一种cDNA的特异性分子标签及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种cDNA的特异性分子标签及其应用。
背景技术
在过去的二三十年里，二代测序的大规模序列分析技术极大的推动了基因组和转录组的序列分析。转录组的测序因为不需要对整个转录组预先设计探针并且可以检测未知转录本，已经逐渐取代传统的基因表达谱芯片成为首选的转录组分析方案。
转录组是指在某一特定阶段，由细胞转录出来的全部RNA，包括mRNA和非编码RNA。转录组学就是从RNA水平研究基因的表达情况，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律。与基因组不同，转录组学研究包含了时间和空间的限定，同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。传统的转录组分析需要数万至数十万个细胞，这种基于群体水平的方法将大量的基因表达取平均值进行分析，无法揭示细胞之间基因表达的异质性。另外，当目标细胞数目稀少又难以培养时，这种传统的分析方法就无能为力了，就需要用到单细胞转录组分析技术。
单细胞转录组测序技术的分辨率精确到单个细胞，为辨别异质性群体中各种细胞类型的转录组特征提供了有力的工具。传统的建库方法使用超声波、雾化等方法片段化DNA，需要较大量的起始材料，然后通过末端修复、添加接头等步骤实现。然而基于单细胞的转录组测序起始总RNA量极少，这种方法不适合，这是让许多潜在用户感到失望的一点。
构建cDNA文库是单细胞转录组分析的关键技术步骤，其方法包括分离单细胞、细胞裂解、mRNA逆转录成cDNA、cDNA片段化与加接头、文库扩增几个步骤。单细胞的转录组测序起始总RNA量极少，在不去除核糖体RNA的情况下使用多聚胸腺嘧啶(oligo-dT)作为逆转录引物获得大量的全长cDNA，利用逆转录酶的模板转换(template-switching)活性在cDNA的3｀端加上一段接头序列，这段接头序列可用于全长cDNA扩增进而得到整个mRNA的序列，从而避免3｀端的偏好性。使用转座酶的建库方法可以在打断的同时在片段化DNA两端加上接头，将繁琐的DNA片段化、末端修复和连接反应等步骤变为了一步简单的酶促反应，这种方法极大的减少了起始模板量和样品处理时间。
转录组的研究可以从整体水平上来研究基因功能和基因结构，揭示生物过程的分子机理，量化各转录本在其中的表达水平变化，因此被广泛应用于生物学研究、药物研发、基础研究以及临床诊断等领域。然而，确定两个不同物种或单一样品中不同基因的绝对数量丰度很有挑战性，由于PCR扩增的偏好性，不同表达量的mRNA在经过后续建库的PCR扩增后反应出来的信息具有不准确性，后续的生物信息分析数据无法真实的反应基因表达量。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种cDNA的特异性分子标签及其应用，该特异性分子标签加在每一个cDNA的5｀端，使每一个基因都是独一无二的，后续的信息分析可以根据该特异性分子标签的序列量化样品中每一个基因。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种cDNA的特异性分子标签，其全长序列中包含：通用引物序列；转座酶接头序列P7；随机序列：(N)n，N为随机序列，共n个；和poly(T)序列；其中，所述通用引物序列如SEQID%20NO.1所示，转座酶接头序列如SEQ%20ID%20NO.2所示，poly(T)序列共有30个T碱基即T30VN。
优选的，本发明所述cDNA的特异性分子标签，其核苷酸序列如SEQ%20ID%20NO.3所示，具体序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGG%20AGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N为随机序列，共n个，N选自A、T、C、G；优选的，n为5-10。
本发明所述cDNA的特异性分子标签在cDNA建库中的应用。所述cDNA的特异性分子标签还应用于利用转座酶打断的cDNA建库中。
本发明还提供一种利用转座酶打断的cDNA建库方法，其包括如下步骤：
1)分离单细胞，将单细胞裂解后释放总RNA；以mRNA为模板、权利要求1或2所述特异性分子标签为引物逆转录合成第一链cDNA，使所述特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，且在逆转录过程中，利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段接头序列，该接头序列与如SEQ%20ID%20NO.1所示的通用引物序列相同；以第一链cDNA为模板，以如SEQ%20ID%20NO.1所示的通用引物序列为引物通过PCR扩增合成带特异性分子标签的全长cDNA，并对PCR扩增产物进行纯化；
2)将步骤1)所得全长cDNA与转座酶包埋复合物进行孵育，完成cDNA片段化和加接头，其中转座酶包埋复合物包括转座酶和退火接头；
3)使用上游引物N7和下游引物N5对步骤2)得到的片段化产物进行PCR扩增；其中，上游引物N7的序列如SEQ%20ID%20NO.4所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG，下游引物N5的序列如SEQ%20ID%20NO.5所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC；
4)对步骤3)所得PCR扩增产物进行纯化，获得带特异性分子标签的cDNA的5`端文库。
进一步，步骤2)中，所述转座酶包埋复合物的制各方法包括：配制体系：配制体系：转座酶(10U)12-15μL、退火接头5μL、包埋缓冲液12-15μL，总体积33μL，用移液器轻轻吹打混匀，将配好的反应体系置于PCR仪上30℃反应1.5小时，-20℃保存。
