犬科动物间充质干细胞库及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞库及其构建方法，具体地说是涉及一种犬科动物胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法。
技术背景：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能。还可以从脂肪组织，胎肝，脐血和动员的外周血，胎肺，胎盘，脐带，牙髓，滑膜，牙周膜，子宫内膜，小梁骨和密质骨等多种组织器官分离和培养MSCs。
大量的研究已经表明在合适的培养的条件下，MSCs能分化为中胚层、内胚层和甚至是外胚层细胞，MSCs能分泌多种生长因子和免疫保护因子，其中有些免疫因子在细胞和器官移植过程中广泛应用，最重要的是，MSCs不能形成肿瘤，对组织再生和修复治疗应用是安全的。由于分离纯化相当容易、可以大量培养扩增和多胚层分化潜能，MSCs可以作为干细胞治疗和基因载体理想的细胞来源。MSCs的另一个独特的特点是他们能够逃避免疫识别和抑制免疫反应，因此，MSCs在免疫性疾病的免疫调节细胞治疗过程中将会是一种非常有应用前景的细胞药物。目前，大量动物模型，特别是犬科动物模型的研究已经证明，间充质干细胞可以治疗天疱疮、退行性关节炎、髋关节发育不良、大面积皮肤损伤、皮肤溃疡、角膜溃疡、肝功能衰竭、肾功能衰竭、神经损伤等疾病。MSCs是存在于多种成体组织(如骨髓和脂肪组织等)和围产期胎儿附件组织(如脐带血和脐带组织及胎盘组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有多种细胞生物学特性：包括向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)和非间充质系列细胞(外胚层和内胚层来源的组织细胞)分化的潜能，造血支持活性和免疫调节活性，并具有独特的细胞因子分泌功能。是一种潜在的可用于治疗多种疑难疾病的治疗手段。
目前人间充质干细胞的分离扩增及细胞库建立已经十分成熟，且间充质干细胞在人类医学领域的应用已经开展多年，取得了显著的效果，使得干细胞治疗成为了传统治疗手段之外临床医生的新选择。与此类似，间充质干细胞在动物医学领域同样有着巨大的需求和广阔的应用空间，急需一种高效分离动物，特别是犬科动物间充质干细胞的方法，并建立满足临床使用及质量检测需求的规模化标准化制备的犬科动物间充质干细胞库。此外本发明选用脐带胎盘作为分离间充质干细胞的来源组织，有效的利用了动物生产的废弃物，同时不同于骨髓和脂肪干细胞，避免了获取干细胞的过程给供体动物所带来的创伤和痛苦，可以更好的保护动物权益，避免伦理争议。本发明具体的说明了建立犬科动物脐带、胎盘间充质干细胞库的技术方法。并确定了犬科动物间充质干细胞库建立过程中所需的病原学检测，遗传学信息的采集和保存。
通过酶消化和组织贴壁法分离间充质干细胞，容易混入其他的贴壁细胞，比如巨噬细胞和内皮细胞，只有通过多次传代来去除难消化的巨噬细胞和对培养基有不同要求的内皮细胞，这个方法耗时费力并且对技术要求高。本发明利用不同细胞的粒径不同，通过逐级过筛的方法来剔除混杂的巨噬细胞和内皮细胞，无需培养就能得到纯度高的间充质干细胞，与传统的反复贴壁去除杂细胞方法相比，省时省力，并且减少了操作风险。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种高效的犬科动物胎盘、脐带间充质干细胞库的构建方法。
本发明的第二个目的是提供一种犬科动物间充质干细胞库，其可以应用于对犬科动物的免疫性疾病、肝损伤、慢性肾炎的治疗。
根据本发明的一方面，以健康犬科动物的胎盘和脐带为材料来源，提取间充质干细胞，有效的利用了动物生产的废弃物，在不引起伦理争议的前提下构建间充质干细胞库。
根据本发明的另一方面，对构建间充质干细胞库的工艺过程进行优化；
筛选对比多种酶消化法后，发现用体积比为1:1的I型胶原酶(浓度0.5％)和(胰酶浓度0.5％)混合液消化，消化效果良好，远远优于使用单纯酶消化。
多次重复对材料组织的消化和过滤操作，发现重复3-5次，目的细胞得率达到很高水平，再继续重复则收获不大。
根据本发明的再一方面，针对上述方法的改进，设计了一种细胞过滤器，其具有过滤网、500目筛和1000目筛，过滤网用于去除大块的组织材料，500目筛用于去除粒径较大的混杂细胞，1000目筛用于去除粒径较小的混杂细胞，在使用时，目标间充质干细胞(10μm-25μm)则被截留在1000目筛上表面。
有益效果：本发明无需对组织细胞进行传代培养，就能将间充质干细胞和混杂细胞分离，节省了操作工艺时间，并且获得的细胞形态表型分化鉴定的合格率达到100％，长期保存不失活性，富有应用前景。
附图说明
图1：本发明酶消化法和传统酶消化法的细胞得率比较；
A：传统酶消化法B：本发明酶消化法
图2：本发明酶消化法和传统酶消化法的细胞表型比较；
A：传统酶消化法B：本发明酶消化法
图3：不同目筛过滤后细胞大小；
A:未过筛的细胞；B：依次通过200目筛和1000目筛后的细胞；C：依次通过500目筛和1000目筛后的细胞；D：依次通过100目筛，500目筛和1000目筛后的细胞；E：依次通过200目筛，500目筛和1000目筛后的细胞。
图4：细胞过滤器结构示意图
其中，1为上过滤器、2为下过滤器、101为上手持部位、102为金属过滤网、103为500目筛膜、104为上螺旋口、201为下螺旋口、202为1000目筛、203为下手持部位；
图5：反复酶消化与单次酶消化的细胞得率比较；
图6：反复酶消化与单次酶消化的细胞大小比较；
A：传统酶消化法B：本发明酶消化法
图7：MSC各个代次的细胞形态；
A：P2代犬间充质干细胞形态
B：P5代犬间充质干细胞形态
C：P8代犬间充质干细胞形态
D：P13代犬间充质干细胞形态
图8：犬胎盘及脐带来源的MSCs的细胞表型；
图9：犬间充质干细胞的生长曲线；
图10：犬间充质干细胞的多向分化能力
A:犬间充质干细胞具有较强成脂分化能力B：犬间充质干细胞具有较强成骨分化能力。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例
实施例1：(胎盘、脐带组织的获取)
筛选供者犬(古牧犬)，选定体格检查合格对象；
通过剖腹产取犬科动物胎盘、脐带，抽取胎盘血，应用病毒检测试剂盒(上海快灵生物有限公司)进行犬冠状病毒、犬瘟热病毒、狂犬病毒、犬细小病毒、犬布氏杆菌等传染病检测；
检测合格后，用含有庆大霉素和环丙沙星的磷酸盐缓冲液(pH为7.3)冲洗去除残留血液并浸泡胎盘脐带组织15分钟；
用无菌刀具将胎盘脐带组织切割至约1-2cm3的小块，再次用磷酸缓冲液清洗，去除残留血液；
实施例2：(混合消化液的浓度和配比筛选)
将胎盘脐带组织组织分成8份，加入不同比例和不同浓度的I型胶原酶和胰酶(如表1所示)进行消化，消化液按以下比例用磷酸缓冲液稀释混合，消化液体积为组织体积的1/2，将容器置于恒温磁力搅拌器上消化30分钟，转速为90-120转/分钟，温度37度；
表1：混合消化液配比
将所得的消化混合物通过不锈钢过滤网后，对滤过液中的有核细胞进行计数，结果见下表。
表2：不同混合液消化结果
由以上数据可知，当I型胶原酶和胰酶比例为1:1，I型胶原酶的浓度为0.5％和胰酶的浓度0.5％，消化效率最高。
实施例3：本发明消化方法和传统酶消化方法的比较
本发明消化方法：将组织放入比例为1:1的I型胶原酶(0.5％)和胰酶(0.5％)的消化液的容器中，将容器置于恒温磁力搅拌器上消化30-40分钟，温度37度；将消化混合物通过细胞过滤器，滤过液重新加入容器中进行再次消化，用含有10～15％狗血清的D/F12培养基冲洗细胞过滤器得到间充质干细胞悬液；重复消化3～5次，收集间充质干细胞悬液，2000rpm离心10min，弃上清，重悬于含有10～15％狗血清的D/F-12培养基中。
传统酶消化方法：将组织放入浓度为0.6％(w/v)的I型胶原酶溶液中，将容器置于恒温磁力搅拌器上消化4h，温度37度；然后用10％血清终止消化，用100目筛网将消化混合物过滤，2000rpm离心10min，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于含有10～15％狗血清的D/F-12培养基中。
