位基因目前已知有100种以上。ProPred提供51种HLA-DR等位基因资料，该工具可用于计算任何氨基酸序列与这些MHC分子结合的可能性(Singh and Raghava 2001)。
ProPred的预测方式如下：从目标肽序列取得以九个连续性氨基酸组成的所有可能的肽框架，以这些肽框架作为结合至MHC II上的结合核心，并依据口袋分布表对框架中每个残基给予分数，换算得每个肽框架的总分。单一肽框架的总分大小与该段肽与MHC II的结合能力成正相关(Sturniolo,Bono et al.1999)。
尤须注意的是，MHC II结合小沟的P1、P2、P3较不具多态性；且P5和P8位置的抗原表位氨基酸侧链朝向T细胞受体端(TCR)，这两个结合口袋对肽结合能力的影响较小。整体而言，P4、P6、P7、P9的多态性对MHC分子与肽结合的特异性扮演关键角色。ProPred工具基于这项研究基础，其计算肽结合能力的口袋分布表偏重P4、P6、P7、P9，且完全排除P5和P8的影响性(Sturniolo,Bono et al.1999)。
透过口袋分布表的演算方式，虽可快速推算肽与特定MHC等位基因的结合能力，然而免疫细胞进行抗原呈递时，T细胞受体端与抗原肽表位的交互作用，仍是无法忽视的重要因素。因此如何一并纳入考虑是未来研发肽疫苗待克服的难题。
第三种工具是疏水性力矩计算。
T细胞抗原表位以α螺旋二级结构结合至MHC II小沟，且MHC II口袋P1、P4、P6、P7、P9偏好疏水性交互作用，故抗原表位α螺旋与MHC结合面多为疏水性残基，而与T细胞受体结合面则多为亲水性残基。换言之，抗原表位α螺旋的两亲性性质，使其形成朝向MHC结合面的平均疏水性力矩。故疫苗研发时，可以平均疏水性力矩作为评估T细胞抗原表位活性的重要参考要素。
HydroMCalc是计算平均疏水性力矩的网络工具。HydroMCalc可计算不同α螺旋构型，例如侧链夹角100°、111°、120°、160°、170°、180°等角度的平均疏水性力矩。该网站也提供不同疏水性数值供使用者选择，包含CCS数值、学者Kyte与Doolitle所发表的数值、学者Eisenberg所发表的数值(Eisenberg,Weiss et al.1982；Kyte and Doolittle 1982；Tossi 2002)。
研究指出，T细胞抗原表位的α螺旋呈递独特的扭曲结构使相邻残基间的侧链夹角呈递130°，侧链也藉此与MHC产生充分的交互作用。计算T细胞抗原表位的平均疏水性力矩无法使用HydroMCalc所提供的选项，肽疫苗研发者尚需自行研发相关工具。
鉴于现有技术中方法存在诸多缺陷，本发明试图建立优化候选肽的策略，通过生物大数据探勘(in silico)的方法进行T细胞表位筛选、MHCII分子三维模型建构、T细胞表位优化设计，合理的设计基于表位的疫苗的肽组合文库，在维持免疫结构抗原表位的同时，模拟跨族群的T细胞表位个体变异特性，以覆盖由于地域或种类差异及高度可变性免疫组织相容复合物的广泛范围，从而得到具有对口蹄疫病毒更有效的T细胞表位，并提供广泛保护力的肽疫苗。
发明内容
本发明具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种对T细胞表位进行优化的方法，包括以下步骤：
1)选择目标物种的适合的T细胞表位；
2)对目标物种的MHC-DR进行同源建模；以及
3)对所述T细胞表位进行优化。
在一个具体实施方案中，步骤1)包括以下步骤：
a.选择候选的目标物种的T细胞表位；
b.评估T细胞表位结合核心；以及
c.计算所述T细胞表位的疏水性力矩。
在另一个具体实施方案中，步骤2)包括以下步骤：
a.获取目标物种的MHC-DR的等位基因序列；
b.挑选人HLA-DR结构作为与T细胞表位结合核心匹配的模板；
c.序列比对和建模；以及
d.模型评估。
在另一个具体实施方案中，步骤3)包括以下步骤：
a.比较目标物种MHC-DR的MHC-肽复合体的口袋容积，确定MHC口袋分布；
b.T细胞表位优化；以及任选地
c.对T细胞表位优化进行评估。
在另一个具体实施方案中，步骤b包括以下一或多个步骤：
i.在所述T细胞表位结合核心的主要结合位置额外引入尺寸不同的氨基酸残基的复合取代以匹配不同的口袋；
ii.在所述T细胞表位结合核心的次要结合位置额外引入附加残基的复合取代以增加结合度；或者
iii.延伸肽疫苗上T细胞表位结合核心两端的肽长度以增加结合度。
在另一个具体实施方案中，将所述T细胞表位的长度设定为10-20个氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸，例如在所述T细胞表位结合核心序列的N末端和C末端分别还可包括一或多个额外的氨基酸，例如在N末端为额外的4个氨基酸，例如MDRF，或者在N末端为额外的8个氨基酸，例如VDFIMDRF，例如在C末端为额外的2个氨基酸，例如HV。
在另一个具体实施方案中，所述目标物种为人或偶蹄动物，例如牛、猪、羊。
在另一个具体实施方案中，所述目标物种为牛。
