在生产宿主中同时整合抗体/蛋白的性能和表达的筛选和演化的方法
本申请要求于2009年7月17日提交的美国临时申请第61/271,168号的优先权；本申请是于申请日为2010年07月16日的中国专利申请第201080038839.4号的分案申请。
本申请是以一家美国国有公司BioAtla，LLC的名义请求指定除了美国以外的所有国家，及以一位美国公民Jay Milton Short的名义请求仅指定美国，于2010年7月16日提交的PCT国际专利申请，并要求于2009年7月17日提交的美国临时申请第61/271,168号的优先权，其全部内容通过参考并入于此。
技术领域
在一个具体方面，本发明涉及蛋白和通过蛋白演化优化蛋白。使用相同的遗传系统，在同一宿主中发现、演化和生产治疗性蛋白药物。
背景技术
已设计、开发和实施了能产生候选治疗性蛋白分子的多种抗体和其它蛋白系统。最近，已开发出多种演化系统以改善蛋白的功能。另外，已开发出用于高产量生产治疗用抗体和其它蛋白的哺乳动物表达系统。迄今为止，还没有研究组开发出一种系统，使得能在同一高效哺乳动物表达系统中生成、演化抗体或蛋白，并生产/制备蛋白。
使用细菌噬菌体展示系统，在细菌中开发了许多抗体，而全长抗体主要在哺乳动物细胞中进行表达。这种相似性的缺乏，使得演化或筛选用于表达的克隆成为不可能。其它的障碍包括采用传统技术而在传统上要求有大量供筛选的突变体，并要求已经进行优化以用于表达的高水平哺乳动物表达系统，而不是突变体的大量克隆。以前没有设计出一种整合了抗体/蛋白的筛选、演化和哺乳动物表达的系统。在哺乳动物宿主细胞中使用表面展示技术用于处理大量的分子，同时整合了在优化的哺乳动物宿主细胞内抗体/蛋白的非随机演化，增加了成功的可能性，并大大加快了在生产中想要的在哺乳动物细胞中能够以足够高水平表达的、优化的抗体/蛋白的产生进程。
发明概要
本发明提供在真核宿主，如哺乳动物细胞宿主或酵母细胞宿主中整合了治疗性蛋白(包括抗体)的产生和/或筛选，演化和表达的方法，以实现在单一系统中生产。在同一真核宿主系统中产生、优化并生产治疗性蛋白，包括抗体。本发明公开的综合性整合的抗体优化系统(CIAO！TM)(system of Comprehensive Integrated Antibody Optimization)可同时进行蛋白性能和表达优化的演化。
在一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物细胞生产宿主中筛选、演化和表达抗体的方法；该方法包括采用抗体细胞表面展示技术，在哺乳动物细胞生产宿主中生成抗-抗原抗体库；从所述库中筛选出具有至少一种预定属性、特性或活性的库；从该库中筛选出模板抗体；采用抗体细胞表面展示技术在哺乳动物生产宿主中演化所述模板抗体以产生一组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的突变抗体；从该组突变抗体中筛选出，与所述模板抗体相比，具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性的增强型突变抗体(up-mutant antibody)；在与生成步骤中所用相同的哺乳动物生产宿主中表达所述增强型突变抗体。在一个方面，所述抗原是预先筛选出的。在另一个方面，所述抗-抗原抗体库是人源化的抗-抗原抗体库。
在一个方面，所述哺乳动物细胞生产宿主选自下组：3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞、MDCK细胞、狗上皮细胞、Hela人类上皮细胞、PtK1鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠血浆细胞及NS0小鼠血浆细胞、HEK 293人胚肾细胞、COS猴肾细胞、CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞、R1小鼠胚胎细胞、E14.1小鼠胚胎细胞、H1人类胚胎细胞、H9人类胚胎细胞、PER C.6、人类胚胎细胞、酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞。在一个具体的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S或HEK293。在一个方面，所述筛选步骤使用荧光激活细胞分选(FACS)。
在另一个方面，所述演化步骤包括由含m个互补决定区(CDR)的所述模板抗体生成一组突变抗体，其中m为整数1-6，每个所述CDR包括n个氨基酸残基，该方法包括：分别生成m×n个抗体组，每组所包括的抗体成员在CDR的单个预定位置上含X个不同的预定氨基酸残基；其中每组抗体在单个预定位置上不同；以及所形成的不同抗体成员的数目等于m×n×X。在一个具体的方面，m是6。
在一个方面，所述演化步骤包括由所述模板抗体生成n-1个分离的突变多肽组，每组所包括的多肽成员在所述多肽的单个预定位置上含X个不同的预定氨基酸残基；其中每组多肽在单个预定位置上不同；以及所形成的不同多肽成员的数目等于[n-1]×X。在一个方面，X代表在所述模板多肽的给定位置上不存在的天然存在的19个氨基酸残基。