比较上述两种方法所得的有核细胞数，结果如图1所示；应用流式细胞仪对所得的原代细胞进行细胞表型鉴定，结果如图2所示。
结果表明：应用本发明方法可以提高分离效率，所得的有核细胞数比原有酶消化方法分离得到的要多3倍，纯度由原有方法的10％提高到了85％。
实施例4：目筛的选择和细胞过滤器的设计
让酶消化所得混合物通过不锈钢过滤网后，分别经过不同的目筛次第过滤，分4组进行操作，如下：
表3：目筛的选择分组
收集1000目筛上的细胞，对有核细胞进行计数，结果见下表：
表4：目筛的试验结果
收集1000目筛上的细胞，测量有核细胞大小，结果见图3，图3A未过筛的细胞的大小，大部分的细胞中10-60μm之间，还有大量的碎片，通过组1的目筛过滤后，细胞的大小在10-50μm之间(图3B)，不能够满足纯化间充质干细胞的要求。通过组2,3,4的目筛过滤后，细胞的大小在10μm≤粒径≤25μm(图3C,D,E)，符合间充质干细胞的粒径，而组2收集的这个粒径范围的细胞是最多的。
为了方便多次过筛和减少操作过程，将上述过滤网和多级目筛整合在一起，设计细胞过滤器(图4)，过滤器为PP材质，细胞过滤器包括第一过滤器1和第二过滤器2，第一过滤器1与第二过滤器2通过上螺旋口104和下螺旋口201连接，其中第一过滤器1设置有上手持部位101、金属过滤网102和500目筛膜103，第二过滤器2设置有下手持部位203和1000目筛膜202。
从第一过滤器1的上表面倾倒消化混合物，滤过操作完毕后将第二过滤器2取下，反转180°后，用含有10～15％狗血清的DF12培养基冲洗得到间充质干细胞悬液。
实施例5：多次消化过滤试验
为确定合适的重复次数，进行该试验。
(1)将粗剪后的组织块加入含有0.5％I型胶原酶和0.5％胰酶的混合溶液中，其中I型胶原酶和胰酶比例为1:1，
(2)将所得的消化混合物通过细胞过滤器收集细胞。
(3)滤过液重新加入容器中进行再次消化，于恒温磁力搅拌器上消化30分钟，转速为90-120转/分钟，温度37度；重复步骤2，再次收集细胞过滤器上的细胞。
(4)重复步骤(3)，第三次收集细胞。
(5)重复步骤(3)，第四次收集细胞。
(6)重复步骤(3)，第五次收集细胞。
(7)对每次收集的有核细胞进行计数，结果见下表：
表5：多次消化过滤后的细胞计数
结果表明第一次和第二次消化的效率最好，随着次数的增加，消化的细胞数越来越少。反复5次酶消化比单次酶消化的细胞得率提高了3倍(图5)，反复酶消化和单次酶消化后的细胞粒径相似(如图6)。
实施例6：间充质干细胞的建库
对培养的间充质干细胞进行下述鉴定检测。
细胞形态学观察：采用本发明方法分离的原代间充质干细胞多于16小时内贴壁，培养1-2周，倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，2周以后增长速度较快，成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，于第2-3周可形成80％融合贴壁细胞层。连续传10代，细胞形态无明显改变(图7)。
细胞表型检测：应用流式细胞仪对P1代的细胞进行细胞表型检测，结果表明细胞表达间充质干细胞特有的标志CD90，CD105，CD44，不表达CD34，CD19，CD11b(图8)。
细胞生长曲线检测：对各代次的细胞进行细胞生长曲线的检测，结果表明细胞具有很好的扩增能力(图9)。
细胞分化能力检测：对P1代的细胞进行成脂分化和成骨能力的检测，结果表明细胞具有很强的多向分化能力(图10)。
按下述方法对鉴定合格的间充质干细胞进行保存。
将间充质干细胞，装进5ml冻存管内，用冷冻保护液预处理之后放进干细胞储存盒，采用1010型冷冻系统(Forma Scientific Inc，USA)冷冻，然后将储存盒保存在-196℃低温的液氮罐中。将其详细信息(包括供者犬年龄、犬种、遗传信息、预防接种信息、病毒检测信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案备查询。