在另一个具体实施方案中，牛的T细胞表位结合核心序列为VKINSLSPT。
在另一个具体实施方案中，在所述牛的T细胞表位结合核心序列的第一位额外引入氨基酸残基F的复合取代，和/或在所述核心序列的第九位额外引入氨基酸残基I的复合取代。
在另一个具体实施方案中，在所述牛的T细胞表位结合核心序列的第二位额外引入氨基酸残基R的复合取代。
第二方面，本发明提供一种组合物，包含具有通式A-L-B的肽文库(library)，其中
A为包含T细胞表位的肽，所述T细胞表位经本发明的上述方法得到；
B为包含B细胞表位的肽；
L为任选存在的接头。
在一个具体实施方案中，所述T细胞表位包含长度为9个氨基酸的序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9。
在另一个具体实施方案中，X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列为INSLSP。
在另一个具体实施方案中，X1为V或F。
在另一个具体实施方案中，X9为T或I。
在另一个具体实施方案中，X2为K或R。
在另一个具体实施方案中，A的长度为10-20个氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸，例如在X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的N末端和C末端分别还可包括一或多个额外的氨基酸，例如在N末端为额外的4个氨基酸，例如MDRF，或者在N末端为额外的8个氨基酸，例如VDFIMDRF，例如在C末端为额外的2个氨基酸，例如HV。
在另一个具体实施方案中，B的氨基酸序列为VYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYFAIK。
在另一个具体实施方案中，L为εK。
本发明对T细胞表位进行优化的方法，是以下三个方面的特定组合，即目标物种(尤其是牛)T细胞表位肽特性条件的选择，建立目标物种的MHC多样性模型，利用目标物种的MHC多样性模型进行表位肽的优化。以上三个方面是三位一体缺一不可的。其中，对于MHC多样性模型的建立，其具有研发上的独特性，包括：建立模型实际计算袋口体积基因多型性的关系，藉此建立复合取代的策略。而优化方式又包括三个独特环节：核心序列第1与第9位的复合取代策略，核心序列第2位的R取代策略，核心序列两端延伸的策略。
由此设计并制备的基于表位的疫苗的肽组合文库一方面适于合成肽疫苗的工业化生产，另一方面免疫原性增加，其通过覆盖在给定目标族群的基因的多型性，同时有利于诱导在变体宿主免疫系统下演变的保护性免疫原性，从而提供广泛保护力。
附图说明
图1.牛的T细胞表位抗原的选择和设计策略图。图1A示出牛T细胞表位的生物大数据选择和设计工作流程。设计策略分为三个阶段，包括表位选择，同源建模(homology modelling)和T细胞表位优化设计。图1B示出螺旋状的肽在朝向MHCII的结合口袋的方向。MHCII的口袋中与细胞表位抗原肽结合位点，图示是以平面观察的方式来呈现人类MHC(HLA)(PDB代码:1D5M)，以蓝色显示该分子的表面，与流感病毒肽的肽主链相互交互作用的模式。肽的侧链显示为黄色，贴附在分子表面的周围。在底部则以逆时针方向来显示氨基酸的结合口袋的号码如下：1号位为缬氨酸(V)，3号位为异亮氨酸(I)，6号位为亮氨酸(L)，9号位为异亮氨酸(I)。图1C.以螺旋轮来代表两亲性肽的结合核心，所显示的序列来自人类MHC的晶体结构复合物中的表位，每个氨基酸残基之间的转动角约130度。T细胞表位的氨基酸残基1、3、6、9的侧链朝向在MHCII类结合裂口(cleft)底部显现的相应结合口袋。以红(1、3、6、9)、蓝(4、5、7、8)、深蓝(2)的彩色圆圈分别来指示疏水性、不带电的极性、带正电荷氨基酸残基。以箭头来指示根据Eisenberg的方法所计算的疏水性力矩(hydrophobic moment)(单位为μH)的大小和方向，疏水性力矩代表该在蛋白质立体结构中，氨基酸两亲性的α螺旋结构周期性的强度。
图2.BoLA-DRB3*0101肽结合位点中的口袋及口袋体积估算。图2A.BoLA-DRB3*0101肽结合位点的俯视图，该分子表面以灰色来显示(由ViewerLite4.2绘制完成)，细的线条显示周边的氨基酸残基。具有侧链的肽以棒状模型表示。图2B.容纳肽侧链的口袋4的详细的周围视图，P1、4、6、7和9根据其在肽上的距离进行标记。通过网格程序PocketPicker检测由BoLA-DRB3*0101和潜在结合位点诱导的包覆结构的形状，以灰度较深的球体来显示更大的含盖容积(buriedness)。网格探针表示紧贴蛋白表面之上，具有网格尺寸的矩形网格。
图3.130种牛的BoLA-DRB3等位基因的肽结合位的口袋体积与分布。图3A.根据BoLA-DRB3口袋的大小形状进行等位基因的分类，利用IPD数据库的数据作为最终确定的数目，可分类为20大类BoLA-DRB3，以及同源立体结构、与肽结合槽形成的口袋的体积。结合口袋的大小通过网格技术进行评估，就其埋入的网格探针由PocketPicker来计算网格探针的数目，一个网格探针定义为的立方体网格。结合口袋沿着沿着结合肽的方向编号，1、4、6、7、9分别如x轴所示。在y轴上以水平线显示网格探针的平均值。图3B.圆饼图显示图3A中对应的彩色点，其代表多态性残基的频率分布，呈现出IPD数据库所述的20类130BoLA-DRB3等位基因的口袋特异性分布。频率分布最高的三种以对应的彩色和数字标识，用于分布鉴定。图3C.Sturniolo et al.中所述氨基酸对各个BoLA-DRB3等位基因的相对亲和力，只显示在图3B中较高频率的分布。口袋1中，分布1比较倾向于芳香族氨基酸，而分布2偏爱脂肪族氨基酸。相对的结合值(Y轴)通过以下算法计算，用针对在由Sturniolo et al.中所记载的相同肽的位置的丙氨酸得到的实验数值(IC50)值对实验的IC50数据进行标准化。两个口袋1和9主要存在两种较大的分布差异，表现为在对应肽结合位点引入两种具有不同尺寸侧链的残基，因此在抗原呈递的多聚化肽设计策略中适合更多等位基因，以保护更多的多态性物种。
图4.BoLA-DRB3结合口袋2位置的立体结构与交互作用示意图。在肽抗原上的保守性氨基酸残基与MHCII类形成相互作用的氢键。图4A.与精氨酸(T细胞表位肽抗原的+2的位置)相互作用(小于的距离)的人类MHCII类和牛MHCII类的保守氨基酸残基是β57、β77、β78、β81和β82。β77的羧基氧与精氨酸的一个侧链氮形成氢键。丝带与棒为人类MHC的结构(PDB代码：1AQD)，实心棒为结合肽。点状棒则表示采同源建模方式构建，重叠在人类MHC结构上的BoLA-DRB3*0101的对应残基。图4B.来自免疫多态性数据库(IPD)的BoLA-DRB3中保守氨基酸残基出现频率。保守氨基酸残基来自参考等位基因BoLA-DRB3*0101。
图5.本发明中针对口蹄疫病毒设计的基于表位的疫苗的VP1Thcomb-FMDV-O1的氨基酸序列。细胞表位使用图示VP1Thcomb位点的组合文库。T细胞表位和VP1的G-H环区的B细胞表位之间通过ε-赖氨酸接头相连。表面暴露的RGD三肽以下划线突出显示。P1、P2和P9的位置分别代表对应于由ProPred Web服务器预测的MHCII结合口袋1、2、9的位置。
具体实施方式
本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
在详细描述本发明的示例性实施方案之前，对理解本发明很重要的术语给出定义。
如本文所用，通过T细胞表位“优化”得到对目标病毒更有效的T细胞表位，并由此提供具有广泛保护力的肽疫苗。所述“优化”具体是指对T细胞表位的氨基酸序列进行修饰或调整，从而在维持免疫结构抗原表位的同时，模拟跨族群的T细胞表位个体变异特性，以覆盖由于地域或种类差异及高度可变性免疫组织相容复合物的广泛范围。示例性的修饰或调整包括例如下文述及的复合取代、肽序列延伸等。
如本文所用，“广泛保护力”是指抗原肽具有和多种免疫组织兼容复合物结合的能力，且可活化T辅助细胞活性及促进B细胞生成抗原专一性抗体，达到预防病毒专一感染及根除病毒症状。
如本文所用，“结合核心序列”是指肽和免疫组织相容复合物结合的序列(由9个氨基酸组成，以X1到X9表示)。
如本文所用，“表位”又称为抗原决定簇，它是一组来自蛋白质抗原，并由免疫系统，确切地讲由例如抗体、B细胞、或T细胞特异性识别的抗原部分。
如本文所用，“T细胞表位”是指是指以合理的效率结合MHC II类分子或能够通过在MHC II类上呈递来刺激T细胞的特定肽序列。
如本文所用，“B细胞表位”是指被B细胞识别的肽序列。用于与本发明的T细胞表位组合的B细胞表位是具有中和作用的B细胞表位。本领域技术人员可以通过本领域的常规技术手段设计针对特定物种或病毒的B细胞表位。例如针对口蹄疫病毒的B细胞表位可参见Pfaff,E.et al.Analysis of neutralizing epitopes on foot-and-mouth disease virus.J Virol 62,2033-2040(1988).以及Taboga,O.et al.A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease:lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants.J Virol 71,2606-2614(1997)，本领域技术人员可以通过本领域的常规技术手段对其进行适当调整。
如本文所用，“接头”是指具有一定长度的氨基酸组成的多肽，其可以使所连接的融合多肽中各部分充分展开，互不干扰。在本发明中，T细胞表位和B细胞表位任选通过接头从结构上区分开来，从而在实际免疫作用下彼此分开。本领域技术人员能够理解，本领域的常规接头均可用于本发明，包括但不限于，例如本发明所使用的εK，其在与相邻氨基酸的羧基形成共价键时使用的是赖氨酸ε-碳上的氨基。