在另一个方面，所述筛选步骤包括检测每个多肽成员，筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的多肽；确定该多肽成员相对于所述模板多肽在所述属性、特性或活性方面的任何变化；绘制功能图谱，其中所述功能图谱是用于确定在所述突变多肽中，与模板多肽相比，产生增强型突变和/或沉默突变的位置和突变。
在另一个方面，所述的功能图谱是用来确定选自下组的一种或多种位置和突变：(a)与所述模板多肽相比，不影响该突变多肽活性的位置和突变；(b)与所述模板多肽相比，完全突变的位点；以及(c)与所述模板多肽相比，产生增强型突变的位置和突变。
在另一个方面，所述抗体片段选自重链、轻链、可变域、恒定域、高变区、互补决定区1(CDRl)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。
在另一个方面，所述生成步骤包括对含有编码所述模板多肽的密码子的多核苷酸进行聚合酶扩增反应，每个待突变的密码子使用64倍简并寡核苷酸，其中每个所述的64倍简并寡核苷酸是由第一同源序列和简并N,N,N三联体序列组成的，从而生成一组子代多核苷酸；以及对所述子代多核苷酸进行克隆扩增，使由子代多核苷酸编码的多肽得以表达。
根据权利要求1所述的方法，其中所述预定的属性、特性或活性选自下组：蛋白-蛋白聚集下降、蛋白稳定性增强、蛋白溶解度增加、糖基化位点的引入、结合位点的引入、免疫原性下降、蛋白表达增强、抗原亲和力增加、抗原亲和力下降、结合亲和力的变化、免疫原性的改变或特异性增强。
在另一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物细胞生产宿主中演化和表达抗体的方法，该方法包括：筛选出模板抗体；采用抗体细胞表面展示技术在哺乳动物细胞生产宿主中演化所述模板抗体，以产生一组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的突变抗体；从该组突变抗体中筛选出，与所述模板抗体相比，具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性的增强型突变抗体；以及在与演化步骤中所用相同的哺乳动物细胞生产宿主中表达所述的增强型突变抗体。
在一个方面，所述筛选步骤包括绘制功能图谱，其中所述功能图谱是用于确定在所述突变多肽中，与模板多肽相比，产生增强型突变和/或沉默突变的位置和突变。在另一个方面，所述筛选步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。
在一个方面，所述哺乳动物细胞生产宿主选自：3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞(Syrian hamster fibroblast cell)、MDCK细胞、狗上皮细胞、Hela人类上皮细胞、PtK1鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠血浆细胞及NS0小鼠血浆细胞、HEK 293人胚肾细胞、COS猴肾细胞、CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞、R1小鼠胚胎细胞、E14.1小鼠胚胎细胞、H1人类胚胎细胞、H9人类胚胎细胞以及PER C.6、人类胚胎细胞。在一个具体的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S或HEK293。在另一个方面，所述细胞生产宿主为CHOK1SV或NSO宿主细胞系。
在另一个实施方案中，本发明提供在真核细胞生产宿主中演化和表达蛋白的方法，该方法包括：筛选出模板抗体；在真核细胞生产宿主中演化所述模板抗体，以产生一组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的突变抗体；从该组突变抗体中筛选出，与所述模板抗体相比，具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性的增强型突变抗体；以及在与演化步骤中所用相同的真核细胞生产宿主中表达所述的增强型突变抗体，以实现任何商业化规模的生产。
在一个实施方案中，本发明提供在细胞生产宿主中演化和生产人类蛋白的方法，该方法包括：在选自细菌或真核生产宿主之一的细胞生产宿主中生成人类蛋白库；从所述库中筛选具有至少一种预定属性、特性或活性的库；从该库中筛选出具有至少一种预定属性、特性或活性的模板人类蛋白；在细胞生产宿主中演化所述模板人类蛋白，以产生一组突变人类蛋白；从所述突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的人类蛋白，并筛选出改变的表达型；从该组突变人类蛋白中筛选出(1)具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性，以及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达型改变的增强型突变人类蛋白；以及在与生成步骤中所用相同的生产宿主中生产所述人类蛋白，包括表达该增强型突变人类蛋白。