所述转座酶包埋复合物中的转座酶为Tn5家族转座酶，野生型Tn5转座酶、突变型Tn5转座酶均适用于本发明；所述退火接头的核苷酸序列如SEQ%20ID%20NO.6所示，具体为：CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA。
再，步骤2)中，所述的cDNA片段化和加接头方法包括：配制反应混合液：所述转座酶包埋复合物3-7μl，转座酶反应缓冲液4-8μl；将5`端加上所述特异性分子标签的cDNA与反应混合液混合，用移液器吹打混匀；在PCR仪中55℃反应10-15min。
本发明所述的特异性分子标签共有4n种，通过其上poly(T)序列的30个T碱基与mRNA上的poly(A)尾退火互补在逆转录酶的作用下进行逆转录获得第一链cDNA，特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段与通用引物序列相同的接头序列；通过如SEQ%20ID%20NO.1所示的通用引物可扩增合成得到带特异性分子标签的全长cDNA，该全长cDNA无3`和5`偏好性。
本发明所述的使用转座酶打断的建库方法，在cDNA片段化过程中，片段化断口的两端被加上转座酶的退火接头，即除cDNA的3`和5`端外，片段化的DNA的两端都有相同的退火接头序列P5(如SEQ%20ID%20NO.6所示)；而cDNA的5`端特异性分子标签上带有转座酶接头序列P7，因此利用带有转座酶接头序列(如SEQ%20ID%20NO.2所示)的N7引物和带有退火接头序列(如SEQID%20NO.6所示)的N5引物就可以通过PCR反应富集cDNA的5`端。后续的生物信息分析可以通过标记在每一个cDNA的5`端上的特异性分子标签中的随机序列来区别文库中每一个cDNA的来源，实现cDNA的绝对定量。
在全长cDNA制备过程中，本发明所述特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，从而给每一条mRNA打上了一条随机的分子标签，使每一个基因都是独一无二的，在后续的cDNA%205`端富集过程中即使有不同程度的偏好性，但对于相同分子标签的cDNA，可以记为来源于同一个拷贝，因此生物信息数据分析时通过分子标签的不同就可以区分不同来源的mRNA，从而对mRNA的拷贝数进行精确的定量。
本发明的有益效果：
(1)与现有cDNA建库中常用的序列相比，本发明设计的分子标签有4个不同的序列部分组成，这4个部分分别发挥不同的作用：通用引物序列：逆转录过程中由于逆转录酶的模板转换活性在cDNA的3`端加上一段与通用引物相同的序列，通过通用引物可扩增合成得到带特异性分子标签的全长cDNA；转座酶接头序列P7：全长cDNA的5`端特异性分子标签上带有转座酶接头序列P7，并且在cDNA片段化过程中，片段化的DNA的两端都有相同的退火接头序列P5，使用带有转座酶接头序列P7(如SEQ%20ID%20NO.2所示)的上游引物N7和带有退火接头序列P5(如SEQ%20ID%20NO.6所示)的下游引物N5就可以通过PCR反应仅富集cDNA的5`端；随机序列：标记每一个mRNA分子；poly(T)序列：与mRNA的3`端poly(A)序列互补配对，在逆转录酶的作用下逆转录合成第一链cDNA。
(2)与现有的转座酶打断建库方法相比，本发明的cDNA建库中所使用转座酶包埋复合物中的接头序列只有一种退火接头序列P5，通过带有转座酶接头序列P7的上游引物N7和带有退火接头序列P5的下游引物N5在PCR过程中可以丢弃两端都是退火接头序列P5的DNA片段而仅富集cDNA的5`端。后续的信息分析只需要cDNA的5`端的序列就能知道其代表的mRNA，无需得到全长的cDNA序列信息。
(3)本发明所提供的分子标签加在每一个cDNA的5`端，使每一个基因都有独一无二的分子标签，后续的信息分析可以根据标签的序列量化样品中每一个基因，精确度大大提高。
(4)本发明所设计的特异性分子标签应用于构建cDNA文库时，所需起始总量RNA低(1-1000个细胞、10pg-10ng)，单个细胞即可作为起始模板进行高效扩增，解决了稀有样本量不足的难题；同时大大减少了RNA样本的处理，从而避免了样品的损失，提高了操作的成功率。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1设计cDNA的特异性分子标签
cDNA的特异性分子标签包含：
A、通用引物序列，如SEQ%20ID%20NO.1所示，用于后续PCR扩增全长cDNA，通用引物具体序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC；
B、转座酶接头序列P7，如SEQ%20ID%20NO.2所示，具体序列如下：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG；
C、随机序列(N)n，其中，N为随机序列，共n个；
D、poly(T)序列，共30个T碱基即T30VN；
通过基因合成方法合成cDNA分子标签，其核苷酸序列如SEQ%20ID%20NO.3所示：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC%20GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N为随机序列，共n个，N选自A、T、C、G；优选的，n为5-10。
实施例2制备带所述特异性分子标签的全长cDNA
选择人的293细胞为实验材料，利用南京诺唯赞(Vazyme)的Discover-sc%20WTA%20KitV2(N711)试剂盒进行转录组扩增。所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如，单细胞裂解液、RNase%20Inhibitor、逆转录缓冲液、DTT、TSOligo、逆转录酶、高保真酶等。