如本文所用，“基于表位的疫苗”是指用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗，包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinant epitope-based vaccine)及表位核酸疫苗。
如本文所用，“主要组织兼容性复合体”即“MHC”是在大多数脊椎动物中发现的编码MHC分子的一个大的基因组区或基因家族，这些MHC分子将被加工的蛋白质的片段或表位展示在细胞表面上。
在免疫系统中，MHC能与细胞内的外来肽片段结合，并呈递于细胞表面，供T细胞或自然杀伤细胞辨识而启动免疫反应。MHC一般可分为两类：MHC I类及MHC II类，其中MHC I类存在于所有有核的细胞表面上，主要呈递细胞质中的肽片段供杀伤T细胞辨识；而MHC II类主要存在于巨噬细胞或树突细胞等抗原呈递细胞(APC)表面上，将内体或溶酶体内的外源性肽片段呈递给辅助型T细胞(Th)，启动Th1相关的细胞免疫反应或Th2相关的体液免疫反应，包括B细胞的分化、诱导抗体类型的转换、促进B细胞释放抗体等。MHC I类及MHC II类分子在细胞内生产过量，细胞一旦感染病原体，病原体在细胞内的液胞中增殖，或病原体的蛋白质被B细胞所吞入时，这些病原体蛋白质所衍生的肽可轻易的遇到为数众多、未与肽结合的MHC II类分子并与之结合，T细胞便可认识位于细胞表面组合形成的配体。
MHC I与MHC II均为异二聚体，其中MHC I由一条构成α1、α2及α3结构域的跨膜重链，加上β2微球蛋白所构成；MHC II则由两条跨膜的α及β链所构成，各别包含α1、α2结构域及β1、β2结构域。MHC I的肽结合小沟由α1及α2结构域所组成，而因结合小沟两端有芳香族氨基酸的阻挡，因此限制了与其结合的肽的长度，约为8至10个氨基酸。MHC II的肽结合小沟则由α1及β1结构域所组成，因两端开放，因此可与长约20个氨基酸的肽结合。
人类主要组织兼容性复合体第II类由人类白细胞抗原(HLA)HLA-DR、HLA-DM、HLA-DQ及HLA-DP所组成，其中仅有HLA-DR及HLA-DQ为细胞表面受体。HLA-DR的晶体结构显示其结合小沟内具有口袋可容纳抗原肽的侧链，因HLA-DR具有高度的多态性，而多态性的氨基酸经常是构成口袋的部分，因此不同等位基因间的口袋可能具有不同的物理及化学性质，而对于抗原肽侧链的结合力产生不等的影响。
猪免疫反应及疫苗相关最重要的基因为猪主要组织兼容性复合体，即猪白细胞抗原(SLA)。而猪MHC II中，仅有与HLA-DR及HLA-DQ具有高度同源性的细胞表面受体SLA-DR及SLA-DQ3，且SLA-DR具有较大程度表现。
牛免疫反应及疫苗相关最重要的基因为牛主要组织兼容性复合体，即牛白细胞抗原(BoLA)。而牛MHC II中，仅有与HLA-DR及HLA-DQ具有高度同源性的细胞表面受体BoLA-DR及BoLA-DQ3，且BoLA-DR具有较大程度表现。
人类与牛的DR多态性主要来自于构成β链的DRB基因，且两物种间的氨基酸多态性位置大部分皆相同，特别是在构成结合小沟的特定位置。牛的DRA在α1结构域仅有两个多态性位置，然而大部分的物种在该结构域不具多态性。与MHC II结合的肽通常长度不固定，但其中有9个氨基酸的肽结合核心可对应于MHC II的结合小沟与其口袋，而其第1及第9个位置为抗原肽的典型锚定位置。MHC II上的主要口袋有P1、P4、P6、P7及P9，对应于肽结合核心的相对残基位置，其中P1对于肽与MHC II的稳定结合甚为重要。
抗原肽以两种类型的作用与结合小沟结合，一种为肽骨干与小沟周边的保守残基所形成约12至15处的氢键；另一种为肽的侧链与MHC II口袋之间的结合力。Sturniolo等人提出了利用构成口袋的多样性残基进行分类，将相同残基组成的口袋归类于具有相似物理化学性质及结合偏好的相同分布表(profile)，并以实验建立多种分布表对于不同抗原残基的结合力数据资料。本发明人发现，P1口袋在多数的MHC II(如人类的HLA-DR或鼠科的I-E)中偏好脂肪族或芳香族残基，并考虑基于此对抗原表位进行优化。
另外，本发明人发现，若抗原肽在P2位置为精氨酸，则能提升肽与HLA中DRB1*0101、DRB1*0401以及DRB1*1101的结合力；据晶体结构显示，其结合力应来自于精氨酸侧链末端的氮原子与MHC结合小沟外缘的Thrβ77的羰基氧所形成氢键。
此外，在肽的结合核心序列之外所延伸的肽侧翼残基(PFR)也能与MHC分子上的保守残基形成氢键，并增加肽与MHC的结合。本发明包含T细胞表位结合核心序列的抗原肽长度以10-20个氨基酸为宜，对于核心序列N末端和C末端的氨基酸残基种类没有特殊要求，本领域技术人员可以基于合成肽中的工艺需求，选择任意适合的氨基酸残基。并且在N末端或C末端各自的氨基酸残基数量对于肽结合力并无明显影响。
如本文所用，“结合口袋”是指因其形状而顺利地与另一个化学实体相结合的分子或分子复合物的区域。术语“口袋”包括但不限于裂缝、通道或位点。结合口袋的形状可以在结合化学实体前大体上预形成，可以在与化学实体结合的同时形成，或者可以通过另一个化学实体与该分子的不同的结合口袋结合而形成，这又导致该结合口袋形状的改变。
如本文所用，“主要结合位置”是指对抗原与MHC结合口袋结合能力影响较大的抗原表位结合核心上的位点。例如在本发明中，P1和P9口袋对抗原和MHC的结合影响最大，可视为主要结合位置。
如本文所用，“次要结合位置”是指对抗原与MHC结合口袋结合能力影响较小的抗原表位结合核心上的位点。例如在本发明中，P2口袋对抗原和MHC的结合也有影响，但影响较小，可视为次要结合位置。
如本文所用，“复合取代”是指在原有天然序列仍然存在的情况下，额外引入针对特定位点氨基酸残基的取代，由此得到的肽是多种具有不同序列的肽文库，所述肽文库使得抗原表位具有多重性。
以本发明经优化的T抗原表位为例，在其9个氨基酸的天然核心序列的第1、2、9位分别进行“复合取代”意味着对第1、2、9位的氨基酸残基分别进行一种取代，由此得到的肽在第1、2、9位的氨基酸残基分别存在两种可能，在进行肽合成时，最终产生2×2×2＝8种不同的肽的文库。原有天然序列仍包含在其中，并且与其他几种肽基本上等比例存在。
如本文所用，“多态性”是指MHC在不同个体之间的基因多型性。
如本文所用，“混合辨识(promiscuous recognition)”是指由于MHC的多态性，多种不同的MHC等位基因能够辨识并与同一种肽结合。
如本文所用，“疏水性力矩(hydrophobic moment)”是以疏水作用的大小和方向对肽性质的描述。每个氨基酸有其固定的物理性质，肽疫苗与MHC结合作用的强弱除了取决于P1到P9对应位置上各个关键性氨基酸的性质之外，还取决于9个氨基酸的整体评估，即其总和。“力矩”具有本领域通常的概念，其包含大小以及方向两项内容。以本发明选取的肽为例，其疏水性力矩大小设定为大于3，并且方向朝向MHC的袋口方向,才有作用。
基于本发明的方法设计得到的基于表位的疫苗利用合成的方式来生产，具有显着节约成本的优点，并能够通过实验设计，基于预测的表位肽库进行病毒基因组筛选。通过计算机预测与模拟，并通过实际肽疫苗的合成执行情况，以确定优化的流程，可以达到畜牧生产企业的规模。目前另有其它测试的物种，通过同样的生物大数据探勘分析程序，建立独立的特定免疫应答分子HLA的子集。
另外，化学合成方式的疫苗生产除了可以避免在生产过程中的感染外，还具有生产与构建相对容易，生产的疫苗化学稳定性高等优点，是理想的疫苗生产方式之一。大多数传统的疫苗针对引起急性或是自限性感染的病毒，随后持久免疫有效。迄今为止，合成疫苗被认为是次优的生产方式，因为它们少了对于T细胞表位多样性的考虑。本发明设计的基于表位的组合疫苗的一个重要改进是免疫原性的增加，其通过覆盖在给定目标族群的基因的多型性，同时有利于诱导在变体宿主免疫系统下演变的保护性免疫原性。配置和血清学特性之间的这种相关性意味着这样的结构分析对阐明基于表位的疫苗设计是有价值的，最终可产生具有特定抗原特性的分子设计。
随着用于MHCII锚定设计的组合肽库的可用性的增加，对于牛MHCII类表位识别过程的结构性、分子性和生物学基础的阐明，以及组合基于表位的疫苗的合理设计复杂性的增加，会潜在导致理想的肽疫苗活性的提升，使得这样的方式更具生产成本优势，并且也可以使通过扑杀控制口蹄疫的需求最小化。更一般地，设计的基于表位的疫苗可能提供疫苗开发的潜在途径，其不仅针对口蹄疫病毒，还可针对不同物种的许多其它病原体。
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例和图不应理解为限制性的。本领域技术人员能够清楚地设想本文列出的原理的进一步的修改。
实施例：
实施例1、T抗原表位的选择
口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1上突出的G-H环(包括暴露在表面的高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽)已被确定为口蹄疫病毒中和抗体(NA)针对的主要的B细胞表位。然而，单独施用G-H环合成肽导致有限的中和抗体诱导或无效的保护，主要的原因是缺乏被牛和猪的MHC等位基因混合辨识的T细胞表位。
为此，本发明涉及牛T细胞表位的基于生物大数据的选择和设计方法，其工作流程如图1A所示。设计策略分为三个阶段，包括表位选择、同源建模和T细胞表位优化设计。
首先进行T细胞表位的选择，包括以下步骤：
1)选择候选的牛T细胞表位。该步骤在IEDB数据库(www.iedb.org/)中进行，利用IEDB中的T细胞应答与MHCII配体结合分析工具，预测与MHCII结合的T细胞表位，并通过IEDB工具查询符合算法的等位基因上的特异性。
2)评估T细胞表位上的结合核心。该步骤利用ProPred分析工具进行，其利用人类51个分属于九个血清学人类白细胞抗原(HLA-DR)等位基因，分析所述T细胞表位的结合核心与HLA-DR等位基因的结合力。经预测与6种以上不同的HLA-DR等位基因结合的肽被认为是混合式(promiscuous)的肽。
3)T细胞表位的疏水性力矩计算。利用EMBOSS分析工具，基于旋转轮的方式根据Eisenberg的疏水性数值来计算两性疏水性力矩的大小。挑选疏水性力矩与垂直线夹45度角内且平均疏水性力矩数值大于0.3的抗原肽，作为适合本发明的目标抗原肽。
对选定的目标VP1Th肽进行调查，所述调查在一组来自牛群体的有效的抗原表位的Th细胞肽上进行，以支持功能性表位疫苗的设计。表1示出的是经筛选确定的最有可能的一段抗原表位，即口蹄疫病毒VP1蛋白第32至50位氨基酸。使用一系列测定对VP1Th肽的免疫原性特征进行评价，这包含1个T细胞应答、6个B细胞应答和3个MHC配体结合测定，其在IEDB数据库中被分别记录为表位ID 27470和31373。有效的MHCII结合的肽在螺旋的对侧必须具有含疏水和亲水区的强螺旋结构(图1B)。
表1.本发明中用于牛的基于表位的疫苗设计的所选代表性肽及其抗原性
a.FMDV病毒衣壳蛋白VP1，Genbank蛋白登录号：AHY00720。
b.根据Eisenberg的方法计算得到的两性分子螺旋轮大于0.3疏水性力矩(mH)。
c.服务器可以预测肽与51种HLA-DR等位基因的结合。
d.作为独特的主标识符的肽ID和来自不同类别测定的结果用于IEDB数据库(v.2.13.1)中90％比对同源性的线性表位检索。
e.通过ProPred网站服务器预测的长为9个氨基酸的混杂T细胞表位的核心(下划线)。
通过螺旋轮分析计算确定VP1Th的核心表位，其疏水性力矩为0.326(图1C)。此外，使用ProPred web服务可以分析等位基因群的覆盖率，结果显示，表1所示VP1Th肽能结合12种HLA-DR等位基因。值得注意的是，VP1Th肽的两个元分析已证实来自不同的线性表位序列的T细胞的结合活性。
实施例2、BoLA-DRB3同源建模
牛BoLA-DRB3同源建模目的在于建立表位抗原肽VP1Th和BoLA-DRB3分子的三维模型，作为后续抗原肽优化步骤的参考依据。所述同源建模包括以下步骤：
1)获取牛的BoLA-DRB3等位基因序列。该步骤在免疫多态数据库(Immuno Polymorphism Database，IPD)中进行，结果包含13条α链和130条β链。
2)模板筛选。从PDB(Protein Data Bank)数据库中挑选人HLA-DR结构(PDB代码：1D5M，α链和β链)作为模板，以便与来自口蹄疫病毒VP1蛋白的9个氨基酸的肽(PDB代码：1ZBA，1链，如表1右栏下划线所示)进行匹配。前者可以理解为锁孔，而后者可以理解为对应的钥匙。
3)序列比对和建模。利用MoldellerTM模块，对于程序设置为结构差异之间作为初始模型，并通过利用立方差的方式全面优化模型。我们通过基于Lamarchian遗传算法的受体-配体对接模拟软件，即AUTODOCK(4.2版本)预测表位肽与大分子BoLA-DRB3蛋白的结合自由能。
4)模型评估。为了选择较佳模型，使用SWISS-MODEL中的ANOLEA和PROCHECK，保持默认分析参数，分别评价局部模型质量和立体化学包装质量。经过评估后，具有较高的结合能的模型被选择为最佳的模拟模型。
实施例3、T细胞表位优化
接下来进行T细胞表位优化，包括以下几个步骤：
1)比较BoLA-DRB3的MHC-肽复合体的口袋容积，确定MHC口袋分布。
BoLA-DRB3基因座是高度多态性(polymorphic)的，并在牛异二聚体MHCII分子中研究的最为透彻。这些分子均由α-链和β-链两条蛋白链组成，BoLA-DRA编码序列是单基因，BoLA-DRB3基因有超过130个已鉴定的等位基因。
MHCII肽结合沟具有各种化学性质不同的结合口袋(简称为口袋1-9，即P1-9)。如表2所示，来自BOLA-DRB3等位基因的结合口袋1、4、6、7和9上的大多数多态残基是由与多个BOLA-DRB3序列匹配的β-链形成。牛MHCII-肽复合物的20种建模结构有利于鉴定具有类似的结构特征和/或肽的特异性的等位基因，因为MHCII等位基因变体通常结合不同组的表位肽(表2)。
表2.不依赖于口袋分布的BoLA-DRB3等位基因导致广泛的DR结合裂口特异性。
#基于Sturniolo et al.的多态残基位置，来自BoLA-DRB3等位基因的结合口袋1,4,6,7和9主要由DRβ链多态残基形成，负责BoLA-DRB3-配体相互作用的残基如上表所示。
从IPD-MHC数据库获取的BoLA-DRB3β链等位基因总共有130条序列，α链则选择BoLA-DRB3*0101。将BoLA-DRB3序列与三维结构模型进行多重比对，使多态的适合残基与给定口袋关联。然后，根据其多肽残基组成对结合口袋进行分类；由此，由相同的残基构成的来自不同等位基因的口袋分布被视为是相同的。
