艰难梭菌检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种艰难梭菌检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
背景技术
艰难梭菌（clostridium difficile）是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢梭菌，一般认为是环境和人类肠道中的正常菌群。长期应用抗生素、免疫抑制剂或化疗药物使耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素是导致艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的主要因素。艰难梭菌致病主要因为产生A、B和二元毒素（CDT）。毒素Ａ又称肠毒素导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素Ｂ又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素Ｂ的毒力较毒素Ａ强10倍。大多数产毒株同时产生A和B两种毒素。艰难梭菌在人群中通过粪-口途径传播，主要造成胃肠道感染，轻则引起无症状携带，重则导致严重腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔甚至死亡。目前，艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）不但是欧美国家最常见的医疗保健机构相关性感染，而且正威胁着全球的公共卫生安全。
目前常用的艰难梭菌快速检测方法主要有以下几种：1）细胞毒性试验（CCTA）：细胞毒性试验是检测因毒素A和B引起的细胞病变，但它需要细胞培养及显微镜观察的相应设施和技术，并且耗时长；2）酶联免疫法（EIA）检测毒素A/B：该方法的特异性高，能区分产毒株和不产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果，目前已有Meridian Premier , TechLab Tox A/B Quik Chek, TeehLab ToxA/B II等多种商品化试剂盒投入使用，但该方法的缺点是灵敏度不够，且不能得到菌株用于分子分型等进一步研究；3）酶联免疫法（EIA）检测谷氨酸脱氢酶（GDH）：GDH是一种存在于艰难梭菌细胞壁抗原性蛋白，它比EIA检测毒素A/B更加灵敏，但该方法特异性较低；4）PCR检测：实时PCR检测技术具有灵敏度高、特异性高等特点，且该方法3h即可获知结果，使用方法简单。
生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术，按照检测对象分为蛋白质芯片和基因芯片。基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用，特异性强，重现性好，直接针对病原体基因进行，结果更准确，且还具有检测通量大而所需样本量少等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的艰难梭菌检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
本发明实现其目的的技术方案为：一种艰难梭菌检测并联探针，包括探针1、2、3、4、5，序列分别为SEQ ID NO.1~5。
一种艰难梭菌检测基因芯片，包括固体相和上述的探针组。
作为优选地，上述固相载体为氨基修饰的玻璃基片。
一种艰难梭菌检测试剂盒，包括上述的基因芯片。
在上述艰难梭菌检测试剂盒中，还包括艰难梭菌靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
作为优选地，所述引物对的下游引物的5’端含有CY3荧光染料标记。
作为优选地，上述艰难梭菌检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、洗涤液、艰难梭菌菌液阳性对照样本、人DNA TAE溶液空白对照样本。
在上述技术方案中，PCR反应体系包括：50~150ng/μL的扩增模板 0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8~12μM的上、下游引物各0.2μL。
一种艰难梭菌的检测方法，使用前述的艰难梭菌检测试剂盒进行检测，当5个检测探针中的3个及以上探针显示的结果为阳性时可以判断样品感染艰难梭菌；当5个检测探针中低于3个探针显示的检测结果为阳性，无法判断该样品是否感染艰难梭菌，应当使用重复测试或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。
作为优选地，PCR扩增反应程序为95℃ 5min；95℃10s、55℃ 30s、72℃30s、30个循环；72℃ 10min。
本发明的有益效果是：设计5条高特异性的探针，当5个检测探针中的3个及以上探针显示的结果为阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳性问题；本发明通过 PCR 技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过CY3荧光染料标记，直观的表现检测结果，检测艰难梭菌与常规方法相比较，检测快速、结果准确、操作简单。
附图说明
图1为检测艰难梭菌的基因芯片的示意图；
图2为待测样品PCR产物电泳条带图（1-15：待测样本；M: 10000 bp marker）。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂及生产者：氨基修饰的玻璃基片（武汉阳达生物科技有限公司），细菌基因组 DNA/RNA 共提试剂盒（TAKARA公司，日本），Cy3标记引物（英潍捷基(上海)贸易有限公司），Premix Taq（TAKARA公司，日本）：成分为PrimeSTAR HS DNA Polymerase，dNTP Mixture，PrimeSTAR Buffer。
