用于生物分子检测或测序的生物芯片及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测生物分子的芯片及其制造方法。
背景技术
目前，分子检测及鉴定技术已经成为临床医学和生命科学领域未来发展的主要方向。一直以来，大量和多样性的生物样品需要较长时间进行处理和分析。快速和高通量的生物芯片技术可以极大地提高传统医学鉴定的效率。如今，生物分子检测的装置(如，“生物芯片”)已经倾向于小型化和高集成化。这样的生物芯片一般由玻片为底物，待测样品的探针通常以阵列或微阵列(Microarray)形式被固定在玻片上(称为Capture Probe，抓取探针)，待测样品液中的样品分子(称为Target Molecule，目的分子)会与玻片上的抓取探针进行特异性结合来(核酸类分子之间的特异性结合叫做Hybridization，杂交)。其中，玻片上的光学信号通常来自于标记在样品分子或者探针分子上的光敏分子。最后，玻片通过光学成像来表现检测结果。
然而，固定在底物上的抓取探针只能与非常靠近的样品分子结合，而样品液中的样品分子只能靠自由扩散来到抓取探针附近，因此，玻片检测的过程往往需要数小时的时间。为了提升Target分子与抓取探针结合效率，需要提供主动运输的机制来提高Target分子在抓取分子附近的浓度，以增加发生结合的机会。
其中，电动力学(Electrokinetics，EK)装置具备高度集成化、可控化，以及无需机械外力等优点，已被众多研究机构采用并应用在操控流体和微颗粒等领域。目前，电动力学操控技术中存在一些限制。比如，在直流(DC)电场下，同电性的微粒只能够向单一的方向运动(如，电泳，Electrophoresis，EP)，但对于具有复杂结构和电荷条件的生物分子，直流电场则难以进行有效的处理和操控。此外，直流电场下对金属电极的腐蚀和消耗也是长期存在的问题。另一方面，在交流(AC)电场下，可以产生介电泳(Dielectrophoresis，DEP)和电流体力学(Electrohydrodynamics，EHD)等现象。DEP可在再短距离内操控复杂的微粒或分子，包括DNA、蛋白质等生物分子；EHD包括可以长距离驱动流体的电渗(Electroosmosis，EO)和电热(Electrothermosis，ET)流。然而目前并没有一个电动力学原理的装置，可以结合DEP和EHD的优势，以提升生物芯片的检测效率。
终上所述，本发明提出一种全新的生物芯片结构，以达到利用多种电动力效应以提升生物化学反应效率的目的，以及制造该生物芯片的方法。
发明内容
根据本发明，提供了用于生物分子检测或测序的生物芯片，所述生物芯片包含：
基础构件；
两个或多个电极，所述电极沉积在基础构件上；和
电介质层，所述电介质层沉积在电极和基础构件上以将每条电极绝缘，并具有一个或多个微井结构，该微井排布在电极上方；
其中，上述的具有一个或多个微井结构电介质层构成连续的操作表面，用于生物分子检测或测序，通过上述电极施加的电场在微井附近产生电场梯度，将待测生物分子牵引朝向操作表面上的优选区域。
优选地，该两个或多个电极中至少有一个电极上方的电介质层具有微井结构。
优选地，所述排布在电极上方的微井结构形成微井区域，所述优选区域包括所述微井区域。
优选地，该微井结构的宽度小于电极的宽度。
优选地，该微井结构为圆形微井结构，所述微井结构的宽度为圆形微井结构的直径。
优选地，该微井结构的深度不大于电介质层的厚度。
优选地，该电极的宽度为是10nm-1mm。
优选地，该电介质层的厚度为是1nm-1mm。
优选地，所述电介质层的材料选自包含氧化硅、氮化硅、氧化铝、氧化钛和氮化钛的组中一种或多种材料。
优选地，所述电极的材料选自包含铝、铜、金、铂金、和银的组中的一种或多种导电材料。
优选地，所述基础构件的材料选自包含硅、热氧化硅、固体聚合物的组中的一种或多种基底材料。
优选地，所述两个或多个电极之间具有一个或多陷入结构分隔所述两个或多个电极。
优选地，所述电介质层沉积在一个或多陷入结构上以将之填充。
优选地，所述优选区域固定有抓取探针。
在本发明的另一方面，提供了一种制造生物芯的方法，该方法包括以下操作：
a)提供一个基础构件，
b)提供一个由所述基础构件形成的上表面；
c)在所述上表面进行蚀刻以形成一个或多个微井结构；
d)在所述上表面沉积上层；
其中，在所述上表面形成的所述一个或多个微井结构限定上表面的轮廓，所述上层承接所述上表面的轮廓，以形成带轮廓的操作表面。
有利地，所述基础构件包含一金属层。
有利地，所述基础构件包含一金属层和金属层上的第一电介质层。
有利地，所述上层包含一电介质层。
有利地，上层包含一金属层。
有利地，还包括在所述金属层进行蚀刻以形成一个或多个陷入结构由此形成两个或多个电极。
有利地，还包括在所述金属层上沉积一电介质层掩盖在金属层上的所述一个或多个一个或多个陷入结构。
有利地，还包括在所述微井结构固定抓取探针。
附图简述
图1A为本发明之生物芯片的实施方式1的立体结构图；
图1B为图1A中的生物芯片局部的沿线A-A的横截面结构图；
图2为在图1A中的生物芯片上固定的抓取探针DNA示意图；
图3为图1A中的生物芯片的两个电极产生EK效果的示意图，其中包括实施例二中涉及到的远场和近场的两种运输作用；
图4A-4D为在图1A的生物芯片中微井结构的EK操作原理示意图，其中均显示了实施例二中涉及到的主流场和辅助流场的方向。具体地，图4A显示没有通过电极施加电场的效果，图4B显示施加低频AC电场，图4C显示施加中频AC电场，图4D显示施加高频AC电场，；
图5为在被动扩散和电动力学增强输送作用下，目标分子和抓取探针结合效果的比较示意图；
图6为图1A中的生物芯片的制造方法的实施方式1的示意图；
图7A为图1A中的生物芯片的制造方法的实施方式2的示意图
图7B为图1A中的生物芯片的制造方法的实施方式3的示意图；
图7C为图1A中的生物芯片的制造方法的实施方式4的示意图；
图8为图1A的生物芯片的操控条件的模拟图。
图8A为图8的模拟图。其中包括电场强度分布和电场梯度方向的模拟结果，灰度差异表示电场强度的分布，箭头显示的电场梯度的方向。模拟条件为20V，1kHz，水相媒介电导率5.5uS/m，相对介电常数78；
图8B为图8A中的微井区域，其中，灰度差异表示电场强度的分布，箭头显示的电场梯度的方向；
图8C为图8A中的电极间隙区域，其中，灰度差异表示电场强度的分布，箭头显示的电场梯度的方向；
图8D为图8B区域在10kHz中频的AC电场下的作用效果；
图8E为图8C区域在10kHz中频的AC电场下的作用效果；
图8F为图8B区域在1MHz高频的AC电场下的作用效果；
图8G为图8C区域在1MHz高频的AC电场下的作用效果；
图8H为图8B区域在1S/m高电导率的水相媒介中，1kHz低频下的作用效果；
图8I为图8C区域在1S/m高电导率的水相媒介中，1kHz低频下的作用效果；
图8J为图8B区域在1S/m高电导率的水相媒介中，1MHz高频下的作用效果；
图8K为图8C区域在1S/m高电导率的水相媒介中，1MHz高频下的作用效果；
图9A为图1A中的生物芯片的AC电场连接方式示意图；
图9B为图9A中的生物芯片在不同频率下，操控二氧化硅小球形成的不同排布图案；
图10A和图10B为图1中的生物芯片的杂交实验效果。其中，图中显示区域为4x4的微井阵列，不同的抓取探针均固定在独立的微井内，目标为Cy3荧光标记的人工序列DNA片段，图10A为电动力学增强作用下的杂交结果，图10B为被动杂交结果；
图11A和图11B为图10区域内的抓取探针阵列排布图，其中图11A为抓取探针的编号，图11B为其相对应的意义；和
图12为图10的实验的数据化结果的比较图。
具体实施方式
首先，对本发明中的生物芯片的结构进行说明。
参考附图的图1A和1B为本发明的生物芯片100的一个优选的实施方式。本发明的生物芯片100用于生物分子检测或测序。所述生物芯片基本包含基础构件104，两个或多个电极103和电介质层102。所述电极103沉积在基础构件104上。所述电介质层102沉积在电极和基础构件104以将每条电极103绝缘。所述电介质层102并具有一个或多个微井结构101，该微井排结构101布在电极103上方。上述的具有一个或多个微井结构101电介质层102构成连续的操作表面102A。通过上述电极103施加的电场在微井结构101附近产生电场梯度，将待测生物分子牵引朝向操作表面102A上的优选区域，用于生物分子检测或测序。
在基础构建104上，电极103以平行方式排列。电极103与电极103之间有陷入结构来形成电极间隙106并由所述电介质层102进行绝缘。电极103的上方也是由电介质层102进行绝缘的。并且在至少一条电极103的上方的电介质层102上具有一个或多个微井结构101。电极边缘105、上述微井结构101、和电极间隙106使得电介质层102形成一个具有轮廓的操作表面102A。基础构建104可被视为包括电极103。排布在电极103上方的微井结构101形成微井区域。如图2所示，带轮廓的操作表面102A上的优选区域为微井区域101。抓取探针107的可被固定在优选区域内(微井结构101内)而且采用常规方式被固定。
如图1B所示，生物芯片100中具有以下尺寸：微井结构101的深度(A)约为100nm、微井结构101的宽度(B)约为80um、电介质层102的厚度(C)约为300nm和电极103的宽度(D)约为140um。为了确保电极103可以被电介质层102完全绝缘，杜绝电化学反应，微井结构101的深度(A)一般不超过电介质层102的厚度(B)。该电介质层102的厚度(B)为1nm-1mm。另一方面，微井结构101的宽度(B)一般不超过电极103的宽度(D)。电极103的宽度(D)为10nm-1mm。微井结构101为圆形微井结构101。所述微井结构101的宽度为圆形微井结构101的直径。
所述电介质层102的电介质层的材料选自包含氧化硅、氮化硅、氧化铝和氧化钛的组中一种或多种材料。
所述电极103的材料选自包含铝、铜、金、铂金、和银的组中的一种或多种导电材料。
所述基础构件104的材料选自包含硅、热氧化硅、固体聚合物的组中的一种或多种基底材料。
以下，对本发明中的生物芯片的操作和原理进行说明。
如图3所示，在使用时，样品会以水溶液的形式覆盖生物芯片100的操作表面102A，其轮廓所产生的电动力效应包括远场EK运输效应108和近场运输效应109。其中，远场EK运输效应108主要包括电热ET效应，其作用在于大范围地扰动流体(体相流体)，使得流体内部的目标(Target)或还包括其它微粒随着流体而从较远距离快速地移动，并循环。近场EK运输效应109主要包括介电泳DEP和电渗EO效应。DEP作用在目标和其它微粒上，将极化程度polarizability较高的微粒拉向电场梯度较高的区域，而将极化程度较低的微粒推向电场梯度较低的区域。其中微粒的极化程度亦可由电场频率和溶液条件的变化来改变，即DEP力的方向会随电场频率和溶液条件改变。EO流为作用在固体表面的流体场，其主要效果在于带动操作表面102A上的流体进行切向的流动，并适用于集中临近操作表面102A的微粒。远离芯片表面的目标可以由ET流运输到操作表面102A附近，并且在DEP与EO的共同作用下，在操作表面102A的特定区域内(如优选区域)，目标集中效果会更加显著。
以条状电极为例，如图4A-4D为电动力效应的俯视图。其中，主流场108A的方向与电极103垂直，局部流场109A的方向则延微井结构101轮廓的法向方向(以圆形的微井轮廓为例)。由于操作表面102A上存在微井结构101，在微井边缘可以产生局部电场梯度109B。图4B，在低频电场下(如1kHz至10kHz)，主流场108A的方向由电极边缘105指向电极中心，同时，局部流场109A的方向指向微井结构101的中心。图4C，在中频电场下(如10kHz至100kHz)，主流场108A的方向由电极边缘105指向电极103的中心，同时，局部流场109A的由微井101的中心指向其外部。图4D，在高频电场下(如1MHz或以上)，主流场108A的方向由电极103的中心指向电极边缘105，同时，局部流场109A的由微井结构101的中心指向其外部。
如图5所示，以核酸类的目标分子110为例，在被动杂交的过程中，样品溶液内部即远场)的目标分子110需要通过渗透(或称自由扩散)来到反应表面附近，才能与表面的抓取探针107结合(即杂交)。基于此过程的生化反应，通常需要数小时甚至过夜的时间来完成。然而，在电动力运输下，目标分子受到远场和近场的EK共同作用(108和109)，可以在短时间内，集中到微井结构101内，并可以快速地与固定在操作表面102A上的抓取探针107结合。与此同时，由于杂交而固定了的目标分子107可以继续通过远场EK运输108进行补充。因此，电动力增强下的生化反应效率可以的到显著提升。
以下为对本发明中另一方面的生物芯片制备方案第一实施例。本方法是基于成熟的半导体及微电子器件制造工艺。图6-7(C)仅以单条电极为例说明。
如图6(i)-6(iv)所示，基础构建104包括以热氧化处理后的晶体硅。如图6(i)所示，在基础构建104表面进行蚀刻出一个或多个微井结构101或阵列。如图6(ii)所示通过具有默认的微井结构101阵列图案的遮蔽B 112在基础构建104的上表面进行蚀刻，以生成所需的微井结构101或阵列(。在形成微井结构101或阵列的基础构建104的上表面物理沉积金属层103。金属层103是由物理沉积形成。因此它跟随上表面的轮廓形成微井结构101。如图6(iii)所示，通过具有默认的金属层103图案的遮蔽A 111进行蚀刻，以形成电极103与电极103之间有的陷入结构来形成电极间隙106，并形成所需的两条或以上电极103。至少有一个电极103下方的基础构建104具有微井结构101。最后在此表面上使用PECVD的方式化学沉积二氧化硅层，即电介质层102，此电介质层102承接微井结构101和电极103的图案，以形成一个具有轮廓的操作表面102A(如图6(iv)所示)。电介质层102沉积在一个或多陷入结构/电极间隙106上以将之填充/部分填充。
在依传统方法固定抓取探针到所需微井结构101内之后，生物芯片100便可以使用。在另一实施例，依传统方法固定抓取探针到所需的电极边缘105、或电极间隙106之后，生物芯片100便可以使用
图7A(i)-7A(iv)展示以下为对本发明中另一方面的生物芯片制备方案的第二实施例。本方法是基于成熟的半导体及微电子器件制造工艺。
基础构建104包括以热氧化处理后的晶体硅。如图7A(i)所示，在基础构建104()的表面先物理沉积金属层103，并通过具有默认的金属层103图案的遮蔽A 111进行蚀刻(如图7A(ii)所示)，以形成电极103与电极103之间有的陷入结构来形成电极间隙106，并形成所需的两条或以上电极103。之后，再在此表面通过具有默认的微井结构101阵列图案的遮蔽B 112进行蚀刻(如图7A(iii)所示)，以生成所需的微井结构101或阵列，其中，至少有一个电极103具有微井结构101结构。最后在此表面上使用PECVD的方式化学沉积二氧化硅层，即电介质层102。此电介质层102承接微井结构101，以形成一个具有轮廓的操作表面102A(如图7A(iv)所示)。电介质层102沉积在一个或多陷入结构/电极间隙106上以将之填充/部分填充。