另一个方面，所述演化步骤包括选自以下演化技术中的一种：综合性定位演化(CPE)；综合性定位插入演化(CPI)；综合性定位缺失演化(CPD)；综合性定位演化(CPE)，然后是组合蛋白合成(CPS)；综合性定位缺失演化(CPD)以及随后的组合蛋白合成(CPS)；或综合性定位缺失演化(CPD)以及随后的组合蛋白合成(CPS)。
在一个方面，所述的人类蛋白是抗体。在另一个方面，所述的抗体为全长抗体。
在另一个方面，筛选步骤(e)中所述的具有至少一种预定的属性、特性或活性包括，与所述模板抗体相比，(1)筛选沉默突变以及(2)筛选错义突变中的一种或多种。
在另一个方面，演化出的所述抗体的一个或多个部位选自Fc和Fv，框架区，以及与所述模板人类抗体相比，在所述增强型突变抗体中的一种或多种CDR是修饰的。
在另一个方面，所述筛选步骤包括从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的人类蛋白，同时筛选出改变的表达型。
在又一个的方面，所述用于演化和生产的人类蛋白选自酶细胞因子、受体、DNA结合蛋白、螯合剂或激素。
在另一个方面，所述细胞生产宿主是真核细胞生产宿主，且演化步骤包括采用细胞表面展示技术，在真核细胞生产宿主中演化所述模板人类蛋白，以生产一组突变人类蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供在真核细胞生产宿主中演化出表达提高的人类蛋白并生产人类蛋白的方法，该方法包括：筛选出用于演化的模板人类蛋白；在生产宿主中演化该模板人类蛋白，包括生成编码该模板人类蛋白的突变密码子，以产生一组突变人类蛋白；从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定属性、特性或活性的人类蛋白，并筛选与所述模板人类蛋白相比，表达增强的人类蛋白；从该组突变人类蛋白中筛选出(1)保留或优化了至少一种预定的属性、特性或活性，及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达增强的增强型突变人类蛋白；以及在与演化步骤中所用相同的生产宿主中生产所述增强型突变人类蛋白，包括表达所述增强型突变人类蛋白。
在一个方面，所述增强型突变人类蛋白的突变密码子产生至少一种沉默突变和/或错义突变。在另一个方面，所述增强型突变人类蛋白的突变密码子产生至少一种沉默突变。
在又一个方面，所述模板人类蛋白是经过批准的处方治疗性蛋白药物(ethical protein therapeutic drug)，且所述增强型突变人类蛋白是生物仿制药(biosimilar)。
在另一个方面，所述筛选步骤包括从该组突变人类蛋白中筛选出(1)具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性，以及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达增强的增强型突变人类蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供鉴定和生产目标人类蛋白的方法，该方法包括：采用蛋白细胞表面展示技术，在真核细胞生产宿主中生成人类蛋白库；从所述库中筛选具有至少一种预定的属性、特性或活性的库；从该库中鉴定出具有至少一种预定的属性、特性或活性的目标人类蛋白；以及在与生成步骤中所用相同的真核细胞生产宿主中表达该目标人类蛋白以生产目标人类蛋白。在一个方面，所述目标人类蛋白是抗体。在另一个方面，所述抗体是全长抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供在生产宿主中演化人类蛋白的方法，该方法包括：在生产宿主中突变模板人类蛋白，以产生一组突变人类蛋白；从该组突变的子代蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的蛋白。在一个方面，该方法进一步包括从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的增强型突变人类蛋白。在另一个方面，该方法进一步包括在与突变步骤中所用相同的生产宿主中生产所述增强型突变人类蛋白，包括表达所述增强型突变人类蛋白。在另一个方面，所述筛选步骤进一步包括：从该组突变人类蛋白中筛选出(1)与所述模板人类蛋白相比，具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性，以及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达改变的增强型突变人类蛋白。