表3是BoLA-DRB3的口袋分布，展示了20条BolA-DRB3等位基因根据其分类，分配给原来的130条BoLA-DRB3等位基因的口袋。在不同的等位基因上共享相同的多态残基的口袋表现出类似的口袋特异性分布。
表3.使用指定口袋构建BoLA-DRB3病毒口袋分布矩阵
所选BoLA-DRB3等位基因表示这些等位基因用于通过同源建模构建3D结构。
根据表2中所示BoLA-DRB3裂口的模块结构组装虚拟的BoLA-DRB3矩阵。口袋1,4,6,7和9的分布来自IPD-MHC数据库。对于相对的肽位置1，只有脂肪族(Ile,Leu,Met,Val)和芳香族(Phe,Trp,Tyr)氨基酸可匹配由β86残基组成的BoLA-DRB3口袋1。第1个数字代表该等位基因在β86位置是否具有Gly(＝1)或Val(＝2)或Met(-3)(参见表2)。第2个数字代表口袋4分布的鉴定数字。第三、四、五个数字分布代表口袋6、7和9分布的鉴定数字。
为了分析BOLA-DRB3的结合口袋分布和它们的结合口袋的几何形状之间的关系，我们使用了PocketPicker算法，将潜在的结合口袋的形状和含盖容积(buriedness)转换成自相关向量。在立方网格内的一格被定义的体积(图2)。
各种BoLA-DRB3等位基因的结合口袋与邻近的MHC残基具有不同的静电互补性和大小。X射线晶体学研究表明，HLA-DR结合沟包括口袋和肽配体的特定氨基酸侧链，其优先与沟中的MHCII分子相互作用。图3A-3B呈现从20个代表性的BOLA-DRB3模型提取的几组口袋的平均口袋大小和含盖容积。结合口袋由T细胞表位的氨基酸侧链以依赖口袋的体积和MHCII分子的含盖容积的方式所占据。例如，20个所选模型中最大的口袋1来自成为未被占用腔室的130个BoLA-DRB3等位基因，具有的大范围的含盖容积，其次是口袋9(图3A，3B)。通常，常规氨基酸含盖侧链的平均体积是(甘氨酸)和(色氨酸)。基于此，将P1和P9处结合的氨基酸确定为优选锚定残基，优选对锚定残基进行优化，从而在跨族群的基于表位的疫苗设计中改善T细胞表位和不同BOLA-DRB3等位基因中的MHCII分子之间的相互作用。经所述优化的肽疫苗可以让多数的牛都发生免疫应答。此外，计算对应氨基酸与四个显示更高频率分布的独立结合口袋(包括口袋4，6，7和9)的相对亲和力，其代表了大多数牛BoLA-DRB3肽的结合特异性(图3C)。但由于太多处的优化不适宜肽的合成，所以本发明优选并未在P4、6、7处进行优化。
2)表位优化(enhancement)。
该步骤又包括以下几个分步骤：
①在表位结合核心的主要结合位置引入氨基酸残基以匹配不同的口袋。
结合口袋对于表位和MHCII分子之间的亲合性是必需的，结合口袋的多态性最有可能影响T细胞应答。总体而言，通过取代天然序列中较弱的主要MHCII锚定残基，对T表位肽的不同锚定残基进行优化修饰，以获得最佳的肽疫苗。
Agudelo等人的报道指出，MHC和抗原肽结合的口袋特性会影响抗原肽结合的能力，其中以P1口袋对抗原肽和MHC的结合影响最大，其次为P9口袋，而P4及P7随后。
基于上述分析也可知，BOLA-DRB3模型的P1和P9含盖容积差异较大，为了使最终的基于表位的疫苗具有广泛的覆盖度，针对对结合能量贡献显着的P1和P9对应的锚定残基进行优化，引入两种具有不同尺寸侧链的特定氨基酸残基，即苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)，以匹配不同的牛MHCII等位基因的P1和P9，这是组合的表位抗原肽在不同的牛MHCII等位基因的P1和P9的有效结合所需的(图3C)。
②在表位结合核心的次要结合位置引入附加残基。
结合肽中横跨结合裂口的口袋2(P2)处的附加的锚定残基可增加结合度，使其抗原肽疫苗更紧密结合MHCII分子。根据三维模型的分析，所接触的MHCII分子上的残基为β57和β77-β82，如在图4A中所展示，其与MHCII-肽复合物模型中的主链氧形成氢键。这些针对P2锚定位置的接触残基Asp57、Thr77、Tyr78、His81和Asn82也分别确定了130个BoLA-DRB3等位基因中80、94、86、121和130的高度频率(图4B)。在T细胞表位的结合核心锚定位置P2的次优残基的优化可以增加牛MHCII分子的结合亲和力。本发明中，在表位结合核心对应P2的次要结合位置引入附加残基精氨酸。
③延伸肽疫苗上T细胞表位结合核心区域两端的肽长度。
MHCII肽结合沟对于T细胞表位结合的开放(open-ended)性质可允许范围广泛的肽长度。来自Chang等人的数据证明，15个氨基酸长度的T细胞表位是最常见的与BoLA等位基因之间形成相互作用的长度。因此为稳定地与MHCII分子相互作用，设计的抗原肽疫苗在N-末端和C-末端分别延伸4个和2个氨基酸，以增加牛MHCII分子亲和力。
3)优化表位评估。使用ProPredTM和螺旋轮(Helical wheels)评估设计的肽。
实施例4、表位疫苗肽的合成及验证