在依传统方法固定抓取探针到所需微井101内之后，生物芯片100便可以使用。。在另一实施例，依传统方法固定抓取探针到所需的电极边缘105、或电极间隙106之后，生物芯片100便可以使用。
图7A(i)，7A(ii)7B(iii-iv)展示以下为对本发明中另一方面的生物芯片制备方案的第三个实施例。本方法是基于成熟的半导体及微电子器件制造工艺。
图7A(i)，7A(ii)所示的步骤相同于上述图7A(i)，7A(ii)的步骤。在图7A(iii)所示的步骤通过遮蔽B 112进行蚀刻之前，先使用PECVD的方式化学沉积二氧化硅层，即电介质层102。蚀刻生成的一个或多个微井结构101或阵列位于至少一个电极上方的电介质层102上。最后，最后在此表面上使用PECVD的方式化学沉积二氧化硅层，即电介质层102。此电介质层102承接微井结构101，以形成一个具有轮廓的操作表面102A。电介质层102沉积在一个或多陷入结构/电极间隙106上以将之填充/部分填充。在依传统方法固定抓取探针到所需微井101内之后，生物芯片100便可以使用。在另一实施例，依传统方法固定抓取探针到所需的电极边缘105、或电极间隙106之后，生物芯片100便可以使用。
图7A(i)，7A(ii)，7B(iii)，7C(iv-v)展示以下为对本发明中另一方面的生物芯片制备方案的第四个实施例。本方法是基于成熟的半导体及微电子器件制造工艺。
图7A(i)，7A(ii)，7B(iii)所示的步骤相同于上述图7A(i)，7A(ii)，7B(iii)的步骤。在图7B(iii)所示步骤中对沉积的电介质层102进行蚀刻时，完全蚀刻掉微井结构101部分的电介质层102(如图7C(iv)所示)。之后在此表面上再次使用PECVD的方式物理沉积电介质层102。最后的电介质层102承接微井结构101和电极102的图案，以形成一个具有轮廓的操作表面102A(如7C(v)所示)。第一次沉积的电介质层102沉积在一个或多陷入结构/电极间隙106上以将之填充/部分填充。
在依传统方法固定抓取探针到所需微井101内之后，生物芯片100便可以使用。在另一实施例，依传统方法固定抓取探针到所需的电极边缘105、或电极间隙106之后，生物芯片100便可以使用。
以下，对生物芯片上的EK控制条件及相应效果进行说明。
在生物芯片100平台中所操控的主要EK效应包括介电泳DEP、交流电渗流ACEO Flow和交流电热流ACET Flow。其中，ACEO和ACET属于EHD流场，分别带动近场和远场的流体流动；DEP属于针对微粒的作用力，在近场产生强大的吸引或者排斥力。
在平面电极系统中，ACET可从电极间隙106向上产生环流，搅拌体相流体，ACEO可在操作表面102A产生切向的表面流场，完成局部的运输和辅助集中。现今已有多种经典的电极形状，例如平行条状(或梳状)电极、城堡形电极、四极电极、同心电极等，均可以产生多种的EK组合效应。
以平行条状电极为例，在图8A中，上图为连续三个平面电极的侧视图，下图为其在50um高的液体中的电场分布模拟图，其中，背景色表示电场强度的强弱，箭头表示电场梯度的方向。模拟施加的电场为20V，频率1kHz，电极103的宽度(D)为140um，间隙106为20um，水相媒介的电导率为5.5uS/m，相对介电常数为78。
更详细地，图8B、8D、8F、8H和8J为微井结构101区域的局部模拟图，图8C、8E、8G、8I和8K为电极间隙106区域的局部模拟图的局部模拟图。其中模拟的频率包括：1kHz低频、10kHz中频和1MHz高频；模拟的水相媒介电导率包括：5.5uS/m底导和1S/m高导。可以清楚看到，透过具有轮廓的操作表面102A，我们可以利用电场频率和水相媒介的性质(电导率)来改变水相媒介中的电场强度和电场梯度，从而达到所需的EK效果。