在一个方面，所述改变的表达是增强的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供在细胞生产宿主中演化并生产人类蛋白的方法，该方法包括：在生产宿主中突变模板人类蛋白，以产生一组突变人类蛋白；从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的人类蛋白，并筛选出改变的表达型；从该组突变人类蛋白中筛选出(1)具有优化的至少一种预定的属性、特性或活性，及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达改变的增强型突变人类蛋白；以及在与突变步骤中所用相同的生产宿主中生产所述增强型突变人类蛋白，包括表达所述增强型突变人类蛋白。
在又一个实施方案中，本发明提供在真核细胞生产宿主中演化表达增强的人类蛋白并生产人类蛋白的方法，该方法包括：在生产宿主中突变该模板人类蛋白，包括生成编码该模板人类蛋白的突变密码子，以产生一组突变人类蛋白；从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定属性、特性或活性的人类蛋白，并筛选与所述模板人类蛋白相比，表达增强的人类蛋白；从该组突变人类蛋白中筛选出(1)保留或优化了至少一种预定的属性、特性或活性，及(2)与所述模板人类蛋白相比，表达增强的增强型突变人类蛋白；以及在与突变步骤中所用相同的生产宿主中生产所述增强型突变人类蛋白。
在一个方面，所述筛选步骤包括从该组突变人类蛋白中筛选出具有至少一种预定的属性、特性或活性的人类蛋白，同时筛选出增强的表达型。
附图说明
图1提供在真核宿主，如哺乳动物细胞宿主或酵母细胞宿主中整合了治疗性蛋白(如抗体)的产生和/或筛选，演化和表达，以实现在单一系统中生产的CIAO！TM法的示意图。
图2表明综合性定位演化平台(CPETM)是如何用来产生特异性分子数据库(EvoMapTM)的。
图3展示了可用于结合来自CPETM的增强型增强型突变增强型突变的综合性定位合成平台(CPSTM)的示意图。
图4展示了综合性定位插入(CPITM)演化的示意图。
图5表明了演化方法的一种结合：对来自CPITM演化的加长的核酸进行综合性定位演化(CPETM)，并用于生成特异性分子数据库(EvoMapTM)。
图6展示了综合性定位缺失(CPDTM)演化的示意图。
图7表示演化方法的另一种结合：对来自CPDTM演化的缩短的核酸进行综合性定位演化(CPETM)，并用于生成特异性分子数据库(EvoMapTM)。
术语的定义
为了便于理解本文提供的实施例，将对某些反复出现的方法和/或术语进行说明。
本文使用的术语“制剂”表示多肽、多肽的混合物、空间定位化合物阵列(an array of spatially localized compounds)(例如，VLSIPS肽阵列、多核苷酸阵列和/或组合小分子阵列)、生物大分子、噬菌体肽展示库、噬菌体抗体(例如，scFv)展示库、多核糖肽库或来自生物材料，如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织的提取物。通过包括下文所述的筛选试验来评价制剂作为抗肿瘤药物、抗炎药物或细胞凋亡调节剂的潜在活性。通过包括下文所述的筛选试验来评价制剂作为特异性蛋白相互作用抑制剂(即选择性抑制两个预定的多肽之间的结合相互作用，但并不严重干扰细胞活力的制剂)的潜在活性。
本文使用的术语“氨基酸”是指任何含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的有机化合物；优选作为自由基团或聚合后作为肽键的一部分。“二十个自然编码的多肽形成的α-氨基酸”在本领域中应理解为且指：丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天门冬酰胺(asn或N)、天门冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gln或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、蛋氨酸(met或M)丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(trp或W)、酪氨酸(tyr或Y)和缬氨酸(val或V)。
术语“扩增”是指多核苷酸的拷贝数增加。
本文使用的术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子以及能够结合抗原表位的免疫球蛋白分子片段，如Fab、Fab'、(Fab')2、Fv和SCA片段。可使用本领域众所周知的方法制备这些保留了一定的选择性结合由抗原衍生的抗体的抗原(例如，多肽抗原)的能力的抗体片段(例如见，Harlow和Lane，见上)，并进一步描述如下。采用免疫亲和层析可将抗体用于分离预定量的抗原。这种抗体的其它各种用途为诊断和/或诊断疾病时期(如瘤)和针对疾病，例如：肿瘤、自身免疫性疾病、艾滋病、心血管疾病、感染等的治疗性应用。嵌合的、类似人类的、人源化的或完全的人类抗体特别适用于人类患者给药。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并可以通过木瓜蛋白酶消化整个抗体分子以产生由完整的轻链与部分重链组成的片段而得到。