(1)样品准备
1)按照以下顺序配制10×Sample%20Buffer，用移液器轻轻混匀，并短暂离心收集。
表1
2)取1μl的10×Sample%20Buffer到0.2ml的PCR管中，再加入4μl的无核酸酶纯水(Nuclease-free%20H2O)。
3)单细胞的分离
取新鲜培养的293细胞悬浮液，在常温下离心收集，弃培养液加PBS重悬，在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的单细胞加入到步骤2)含10×SampleBuffer的0.2ml的PCR管中，轻弹管壁混匀，室温孵育5min。
(2)第一链cDNA合成
1)将裂解后的样品置于冰上，按照表2配制反应混合液，再将4μl反应混合液加入到6μl裂解好的单细胞样品中，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表2
2)在PCR仪中72℃反应3min，结束后立即置于冰上2min。
3)将PCR仪预热至42℃备用。
4)按照表3配制反应混合液，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表3
5)进行如表4所示PCR反应，反应结束后将产物置于冰上，产物为第一链cDNA合成产物。
表4
这一步逆转录合成了第一链cDNA，并在cDNA的3’端加上一段与通用引物序列相同的接头序列。
(3)带分子标签的全长cDNA扩增
通过如SEQ%20ID%20NO.1所示的通用引物序列为引物通过PCR扩增合成全长cDNA，具体步骤如下：
1)配置如表5所示的PCR反应液，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表5
2)在PCR仪中运行如表6所示程序：
表6
(4)PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，所得到的产物即为带特异性分子标签的全长cDNA。
实施例3使用转座酶的DNA建库方法
使用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的(Vazyme)TruePrep DNA Library PrepKit V2 for Illumina(TD503)试剂盒进行，所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如，转座酶缓冲液、PCR缓冲液、高保真酶等。
转座酶及包埋缓冲液由南京诺唯赞生物科技有限公司生产的(Vazyme)Tn5Transposome(S111)试剂盒提供。
(1)接头包埋
配置如表7所示的反应体系，用移液器轻轻吹打混匀，将配好的反应体系置于PCR仪上30℃反应1.5小时，得到转座酶包埋复合物，-20℃保存。
表7
(2)带分子标签的全长cDNA片段化
1)在灭菌PCR管中依次添加如表8所示各反应组分，使用移液器轻轻吹打混匀。
表8
2)进行如表9所示PCR反应，立即向反应产物中加入5μl的5×TS，使用移液器轻轻吹打混匀，室温放置5min。
表9
(3)PCR富集cDNA的5’端
1)配置如表10所示PCR反应液，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表10
其中，上游引物N7的序列如SEQ ID NO.4所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTCTCGTGGGCTCGG，其中xxxxxxxx为index序列；下游引物N5的序列如SEQ ID NO.5所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxTCGTCGGCAGCGTC，xxxxxxxx为index序列。
2)在PCR仪中运行如表11所示程序：
表11
(3)PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司生产的VAHTS DNA CleanBeads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，最终得到的产物即为富集到cDNA的5’端的文库。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
序列表
<110>南京诺唯赞生物科技有限公司
<120>一种cDNA的特异性分子标签及其应用
<160> 6
<210>SEQ ID NO. 1
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC
<210>SEQ ID NO. 2
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
<210>SEQ ID NO. 3
<211>61
<212>DNA
<213>人工合成
AAGCAGTGGTATACGCAGAGTACGTTCGTGGGCTCGGTTCATAAGAGACAGNNNNNNNT30VN
<210>SEQ ID NO. 4
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG
<210>SEQ ID NO. 5
<211>43
<212>DNA
<213>人工合成
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
<210>SEQ ID NO. 6
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成
CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA
