一种高效的全基因组染色质构象技术eHi‑C
技术领域
本发明涉及基因组测序技术领域，具体涉及一种高效的全基因组染色质构象技术eHi-C。
背景技术
三维(3D)基因组学是研究基因组三维空间结构及其功能的学科。具体是指对基因组序列、基因结构及其调控元件、基因组序列在细胞核内的三维空间结构及其对基因转录、复制、修复和调控等生物过程中的功能进行研究。三维基因组的相关测序技术，目前主要有Job Dekker研发的Hi-C(High-throughput /resolution chromosome conformationcapture)和阮一骏教授研发的ChIA-PET(Chromatin Interaction Analysis withPaired-End Tag Sequencing)技术(李国亮,阮一骏，2014，科学通报)。
Hi-C技术是以高通量测序为基础，全基因组范围所有特异和非特异的染色质相互作用捕获技术。利用高通量测序技术，结合生物信息学分析方法，可以研究获得全基因组范围内染色质一维互作连接图、二维相互作用频率热图、全基因组染色质相互作用调控网络和三维结构可视化信息(ErezLieberman-Aiden,2009,Science；Luca Giorgetti,2016,Nature)，能进行基因组单体型分析(Jan O Korbel，2013，Nature Biotechnology)和辅助基因组组装(Joshua N Burton et al,2013,Nature Biotechnology)，还能揭示较大的核染色质区间(真染色质和异染色质)及染色质疆域在三维空间位置上的互作、功能关系(Matteo Vietri Rudan，2015，Cell Report)。大量基因组调控作用元件在人和小鼠全基因组上被发掘和注释，但是他们的靶标基因大部分仍然不清楚。从3C到6C在全基因组覆盖度上和染色质相互作用无偏性上，均比较局限。Hi-C是3C衍生技术，可以说是全基因组3C分析，无论在分辨率、覆盖度、无偏性上正好能解决这些问题(Fulai Jin et al,2013,Nature)。
基因组测序研究，样品选择和制备是重要环节，是获取科学有效的生物信息分析成果的前提，而样本准备的难易程度也决定了是否能顺利开展课题、项目，Hi-C技术可以产生无差别的染色质远程交互作用数据,用于建立三维基因组的基本空间结构，用于农业方面的研究和人类健康研究，主要以细胞为研究对象。获得细胞的方法主要是两种：培养细胞系和从组织直接分离细胞。目前，标准Hi-C技术细胞的数量要达到2.5×107(25million)个(Erez Lieberman-Aiden,2009,Science)。标准试验技术需要的细胞量比较大，收集足够细胞耗时；实验材料数量要求较多，导致细胞培养成本提高；所需细胞数量较大也会导致实验误差增大；所获数据在全基因组范围内互作分辨率低。
因此亟需开发一种高效的、基于通用单培养皿细胞量(6CM-10CM)就能进行Hi-C测序建库的技术——eHi-C。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种细胞eHi-C测序文库的制备方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)裂解细胞得到染色质；
所述裂解为先裂解所述细胞的细胞膜，得到细胞核；再裂解所述细胞核，得到染色质；
2)将所述染色质依次经酶切、DNA末端标记、钝端环化连接、DNA纯化，得到纯化后环状DNA；
3)将纯化后环状DNA和作为内参的环状共沉淀DNA分子混匀，得到混合物；再将所述混合物依次经外切酶酶切去除线性化DNA和再次所述DNA纯化的步骤，得到纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物；
4)将所述纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物超声打断，得到片段化环状共沉淀和环状DNA混合物；
5)从所述片段化环状共沉淀和环状DNA混合物中用免疫磁珠抓取带有所述标记物的DNA片段；
6)用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库。
步骤6)中，用带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库为将带有所述标记物的DNA片段依次经末端修复和加尾反应、加接头、PCR扩增和切胶选择文库的步骤，得到eHi-C测序文库。
所述选择文库大小为100bp-700bp。
上述方法中，步骤1)中，所述裂解所述细胞的细胞膜为用含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解；
所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解。
所述含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液配方由质量百分含量1％PI、150mM NaCl、1mM EDTA、体积百分含量1％Triton X-100、质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠、质量百分含量0.1％SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-KOH缓冲液组成；
所述含有质量百分含量为1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液配方由质量百分含量1％PI、150mM NaCl、1mM EDTA、体积百分含量1％Triton X-100、质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠、质量百分含量1％SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-KOH缓冲液组成；
上述方法中，步骤2)中，所述酶切将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA；
或，所述限制性内切酶为HindIII。
上述方法中，步骤2)中，在所述酶切步骤中，在所述重悬和所述反应之间还包括如下步骤：将在所述重悬后染色质用SDS去除不与DNA直接交联的蛋白的步骤。
上述方法中，步骤2)中，所述DNA末端标记为将带有标记物的dNTP引入所述酶切得到的产物中；
或所述标记物为生物素，所述标记物通过biotin-14-dCTP引入。
上述方法中，步骤2)中，所述钝端环化连接采用的连接反应液中含有或不含有PEG8000；
或所述连接反应液由Triton X-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT和水组成；
或所述连接反应液由Triton X-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、PEG8000和水组成。
上述方法中，步骤2)和步骤3)中，所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；
或所述磁珠纯化中的磁珠为磁珠原液或磁珠原液的稀释液；
或所述磁珠原液的稀释液为将所述磁珠原液稀释10倍得到的稀释液；
所述稀释采用的稀释缓冲液为Beads solution，其由质量百分含量30％PEG 8000水溶液:5M NaCl水溶液按照体积比1:1混匀得到。
或步骤3)中，所述作为内参的环状共沉淀DNA分子为质粒DNA分子；
或步骤3)中，所述外切酶为Lambda和RecJf；
或步骤4)中，所述超声打断的Intensity为105。
上述方法中，步骤1)中，所述细胞的数量为大于等于1million；
或所述细胞的数量为1-3million。
由上述的方法制备的eHi-C测序文库也是本发明保护的范围。
或上述方法或所述制备的eHi-C测序文库在细胞eHi-C测序中的应用也是本发明保护的范围；
本发明第三个目的是提供一种细胞eHi-C测序方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：1)用上述的建库法的步骤，得到eHi-C测序文库；2)对所述eHi-C测序文库进行测序。
本发明第四个目的是提供一种用于细胞eHi-C测序的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的建库法中所有试剂的任一种或任意组合。