可通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子，然后还原以产生由完整的轻链与部分重链组成的分子来获得抗体分子的Fab'片段。以这种方式处理每个抗体分子将获得两个Fab'片段。
可通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子而后不经过还原来获得抗体的(Fab')2片段。(Fab')2片段是两个Fab'片段通过两个二硫键连接在一起形成的二聚体。
Fv片段定义为包含轻链可变区和重链可变区且表达为两条链的基因工程片段。
单链抗体(“SCA”)为包含轻链可变区和重链可变区且由合适的、柔性线状多肽(polypeptide liner)连接的基因工程单链分子。
术语“生物仿制药(biosimilar)”，又称作“仿制生物制品(follow-on biologic)”，是指专利或专营权届满后，得到官方批准的原研生物药剂制品(innovator biopharmaceutical products)的新产品。
术语“细胞生产宿主”或“生产宿主”是指用于产生或生产蛋白的细胞系。真核细胞，如哺乳动物细胞，包括但不限于人类、小鼠、仓鼠、大鼠、猴细胞系以及酵母、昆虫和植物细胞系。原核细胞也可加以利用。在一个方面，哺乳动物细胞生产宿主是选自下组的成员：3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞(Syrian hamster fibroblast cell)、MDCK细胞、狗上皮细胞、Hela人类上皮细胞、PtK1鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠血浆细胞及NS0小鼠血浆细胞、HEK 293人胚肾细胞、COS猴肾细胞、CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞、R1小鼠胚胎细胞、E14.1小鼠胚胎细胞、H1人类胚胎细胞、H9人类胚胎细胞、PER C.6、人类胚胎细胞。在另一个方面，所述细胞生产宿主是GS-NSO或GS-CHOK1细胞系。在另一个方面，所述细胞生产宿主选自酿酒酵母细胞以及毕赤酵母细胞。在另一个方面，所述细胞生产宿主是细菌细胞系。
具有“嵌合属性”的分子是指分子：1)与第一参考分子部分同源和部分异源；2)同时与第二参考分子部分同源和部分异源；而不3)排除同时与一种或多种其它参考分子部分同源和部分异源的可能性。在非限制性的实施方案中，可通过组装重新排列的部分分子序列来制备嵌合分子。在非限制性的方面，可使用多种分子模板通过合成嵌合多核苷酸来制备嵌合多核苷酸分子，由此产生的嵌合多核苷酸具有多种模板的属性。
本文使用的术语“同源”是指物种之间进化和功能相关的基因序列。例如，但不限于，在人类基因组中，人类CD4基因是小鼠3d4基因的同源基因，因为这两个基因的序列和结构表明，它们具有较高的同源性，这两个基因编码的蛋白在由MHCⅡ类限制性抗原识别的T细胞激活的信号转导中发挥功能。
术语“商业规模”是指以用于转售的适当规模生产蛋白或抗体。
本文使用的“比较窗口”，是指至少20个连续核苷酸位置的概念区段(conceptual segment)，其中多核苷酸序列可与至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较，且其中比较窗口中所述多核苷酸序列部分可包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比20％或以下的添加或缺失(即空位)，用于这两条序列的最佳比对。比较窗口的序列最佳比对可依照Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482局部同源算法，依照Needlemen和Wuncsch J.MoI.Biol.48:443(1970)同源比对算法，依照Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)相似性搜索法，这些算法的计算机化(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过检查，以及通过选择的各种方法产生最佳比对(即，在比较窗口中形成同源性最高百分比)。