针对原始肽VP1Th的组合肽库，通过利用IEDB资料库资源，以及对原先的VP1Th的肽链进行实质表位核心的识别与优化，得到本发明优选的基于表位的疫苗VP1Thcomb(图5)，其为肽文库。
使用Applied Biosystems Peptide Synthesiser Model进行VP1Thcomb-FMDV-O1表位疫苗组合肽库(图5)的合成。所述表位疫苗通过在指定的氨基酸位置提供期望的氨基酸混合物而制备。合成完毕的肽从固体支持物上裂解，并用90％三氟乙酸除去侧链保护基。通过基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪和反相HPLC验证制备的合成肽组成正确。通过尺寸排阻色谱对疫苗的组合肽进行验证，以确保90％的积分面积的超过质量阈值极限值；并通过Edman降解法进行N-末端氨基酸分析。
实施例5、基于表位的疫苗对于口蹄疫病毒的效价
直接在接种疫苗的动物中进行疫苗效力评估，进行PD50值测试来评估由OIE参考实验室描述的基于表位的疫苗的效力。5-6个月大的牛被分为1ml全剂量、1/3剂量和1/9剂量三组。每只动物通过耳边注射接种一次基于表位的疫苗，所述基于表位的疫苗与Montanide ISA 51佐剂的比例为1:1(体积/体积)。此外，两只牛接种作为阴性对照的无菌PBS缓冲液。所有的牛在免疫接种28天后，用10000BID50(50％牛传染性剂量)的血清型Asia 1/O通过皮下注射进行攻击。
所有的实验牛(约6个月大的荷斯坦公牛)从经过认证的供应商处获得。在整个研究期间每天监测动物，包括体温、嘴的症状，并连续喂食十天，计算牛PD50(50％保护剂量)值。在整个实验中没有动物死亡或因病重无法完成整个实验，并且在完成疫苗评估前未对任何动物进行安乐死。攻击实验结束后10天，对动物进行安乐死。通过Reed-MUENCH方法计算牛PD50值。所有涉及使用牛组织样本和接种方案的实验经生物样本委员会的机构审查批准。
结果证实，单剂量接种的VP1Thcomb肽疫苗在后三周，针对口蹄疫病毒血清型Asia 1和O的效价分别达到12.51和8.06的PD50(表4)。国际规定紧急疫苗通常需要具有PD50为6的最小效力，而预防用途的疫苗通常需要具有PD50为3的最小效力。本发明的动物实验研究说明，在10000BID50剂量的攻击下，VP1Thcomb肽疫苗对口蹄疫病毒更为有效，其中对血清型Asia 1比对血清型O更有效。说明通过优化设计的基于表位的疫苗的效价确实有了大幅的提高(表4)。
表4.评价本发明基于表位的疫苗在牛中产生的免疫应答和保护
a.接种后28天，通过在舌头上表面皮内注射0.2ml含有10,000BID50(50％牛感染剂量)的FMDV对接种动物和2只未接种牛的对照组进行攻击。
b.经临床检测，观察期间(攻击后10天)四蹄均未见损伤的牛确定为获得保护。保护率(％)＝无损伤牛数量/牛的总数。
c.通过Reed-Muench方法计算口蹄疫疫苗效力测试PD50(50％保护剂量)。
实施例6、口蹄疫病毒特异性病毒的中和测试(VNT)
根据OIE协会手册(第2.1.5章)中描述的程序进行口蹄疫病毒的病毒中和测试(VNT)。简言之，在牛脖子上的肌肉层中进行肌内接种，分别在疫苗接种后的第7、14、21、28天收集牛血清。来自测试动物的血清均在56℃灭活30分钟。来自10只6个月大的牛的血清在96孔平底板中于37℃添加1×104TCID50Asia 1型(6个)和O型(4个)口蹄疫病毒(表5)，温育90分钟。温育后，将50μl位于DMEM培养基(含有5％胎牛血清)中的3×104BHK21细胞悬浮液加入到每个板中，于37℃、5％CO2下培养48小时。然后在显微镜下观察病毒的细胞病变效应。效价用孔内50％的细胞得到保护时血清/病毒混合物中存在的血清的最终稀释度表示。阳性标准血清是其预期效价的两倍以内。
表5.接种后针对Asia 1/O FMDV的FMDV特异性中和抗体应答。
a.50μl单位体积病毒悬液中的攻击剂量应包含约100TCID50(50％组织培养感染量)，在颈部经肌内注射。
b.FMDV特异性抗体效价以接种100mg/ml的肽疫苗并攻击28天后的牛的病毒中和测试中的血清稀释度表示。
c.Dpv：接种后天数
d.免疫接种后28天对动物进行攻击，并对所有动物进行临床检查，如果脚上未出现损伤，则确定为获得保护。通常，血清/病毒混合物中1/45或更高的最终血清稀释的效价视为阳性。低于1/16的效价被视为阴性。基于国际商贸的单个动物认证，1/16至1/32的效价被视为存疑，并需对血清样品做进一步测试。
结果表明，针对两种病毒株的特异性抗体水平在接种后28天仍可维持高达1/45的稀释度。整个实验也仅有两只受试动物(#13549和#13539)在表位疫苗注射的长时间后并未检测出特异性抗体水平，可以看到在血清型Asia 1攻击后28天的稀释度为1/32(表5)。然而，对于口蹄疫病毒在接种牛之间传播的量化，接种后7至28天，针对Asia 1的大多数VNT效价比针对O的效价低，但单次表位疫苗接种足以防止血清型Asia 1和O病毒在牛群中的传播(表4)。