本发明在标准方法(5_Standard组，即为对照组)的基础上根据以上三个优化步骤又增设了1_Option组、2_Beads组、3_3M组(仅细胞量在该组改为3million)、4_T4组和6_Phix(建库对照，为ΦX 174噬菌体的DNA，序列是已知，无Index)，如图2。其中1_Option、2_Beads、4_T4各组之间仅在所述步骤优化，其余步骤与3_3M、5_Standard组一样。以上任一优化组自由组合，均可以达到制备高质量eHi-C文库。所述建库方法，主要针对少量(1-3million)细胞进行群体细胞高效全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库。与ErezLieberman-Aiden的方法(需要25million个细胞.Science,2009)、Matteo Vietri Rudan的方法(需要10million.Cell Report,2015)相比，细胞需要量少，较易获得实验材料，节约收集材料时间，大大降低细胞培养成本，试剂耗材成本，降低试验误差。
本发明所提供的方法适用于低至1million的群体细胞全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库，与Hi-C标准方法(Erez Lieberman-Aiden，Science,2009)和国内主流Hi-C测序公司需求细胞数量25million甚至100milion相比，具有以下优点：
(1)应用本发明技术方案，能对数量低至1million细胞的进行全基因组染色质构象技术eHi-C建库测序。大大降低细胞需要量、细胞培养成本和建库成本。本发明方法操作简单、与时俱进，能够适用于包括小鼠C2C12细胞系在内的哺乳动物体外培养的多种细胞系。
(2)改良了标准Hi-C测序步骤，选择采用0.1％SDS FA细胞裂解缓冲液穿孔裂解细胞膜和1％SDS FA细胞核裂解缓冲液穿孔裂解细胞核膜，效果显著。DNA磁珠纯化中无需再进行酚仿抽提和RNA酶消化。对于环化连接效率检测，创新性的引入了环化的共沉淀DNA，环化效率一目了然。Lambda和RecJf外切酶切碎线性DNA，尽量消除未环化DNA“噪音”。且与JobDekke的标准Hi-C相比，将生物素DNA免疫磁珠纯化步骤提前，加上出库前PCR时才进行切胶纯化反应，大大降低了样品损耗。
(3)全程利用磁珠纯化方式，与标准Hi-C的酚仿抽提相比，简化了步骤，节约了试剂，尤其Tris-饱和酚和氯仿都是剧毒试剂。
(4)本发明升级版本,在如下步骤可以替换：DNA纯化时采用30％PEG 8000Beads稀释溶液(达到同样纯化效果同时进一步节约成本)；酶切前增加1％SDS去除液A和10％TrionX-100去除液B(除净与DNA未交联的蛋白，增加酶切、环化效率)；末端环化连接时替换T4连接酶缓冲液中超纯水为质量百分含量7.5％PEG 8000(可稍微调低连接效率，根据需要进行负向调整)。
(5)目前市场上未有Hi-C建库试剂盒，本发明能开发成适用于与现阶段最流行的Miseq,Hiseq 2500和Hiseq 3000测序仪的一种细胞易得省时、操作快捷省事、商业前景广阔省心的高效全基因组染色质构象技术eHi-C建库试剂盒及其升级版。也能基于此试剂盒开发成一种可用于1-3milion群体细胞的自动加样eHi-C建库装置。
附图说明
图1为本发明主要步骤流程图。
图2为本发明细胞数量优化标准处理及其他步骤备选优化处理。
图3为试验(一)一中C2C12细胞汇合率达到70-80％时(a)细胞状态和(b)细胞自动计数仪结果。
图4为试验(五)一中预试验2结果，图4a各泳道依次为：M,1kb Marker；质粒,NgAgo质粒；Hind III线性化，Hind III线性化质粒后的结果；Mixture，200ng质粒和200ng线性DNA混合的得到的Mixture；整个图中一共三条带相应分别为开环DNA、线性DNA和超螺旋。图4b各泳道依次为：M,1kb Marker；质粒,NgAgo质粒；Hind III线性化，Hind III线性化质粒后的结果；Lambda和RecJf外切酶消化Mixture，一倍酶量、两倍酶量和三倍酶量的结果；质粒,NgAgo质粒。图4上样量统一为100ng。
图5为试验(五)二中环化的DNA被Covaris 220超声波片段化后的E-gel电泳检测结果。图5a,打断前(对照)；图5b,打断后。1—5为五个处理组；M为100bp Marker.
图6为试验(六)2X KAPA HiFi HotStart PCR E-gel检测结果。a为切胶前，b为切胶后。M，100bp Marker；PCR设定了18循环和28循环，1—5为五个处理组。
图7为试验(六)上机测序结果质控—Q值热图。
图8为试验(六)上机测序结果质控—碱基比例图(％)。
图9为试验(六)上机测序结果质控—错误率(Error rate)。
图10为试验(六)上机测序结果质控—大于Q30(Q值≥30)的值所占的百分比。
图11为试验(六)上机测序结果质控—Q值分布柱形图。
图12为试验(六)上机测序结果质控—混合样本的均一度及对应数据表。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，均为自常规测序建库生化试剂商店(Thermo Fisher、NEB、KAPA、Illumina等)购买，所用水均为Ultrapure Distilled Water(Thermo Fisher)。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
除主要建库步骤外的其余三种优化步骤，均可根据需要与主要步骤替换进行。
下面将结合参考附图和实施例来详细说明本发明。
实施例1、细胞eHi-C测序文库的制备及其在测序中的应用(5-standard)
图1为本发明主要步骤流程图。
(一)、裂解细胞制备染色质
一、细胞收集与交联固定
1、当培养皿(10CM)中细胞汇合率达到70-80％的时候C2C12细胞(
2、向其中加入质量百分含量37％甲醛水溶液(280ul)，使其终浓度为1％，将培养皿放到旋转器上常温摇晃10分钟(或37℃培养箱孵育10min)；
3、向其中加入2.5M甘氨酸水溶液(0.89ml，使其终浓度为0.2M)猝灭甲醛，放回旋转器常温振荡5分钟(或常温摇晃几下，均匀后，静置5分钟)；
4、去除培养液，用预冷的1×PBS(10ml)洗细胞两次。
5、去除大部分PBS并在盘中剩余0.5ml PBS，用细胞铲刀将细胞刮下，用移液器将细胞吸入新1.5ml离心管中，放在冰上，用1ml质量百分含量0.5％BSA/PBS冲洗细胞，收集剩余的细胞到该离心管中。
6、350g 4℃离心5min。去除上清，得到固定后细胞，冻存(-80℃)或直接进行下一步。
二、细胞膜裂解
1、取四管-80℃冻存的(一管约2million)固定后细胞，解冻团块，放于冰上,加入冰冷的1×PBS分装五管(四管1million，一管3million，如图2)，一管(1million)进行如下eHi-C标准步骤。
2、用1.0ml 0.1％SDS FA细胞裂解缓冲液(质量百分含量1％PI，50mM pH7.5HEPES-KOH，150mM NaCl，1mM EDTA，体积百分含量1％Triton X-100，质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠，质量百分含量0.1％SDS)重悬上述1的细胞团；在4℃冷室中旋转(仪器名字：QB-210Multipurpose shaker)裂解15min.4℃500g离心5min.去除上清。
3、重复步骤2，收集沉淀，得到细胞核团块。
细胞团块主要是细胞核，呈白色。-80℃保存细胞核团块或者继续进行细胞核裂解。
三、细胞核裂解
1、解冻-80℃保存上述二得到的细胞核团块，放于冰上。
2、先用1.0ml 1％SDS FA细胞核裂解缓冲液(质量百分含量1％PI，50mM pH 7.5HEPES-KOH，150mM NaCl，1mM EDTA，1％体积百分含量Triton X-100，质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠，质量百分含量1％SDS)重悬细胞团；在4℃冷室中旋转裂解15min；10℃20,000g离心15min.去除上清。
3、再加1.0ml 0.1％SDS FA细胞裂解缓冲液(含1％PI)重悬(先加300ul,并用1ml移液枪的枪头将团块打碎，再补齐到1.0ml)；在4℃冷室中旋转裂解15min.4℃20,000g离心15min.去除上清；得到染色质。
(二)酶切染色质
用500ul 1×NEBuffer 2(NEB；#B7002S)吹洗上述(一)获得的染色质团块，4℃20,000g离心15min.去除上清。重复一次。
用枪头再次打碎团块，加35.5ul 1×NEBuffer 2，尽可能重悬混合完全，得到重悬后染色质；再向重悬后染色质中加入2ul共40U HindIII(NEB；R0104L)37℃裂解过夜，得到酶切后DNA。
(三)、DNA末端标记和钝端环化连接
1、取3.3ul dNTP混合物(1.5ul 10mM dATP，1.5ul 10mM dGTP，1.5ul 10mM dTTP和37.5ul 0.4mM biotin-14-dCTP(Thermo Fisher；19518018))和1ul 5U/ul Klenow(NEB)酶加入酶切后DNA中，混匀，37℃孵育45min,补齐并标记DNA末端，之后放于冰上，得到标记后DNA分子；
加入6.8ul质量百分含量10％SDS(终浓度约15％)65℃孵育30min，将酶灭活。之后迅速放置于冰上。
2、向标记后DNA分子中添加新制备的608ul连接反应液(59.4ul体积百分含量10％Triton X-100水溶液，59.4ul 10×ligation buffer(500mM pH7.5 Tris-HCl,100mMMgCl2,100mM DTT)；6.4ul 10mg/ml BSA水溶液；6.4ul 100mM ATP水溶液；477ul超纯水)，混匀后加入4ul T4DNA ligase(1U/ul),16℃孵育过夜，进行钝端连接，得到环状DNA。
(四)、DNA纯化
1、为了解耦交联并裂解蛋白，向每个样品管中加入4ul proteinase K(10mg/ml),65℃孵育至少1h。
2、加入792ul Ampure XP beads(Beckman Coulter；A63881)(150ul原装Beads用Beads solution(质量百分含量30％PEG 8000水溶液和5M NaCl水溶液按照体积比为1:1混匀)稀释10倍)，混匀，常温静置5min。
3、将含有beads的样品放于磁力架上，静置5分钟，溶液变澄清。
4、移液枪吸出上清液，加入700ul新鲜制备的80％EtOH(乙醇溶液，体积分数85％)，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。
5、第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用10ul移液枪去除残余的EtOH，常温5min晾干。
6、加入38ul超纯水，简单涡旋混合。放回磁力架，约5min后溶液变澄清，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，得到纯化后环状DNA。
(五)、引入环状共沉淀DNA
1、将3.5ul环状共沉淀DNA(NLS-NgAgo-pcDNA3.1；Miaolingbio；VT1161-03；添加环状共沉淀DNA，为了作为对照观察打断效果,8246bp，保证500ng-1ug)加入到上述(四)得到的纯化后环状DNA中，得到加入质粒后的样品。
2、用Lambda(NEB；M0262L)和RecJf(NEB；M0264L)外切酶37℃消化1h(尽量消除线性化DNA，增加环化效率)；具体：加入质粒后的样品38.5ul,10×Lambda外切酶缓冲液5ul,Lambda外切酶0.5ul,RecJf外切酶3ul，得到消化后产物。
(六)、DNA再次纯化
A、再次纯化
将(五)得到的消化后产物再次进行Ampure XP beads纯化，方法与(四)相同；具体如下：
60ul Ampure XP beads(50ul原装Beads用Beads solution(30％PEG 8000水溶液:5M NaCl水溶液＝1:1)稀释10倍后使用,剩余放入4℃冰箱下次再用)加入消化后产物混匀，常温静置5min；将含有beads的样品放于磁力架上，静置5分钟，溶液变澄清。移液枪吸出上清液，加入500ul新鲜制备的80％EtOH(乙醇，体积分数85％)，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用10ul移液枪去除残余的EtOH，常温5min晾干。加入130ul TE缓冲液，吸打或简单涡旋混合，得到纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物。
B、两个预试验
预试验1、beads原液稀释倍数摸索
Qubit 3.0测得质粒DNA NLS-NgAgo-pcDNA3.1浓度为25.6ng/ul，取3份20ul质粒(512ng)，进行三种纯化处理：beads原液组、Beads solution5倍稀释组和Beads solution10倍稀释组，处理方式为A中所示的Ampure XP beads纯化方法，结果如表1所示，表明，Beads稀释在保证效果的前提下节约成本，10倍稀释Beads与5倍稀释效果相当。
表1为不同稀释倍数磁珠纯化比较
预试验2、Lambda和RecJf外切酶消除线性化DNA是否进行
针对Lambda和RecJf外切酶消除线性化DNA进一步详细测试，结果显示线性化消除高效，如图4。
质粒(NLS-NgAgo-pcDNA3.1；Miaolingbio；VT1161-03)用Hind III过夜酶切，酶切体系为：质粒(NgAgo，256ng/ul)2ul,Hind III 2ul,1×NEBuffer 2 36ul.2个重复，共得到至少800ng线性DNA；
取200ng质粒和200ng线性DNA混合的得到Mixture；
将线性DNA、质粒和Mixture按照A中所示的Ampure XP beads纯化方法纯化，电泳，上样量统一为100ng,结果如图4a所示，Mixture中明显分开了三种不同形式的DNA：开环DNA，线性DNA，超螺旋DNA。
将Mixture按照表2所示的不同酶切体系进行酶切，得到1倍酶切后Mixture、2倍酶切后Mixture和3倍酶切后Mixture。
将质粒、线性DNA、1倍酶切后Mixture、2倍酶切后Mixture和3倍酶切后Mixture分别再按照A中所示的Ampure XP beads纯化方法纯化，电泳，上样量统一也为100ng.
表2不同的倍数的外切酶对Mixture中线性DNA消除
结果如图4b，可以看出，1倍外切酶切处理后，消除线性DNA效果就立显(与图4a中Mixture对比)，随着酶量增多，消除效果增加。
(七)、超声打断
将130ul(六)的A获得的纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物(Beads已经被除去)转移到microTUBE AFA(Covaris 220)管中，按程序设定(Duty Cycle 5％，Intensity 105，Cycles per Burst 200，Time 240s)打断环化DNA，得到片段化环状共沉淀和环状DNA混合物。
检测超声打断效率，取10ul片段化环状共沉淀和环状DNA混合物跑E-gel检测声波降解法的效率，结果如图5所示,图5a为对照(设定Intensity 5时(现有的Hi-C技术设定参数)，未打断，图5b为片段化环状共沉淀和环状DNA混合物的打断结果，可以看出，本发明的方法弥散，超声打断效果好。
(八)、免疫磁珠抓取
先混匀
转移120ul上述(七)得到的片段化环状共沉淀和环状DNA混合物到120ul清洗过的Dynabeads悬浮液中(总体积240ul)。常温孵育，并旋转(仪器Intelli-Mixer)混匀30min。用150ul 1x B&W缓冲液(用2×稀释一倍得到)清洗Beads两次(清洗时，轻弹管壁，常温800rpm简单旋转)放磁力架上至少2min，去除缓冲液。加22.5ul超纯水溶解Beads，得到生物素标记DNA片段，去除了环状共沉淀相关片段。
之后步骤全伴随免疫磁珠进行。
(九)、文库制备
1、末端修复和加尾反应
体系为：上述(八)得到的生物素标记DNA片段样品22.5ul,End Repair&A-Tailing缓冲液，3.5ul,KAPA Frag缓冲液(10X)2.5ul,End Repair&A-Tailing酶1.5ul(KAPABiosystems；KK8502).
轻轻涡旋震荡，冰浴，转移到PCR仪上立即进行孵育(20℃,30min65℃,30min；4℃，∞)，得到末端修复和加尾反应产物。
2、加接头
制备连接混合液(末端修复和加尾反应产物30ul,Adapter储存液(Illumina；MiSeq Reagent Kit v3 150-cycle；MS-102-3001)2ul,超纯水3ul,连接缓冲液15ul,DNA连接酶5ul)。完全混匀，轻微离心。快速进行Adapter连接。20℃孵育15min，得到加接头后产物。
3、PCR扩增
制备PCR混合物(2X KAPA HiFi HotStart Ready预混液(KAPA Biosystems；KK8502)10ul,10X KAPA文库扩增引物预混液(KAPA Biosystems；KK8502)2ul，2得到的加接头后产物1ul,超纯水9ul，彻底混匀，简单离心。按如下程序设置PCR。预变性：98℃1min；18或28个循环(变性：98℃15s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s)；终延伸：72℃5min；保存：10℃∞min。得到PCR产物。
取5ul PCR产物跑E-gel,进行Smear条带观察质量控制，如图6a，可以看出18个循环即可正好满足250-500bp的切胶范围；28个循环已经扩增过度。
4、选择文库
使用胶回收试剂盒进行大小100bp-700bp(本次取250-500bp)片段,即为eHi-C测序文库(5-standard组即标准eHi-C得到)。
(十)Mi-Seq测序
利用Miseq@Reagent Kit v3(150Cycles PE，带有内参对照Phix对照组)试剂盒进行Mi-seq测序,如图6b。上机测序数据通过Illumina Sequencing Analysis Viewer进行结果评估。
结果如图7-12，图7为Q值热图；循环整齐均一,中间为Index。
图8为碱基比例图(％)，结果显示无GC或AT分离，含量无偏离。
图9为Error rate错误率，Error rate中reads错误率小于1.5质量优良。
图10为大于Q30的值所占的百分比，所有循环的Reads Q值大于30的比例，发现最小比例85％以上，说明处理后的数据质量均优良。
图11为Q值分布柱形图，反映测序过程中不同阶段的数据质量，Q30平均值为93.2％(即总体水平Q值＞30所占比例)，测序总体(五个处理均包含)质量非常好。
图12为混合样本的均一度，其中5为本实施例结果。
实施例2、细胞eHi-C测序其他方法
一、方法(图2所示)：
1、1-Option组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是(二)，得到1-Option组eHi-C测序文库：
用500ul 1×NEBuffer 2(NEB；#B7002S)吹洗上述(一)获得的染色质团块，4℃20,000g离心15min.去除上清。重复一次。用枪头再次打碎团块，加38ul 1×NEBuffer 2，尽可能重悬混合完全，得到重悬后染色质。
将3.8ul质量百分含量为1％SDS水溶液加入重悬后染色质中，使SDS的终浓度为0.1％，混匀，65℃孵育10min，以去除不与DNA直接交联的蛋白；孵育后立即把离心管放于冰上，加入4.4ul体积百分含量为10％Triton X-100猝灭SDS，小心混匀避免气泡；得到处理后染色质；
将处理后染色质中加入2ul共40U HindIII(NEB；R0104L)37℃裂解过夜，得到酶切后DNA。
2、2-Bead组:与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是(四)DNA纯化和(六)、再次纯化时使用不稀释的Beads原液，得到2-Bead组eHi-C测序文库；
3、3-3M cells组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是(一)的二的细胞数量为3million，得到3-3M cells组eHi-C测序文库；
4、4_T4组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是(三)的2中连接反应液中的超纯水替换为质量百分含量7.5％PEG 8000水溶液，得到4_T4组eHi-C测序文库；
改变后的连接体系为：59.4ul体积百分含量10％Triton X-100溶液、59.4ul 10×ligation buffer(500mM pH7.5 Tris-HCl,100mM MgCl2,100mM DTT)、6.4ul 10mg/ml BSA溶液、6.4ul 100mM ATP溶液和477ul质量百分含量7.5％PEG 8000水溶液。
5、5-standard：实施例1的方法，得到5-sndarde组标准eHi-C测序文库；
6、Phix对照组：Miseq@Reagent Kit v3中的内参对照Phix对照组。
二、Mi-Seq测序
与实施例1的(十)相同，测序文库的均一度结果如图12所示，1-5为5个处理组，6为Phix对照组；表示每个样本Reads量是不是一样多；可以看出以5_Standard组为标准eHi-C，1_Option组(仅附加SDS和Triton X-100去除不与DNA直接交联的蛋白，其余步骤与5_Standard组一致)、2_Bead组(仅DNA纯化时使用不稀释的Beads原液，其余步骤与5_Standard组一致)和3_3M cells组(仅细胞数量为3million，步骤与5_Standard组一致)的Reads比例均大于5_Standard组，4_T4组(仅在钝端环化连接步骤超纯水替换为质量百分含量7.5％PEG 8000，其余步骤与5_Standard组一致)比例降低。所以，1_Option组可以在增加可用Reads量的基础上，除净与DNA未交联的蛋白，进一步增加酶切、环化效率；2_Bead组反映标准eHi-C可以在保证可用Reads量的基础上，达到同样纯化效果同时进一步节约成本，4_T4组可稍微调低连接效率，降低可用Reads量，负向调整。本标准方法的集中优化均能达到目的，并可以按照需求优化组合。