引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。
实施例1 目的片段引物与探针设计
查找NCBI数据库中艰难梭菌的基因序列，选择高特异性的基因序列作为靶序列（ID号为：NC_009089.1），设计引物与探针。靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计艰难梭菌靶基因的扩增引物与探针，在艰难梭菌靶基因扩增引物的R引物 5’端用Cy3进行标记，具体序列如下：
C-DIFF靶序列扩增引物：
F引物（C-DIFF-F）：5’- gagagtttgatyctggctcag-3’（SEQ ID NO.8）；
R引物（C-DIFF-R）：5’-Cy3- aaggaggtgatccarccgca-3’（SEQ ID NO.9）。
C-DIFF并联探针：
C-DIFF探针1：
5’-ttttttttttttttttcagcaacgccgcgtgagtgatgaaggccttcgggtcgtaa-3’（SEQ ID NO.1）
C-DIFF探针2：
5’-ttttttttttttttttaccagttgcgaaggcggctctctggactgtaactgacgct-3’（SEQ ID NO.2）
C-DIFF探针3：
5’-ttttttttttttttttggttacccccttcggtgccgcagctaacgcattaagtact-3’（SEQ ID NO.3）
C-DIFF探针4：
5’-ttttttttttttttttattcgaagcaacgcgaagaaccttacctaagcttgacatc -3’（SEQ ID NO.4）
C-DIFF探针5：
5’-ttttttttttttttttgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctt-3’（SEQ ID NO.5）
阳性质控探针
5’- tttttttttttttttccgatagtgaaccagtacc -3’（SEQ ID NO.6）
阴性质控探针
5’- tttttttttttttttctatctagctagctagctagcta -3’（SEQ ID NO.7）
实施例2 芯片的制备
将实施例1中C-DIFF的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上，得到含有探针的基因芯片（如图1所示）。探针浓度为30uM，每个点0.2uL，然后80℃孵育1.5小时。
表1 艰难梭菌检测芯片探针排列顺序
实施例3 检测方法
1、待测样品基因组提取
使用病毒基因组DNA/RNA 共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基因组作为扩增模板。
2、PCR扩增目的片段
经过大量实验摸索，确定C-DIFF检测的靶基因PCR扩增体系和PCR反应程序。总体积为10 μL的PCR扩增体系含有如下试剂：
PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃10s、55℃ 30s、72℃30s、30个循环；72℃ 10min。
3、PCR产物与芯片杂交
按照如下步骤操作：a. 在实施例2中制备好的基因芯片上，将待测样品的PCR扩增产物点样到5个探针的检测孔中，同时，将阳性对照样本与空白对照样本PCR产物，对应加入阳性对照与空白对照检测孔中。具体步骤为：PCR产物95℃解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产物与杂交缓冲液（50%甲酰胺，10×SSC，0.2%SDS）等体积混合，每孔点10微升混合液，在湿盒中，于60℃杂交孵育2小时。b. 取出孵育后的基因芯片，用洗涤液（0.3×SSC缓冲液）清洗3次。c. 将芯片放入激光共聚焦检测仪（GenePix）在650nm处扫描芯片；软件分析荧光信号强度值，给出结果。
实施例4 检测待测样品
从第三军医大学获取感染了艰难梭菌的样本15份（膝关节积液），按照实施例1和3中的引物和方法分别提取待测样品的基因组，进行PCR扩增后，使用实施例2中的基因芯片进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带表明本发明设计的艰难梭菌靶序列扩增引物特异性高，能特异、灵敏地扩增出目标基因（如图2所示）。
对于感染了艰难梭菌的样品，激光共聚焦检测仪（GenePix）在650nm处扫描芯片，探针点荧光信号较强(大于40)，记为（+），荧光信号较弱(小于5)，则记为（-），荧光信号强度难以分辨（10-40）则记为（*）。检测中同时设置阳性和空白对照。判断检测结果时，当5个检测探针中的3个及以上探针显示的结果为阳性时可以判断样品感染艰难梭菌；当5个检测探针中低于3个探针显示的检测结果为阳性，无法判断该样品是否感染艰难梭菌，可使用现有其它技术（比如Elisa方法）进一步检测验证。检测结果如表2所示。
表2 样本检测结果
使用本发明方法检测的15份已知阳性样品中，每份样品基因芯片上的5个并联探针均显示阳性，与实际情况相符。
本发明公开的探针、基因芯片、试剂盒，特异性高、结果非常准确，检测快速、工作效率高，操作简单，满足医院等的现场检测需求，为诊断艰难梭菌感染提供可靠的实验依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛市胶州中心医院
<120> 艰难梭菌检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
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