基于以上设计和模拟，我们验证了平面条状电极组，在水溶液中通过EK效应操控二氧化硅小球的效果。如图9A所示，条状电极103以平行方式排列，并交替地连接到交流电信号AC与地线GND，以产生所需电场。图9B为不同频率下二氧化硅小球在操作表面102A形成的图案。其中，二氧化硅小球来自(Sigma S5631)，直径在0.5-10um范围(80％在1-5um之间。电场发生装置为Agilent 33250A。影响系统为Nikon eclipse i50。
我们利用电场发生装置产生20Vpeak-topeak的正弦波，扫描频率在100Hz-1MHz之间。
当在100Hz下开始时，小球开始缓慢移动，并未有快速集中的效果。当频率逐步提高至几kHz时，运动开始变得显著，并且微井结构101的中心开始有小球集中。观察到，在100Hz-1kHz之间，小球从电极边缘105向微井结构101的中心移动，并留在微井结构101内。此时对应的是图4B中描述的EK操作原理，并且，在1kHz-10kHz内，集中效果越来越强烈。
当频率升至10kHz以上时，小球簇开始向电极边缘105延伸，并最终流向电极间隙106，其中，还观察到部分小球在电极间隙106附近快速地扰动。详细地址，部分小球从电极间隙106“爬升”至上层液体中，然后在微井结构101中心附近被“吸回”操作表面102A，之后再次被“弹出”至电极边缘105。此时对应的是图4C中描述的EK操作原理。
当频率继续提高时，小球扰动的半径变得越发狭窄。在20kHz-40kHz内，大多数小球已被牵引至电极间隙106中。达到100kHz时，小球扰动的范围达到最小，有些仅在电极边缘105“自转”。在100kHz以上，小球在电极间隙106中形成与电极103垂直的“链”。随后，“链”在约600kHz时解体。当频率达到1MHz时，多数小球已被推向电极103中心的上方，即上层液体中。此时对应的是图4D中描述的EK操作原理。
更具体地，在低频率下，小球主要受到ACEO流体牵引而移动，而表面流场受操作表面102A的轮廓影响。微井结构101结构可调节表面电场梯度并引导小球进入微井结构101。而在中高频率下，ACEO效应逐渐受到压制，ACET的流场起主导作用，所以小球产生的扰动，甚至被排斥的现象，此现象发生在体相流体(如上层液体)，并且对表面轮廓不敏感。另一方面，在中频下，DEP的影响也相当显著，所以才会在电场梯度较大的区域有小球集中的现象，如电极边缘105附近。随着频率变化，电场强度和电场梯度都有变化，因此三种EK效应的主导程度也有所不同，才会使小球产生此类多种的集中和排列图案。
以下，对生物芯片使用生物分子检测中EK的增强效果进行说明。
通过实施例一中的方式生产生物芯片100，将所需的核酸类抓取探针固定在微井结构101内，以检测样品中的DNA目标分子(此结合过程为杂交)。
样品选用带有Cy3荧光标记的人工序列DNA的混合溶液。根据生物芯片的操作和原理中所述的EK控制规律选择与图4B效果相适应的条件来对样品溶液进行EK处理。图10A及10B为经过10分钟的杂交时间后，EK增强杂交(图10A)和被动杂交(图10B)的结果。很明显地，所示发光的微井结构101区域内，荧光的强度在EK增强下高于被动杂交。其中，图10A所示区域内的4x4微井结构101阵列中固定了不同的抓取探针，其按编号排布的顺序如图11A(左)所示。图11B(右)为与编号对应的抓取探针的意义。其中包括7种目标序列，和控制组序列(ctrl)，即阳性及阴性对照。通过对荧光强度的分析，如图12所示，我们可以得出结论，EK增强的杂交效果优于被动杂交的效果。
仅通过举例已给出本发明，在不偏离在所附权利要求中指定的本发明的范围下，本领域技术人员可以对所描述的实施方式进行各种其它修改和/或改变。
