用于检测关节炎的标志物、基因芯片以及制备方法
技术领域
本发明涉及医学领域，具体而言，涉及一种用于检测关节炎的标志物、基因芯片以及制备方法。
背景技术
骨性关节炎(OA)是一种退变性关节疾病，涉及关节的所有组织，在病变过程中可观察到关节软骨、滑膜、软骨下骨及周围软组织(肌肉、韧带等)的结构改变，表现为关节软骨失常，传导应力负荷失常，导致软骨的生物力学及生物化学环境发生改变，逐渐发生软骨的降解质变，最终发生软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等。以往对OA的病因研究多集中于关节软骨的破坏，越来越多的研究表明，软骨下骨改变在OA发病过程中起着积极作用，即软骨下骨硬化与OA的发生、发展密切相关，不只是OA发生的结果，而且，软骨下骨的改变有可能先于关节软骨的改变。
关节软骨下骨包括皮质终板以及紧靠其下方的骨小梁、血管和小梁间的腔隙。软骨下骨的基本功能为吸收应力、缓冲震荡和维持关节的形状。在OA病例中，软骨下骨常出现硬化、囊性化、无菌性坏死等改变。有研究表明软骨下骨改变可引发关节软骨破坏及进行性恶化，软骨下骨硬化可导致软骨细胞功能失调及OA发生。基因芯片是将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上，再将样品用荧光染料标记制备成探针，与芯片进行分子杂交反应，检测杂交信号强度，并经计算机分析和数据处理，从而对基因序列和功能进行大规模、高速度、高通量的研究。已有学者将基因芯片用于骨关节炎的研究，报道了利用基因芯片研究OA软骨或骨组织的基因表达谱，发现了一系列与骨关节炎发病密切相关。
骨性关节炎是一种退变性关节疾病，涉及关节的所有组织，在病变过程中可观察到关节软骨、滑膜、软骨下骨及周围软组织(肌肉、韧带等)的结构改变，表现为关节软骨退化，传导应力负荷失常，导致关节的生物力学及生物化学环境发生改变，逐渐发生软骨的降解质变，最终发生软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等。据报道，英、美国有5％-10％成年人患有膝关节炎；在我国，流行病学的调查研究发现有症状的OA患病率在5.1％-20.8％之间，中国OA患者人数估计超过1亿。这种多因素疾病是引起老年人疼痛和伤残的首要原因，直接导致了严重的个人与社会经济负担。目前，OA的治疗尚缺乏治愈的有效手段，常用的治疗方法主要是理疗、药物等，到了疾病晚期外科手术治疗是唯一的治疗方法。
因此，如何有效地对骨性关节炎在发病前期进行早期预测，进而警示潜在患者进行提早治疗对于骨性关节炎的康复以及减轻病痛是非常关键的，然而目前现在技术中尚未见对骨性关节炎早期预警的分子生物学手段，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测关节炎的标志物，该标志物在关节炎患者和正常人之间存在差异性表达，进而可以作为检测关节炎患者的标志物。
本发明的第二目的在于提供一种所述的标志物在制备用于检测关节炎产品中的应用，以期实现在关节炎检测方面的应用。
本发明的第三目的在于一种基因芯片，该基因芯片通过加载特定的探针序列进而可以快速地检测出机体中标志物。
本发明的第四目的在于提供一种所述的基因芯片的制备方法，该制备方法，简单有效，通过参数优化后，可以实现芯片准确检测效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种检测关节炎的标志物，所述标志物包括1L1-β，其基因序列号为NM-000576.2。
通过实验发现，该基因在正常人和关节炎患者存在差异性表达，具体的，其呈现上调表达的趋势，该基因上调的倍数较正常人相比，其可以达到12倍以上，因此，在检测关节炎的过程中，可以通过测定该基因上调表达情况进而可以判断出该患者是否是潜在的关节炎患者，为潜在患者提供了预警判断，以方便患者及早治疗，减轻病痛。
可选的，所述标志物还包括C16orf35或1L-8，其基因序列号分别为NM-012075.1和NM-000584.2。
另外，经试验发现，上述基因在关节炎患者和正常人之间也存在不同程度的差异表达，其分别交正常人相比，上调表达的倍数均高于6倍以上(小于12倍)，因此其也可以单独或者经过与1L1-β组合作为检测关节炎的标志物。
鉴于上述的标志物在检测关节炎方面效果，其作为制备用于检测关节炎产品中的应用也理应属于本发明的保护范围之内，具体的，这些产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测所述标志物基因表达以诊断骨关节炎的产品。
本发明还提供了一种基因芯片，所述基因芯片负载有能够特异性检测权利要求1或2所述的标志物的探针片段。所述基因芯片还负载有能够特异性检测NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612的探针；该6种基因其在关节炎患者和正常人之间存在至少2倍以上(6倍以下)的上调表达，因此本发明提供的基因芯片中还可以负载有检测这些基因的探针序列，以期通过辅助检测方式提高检测结果的准确性。
一种所述的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备芯片载体；
2)、将用于特异性检测标志物的寡核苷酸片段固定在所述芯片载体上。
为了实现芯片快速高效地制备，本发明对上述的制备方法进行优化，可选的，在步骤1)中，具体包括：
空白载体清洗干净，浸泡于含0.5-0.8％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(体积含量)的且质量浓度为90-94％的丙酮中5-6分钟，再用95-96％的丙酮(质量浓度)清洗3-5次后于50-60℃干燥40-50分钟，得到氨基修饰的载体；
所述载体包括玻片或尼龙膜。
尼龙膜表面多孔、具有渗透性，优点是可以重复使用。玻璃基片，其表面无渗透作用，加样量低，在芯片制备过程中易除去非特异性杂交产物，可以平行分析样品。
可选的，在步骤2)中，具体包括：
氨基修饰的载体用0.25-0.4％苯异二硫氰酸酯(质量浓度)处理1.5-1.8小时；再用含体积含量为1.5-1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5-8分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗5-8分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针片段固定在干燥后的载体上。
上述方法处理的玻片与氨基修饰的探针结合效果好。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、提供了一种可以有效检测关节炎的标志物，为关节炎的早期预警检测提供了便利；另外，该标志物也为关节炎检测的临床研究提供基础资料。
(2)、提供了一种关节炎检测的新工具，通过基因芯片对该标志物进行快速检测，再通过软件分析，确定这些标志基因的差异表达情况判定该机体是否患有关节炎。
(3)、对于基因芯片的制备方法进行了优选，载体选择得当，并且对载体进行了特殊的处理，使得点样后的载体中，探针能够牢固地固定在载体上，提高芯片的使用效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种检测关节炎的标志物，该标志物包括1L1-β9(其基因序列号为NM-000576.2)，并且优选的，该标志物还可以为C16orf35或1L-8，其基因序列号分别为NM-012075.1和NM-000584.2。上述的几种基因在关节炎患者和正常人之间均存在不同程度的差异性上调表达，因此可以通过检测上述几种基因的上调表达倍数从而预判个体是否患有关节炎。进一步地，为了提供便利，本申请还提供了可以检测上述基因的基因芯片，所述基因芯片负载有能够特异性检测上述标志物的探针片段。优选的，所述基因芯片还负载有能够特异性检测NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612的探针。
接下来，通过对基因芯片的具体制备方法举出具体的实施例以说明本申请的详细技术方案。
实施例1
制备芯片载体；
空白玻片载体清洗干净，浸泡于含0.5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且质量浓度为90％的丙酮中5分钟，再用95％的丙酮清洗3次后于50℃干燥50分钟，得到氨基修饰的载体；
将用于特异性检测标志物的寡核苷酸片段固定在所述芯片载体上。
氨基修饰的玻片用0.25％苯异二硫氰酸酯处理1.8小时；再用含1.5％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗5分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针片段(可特异性识别1L1-β)固定在干燥后的玻片上。
实施例2
空白玻片载体清洗干净，浸泡于含0.5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且质量浓度为90％的丙酮中5分钟，再用95％的丙酮清洗3次后于60℃干燥50分钟，得到氨基修饰的载体；
氨基修饰的玻片用0.25％苯异二硫氰酸酯处理1.8小时；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡8分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗8分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针(可特异性识别C16orf35和1L-8)片段固定在干燥后的玻片上。
实施例3
空白尼龙膜载体清洗干净，浸泡于含0.8％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且质量浓度为94％的丙酮中6分钟，再用96％的丙酮清洗5次后于60℃干燥40分钟，得到氨基修饰的载体；
氨基修饰的尼龙膜载体用0.4％苯异二硫氰酸酯处理1.5小时；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗5分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针片段(能够特异性检测NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008和NM_001007612)固定在干燥后的玻片上。
实施例4
空白尼龙膜载体清洗干净，浸泡于含0.7％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且质量浓度为92％的丙酮中5分钟，再用95％的丙酮清洗4次后于55℃干燥45分钟，得到氨基修饰的载体；
氨基修饰的尼龙膜载体用0.3％苯异二硫氰酸酯处理1.7小时；再用含1.6％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡7分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗7分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针片段(可特异性低识别1L1-β)固定在干燥后的玻片上。
实施例5
空白尼龙载体清洗干净，浸泡于含0.55％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且质量浓度为93％的丙酮中5分钟，再用95％的丙酮清洗5数次后于60℃干燥50分钟，得到氨基修饰的载体；
氨基修饰的白尼龙载体用0.35％苯异二硫氰酸酯处理1.6小时；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-异氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分钟，然后用体积比为1:1的甲醇和丙酮洗6分钟后储存于真空干燥器中干燥；
采用点样仪将5’端氨基修饰的寡核苷酸探针片段(可特异性检测1L1-β、C16orf35、1L-8、NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008和NM_001007612)固定在干燥后的玻片上。
试验例
基因芯片检测：5例RA患者和3名健康志愿者采取外周静脉血3ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，淋巴细胞分离液分离PBMC。Trizol法提取总RNA，1％琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。
采用Illumina%20RNA%20Amplification%20Kit将提取的RNA进行反转录和线性扩增。
具体步骤如下：每个样品取200ng%20RNA，以RNAase-free水成11微升体系，加入9微升反转录母液，合成cDNA。过纯化柱清洗纯化cDNA后，将纯化的cDNA加入10微升转录母液，体外转录合成cRNA。过纯化柱纯化cRNA。每个样本上样量为1500ng%20cRNA，与杂交混合液混合后加入实施例1-5的基因芯片(每个患者对应一个实施例)，55℃反应16-22h，清洗后用封闭缓冲液封闭。用Streptavidin-Cy3染色，反应后的芯片进行扫描。Bead%20Studio软件进行数据分析，挑选RA组与健康志愿者组比较目的基因的上调情况。统计结果如下表1所示。
表1试验例1检测结果
通过以上结果看以看出，关节炎患者与正常人之间的结果中，上述所列的几种基因之间明显存在规律性地差异上调情况。其中，1L1-β基因在患者中均存在上调12倍以上的情形，而C16orf35或1L-8则上调6倍以上，其他基因的上调倍数均在6倍以下，因此上述所有的基因均可以作为检测关节炎患者的标志物，检测结果主要基于其与正常人之间的上调倍数而定，1L1-β上调12倍以上；或者C16orf35或1L-8上调6倍以上，12倍以下；或者NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612上调2倍以上，6倍以下即可定性为关节炎患者，进而为患者的早期诊断起到预警效果，进一步地帮助患者及早治疗，减轻病痛。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