本文使用的术语“互补决定区”和“CDR”是指由Kabat和Chothia例证的本领域公认的术语。CDR的定义，一般也被称为高变区或高变环(Chothia和Leks,1987；Clothia等,1989；Kabatv等,1987；以及Tramontano等,1990)。可变区域通常包括天然存在的免疫球蛋白链(如氨基酸1-110)氨基末端的约105-115个氨基酸，尽管更短或更长的可变域也适合形成单链抗体。所述CDR是免疫球蛋白上决定所述分子特异性并与特定的配体接触的部分。所述CDR是该分子上最可变的部分并促成了这些分子的多样性。每个V域中有三个CDR区，CDRl、CDR2和CDR3。CDR-H是指可变重链的CDR区，CDR-L涉及可变轻链的CDR区。H表示可变重链，L表示可变轻链。Ig衍生的CDR区可如Kabat(1991).免疫学目标蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,NIH公开号91-3242U.S.美国卫生和公众服务部(Department of Health and Human Services),Chothia(1987)J.MoI.Biol.196,901-917和Chothia(1989)自然,342,877-883中的描述来确定。
本文使用的术语“综合性”是指演化技术，其中在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上进行每一种可能的变化，并检测所述多核苷酸或多肽以确认已发生的变化。
“保守氨基酸替换”是指具有相似侧链残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸替换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文使用的术语“对应于”表示的是多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即是相同的，不是严格演化相关的)，或者说，多肽序列与参考多肽序列是相同的。相比之下，本文使用的术语“互补”表示所述互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。举例说明，核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC”相对应，且与参考序列“GTATA”互补。
术语“降解有效”量是指与不接触酶的底物相比，加工至少50％底物所需的酶量。优选地，至少80％底物被降解。
本文使用的术语“确定的序列框”是指在非随机的基础上，一般基于实验数据或结构数据而选择的一组具体的序列；例如，确定的序列框可包括一组预测将形成β-片层结构的氨基酸，或可包括除其它变化形式外的亮氨酸拉链七肽重复基序、锌指域。“确定的序列核”是包括可在有限范围内变化的一组序列。而(1)20种常规氨基酸的完全随机的10-mer序列可以是任意(20)10序列，及(2)20种常规氨基酸的伪随机10-mer序列可以是在某些位置和/或整条序列上倾向于某些残基的任意(20)10序列，(3)如果每个残基位置允许为20种常规氨基酸(和/或允许的非常规氨基酸/亚氨基酸)中的任一种，则确定的序列核是序列的亚组(subset)。在单个选定的库成员序列的片段或全长中，确定的序列核心一般包括可变和不可变的残基位置和/或包括含有选自确定的氨基酸残基亚组的残基的可变残基位置等。确定的序列核心可以指氨基酸序列或多核苷酸序列。举例但不限于，序列(NNK)10和(NNM)10，其中，N代表A、T、G或C，K代表G或T，且M代表A或C，为确定的序列核心。
本文使用的术语“脱免疫”涉及所述模板结合分子的变体的生产，与原始野生型分子相比，所述变体经过修饰，使得其在人体内无免疫原性或减少了免疫原性。本发明的脱免疫分子涉及非人类源的抗体或其部分(如框架和/或CDR)。对应的实例是描述于US4,361,549中的抗体或其片段。术语“脱免疫”还涉及到具有减少的产生T细胞抗原表位倾向的分子。根据本发明，术语“减少的产生T细胞抗原表位倾向”涉及到T-细胞抗原表位的去除，从而导致特定T-细胞的激活。
此外，减少的产生T细胞抗原表位倾向是指有助于形成T细胞抗原表位的氨基酸的替代，即，对于T细胞抗原表位的形成是至关重要的氨基酸的替换。换言之，减少的产生T细胞抗原表位倾向涉及免疫原性下降或诱导抗原非依赖性T细胞增殖的能力下降。此外，减少的产生T细胞抗原表位倾向涉及到脱免疫，这表示诱导抗原非依赖性T细胞增殖的氨基酸序列的潜在T细胞抗原表位的缺失或减少。
本文使用的术语“T细胞抗原表位”涉及到胞内肽、多肽或蛋白在降解过程中释放出的短肽，并随后由主要组织相容性复合体(MHC)的分子呈递以触发T细胞激活，特别见于WO 02/066514中。对于由Ⅱ类MHC呈递的肽而言，这种T细胞活化可随后通过直接刺激B细胞产生所述抗体从而引发抗体反应。
DNA的“消化”是指用仅在DNA的某些序列上发挥作用的限制性酶催化的DNA断裂。本文使用的各种限制性酶为市售获得，且它们所用的反应条件、辅酶因子和其它所需条件是本领域普通技术人员已知的。为了进行分析，1μg质粒或DNA片段通常使用在约20μl缓冲液中的约2个单位的酶。为了分离出用于构建质粒的DNA片段，一般用在更大体积中的20-250个单位的酶消化5-50μg DNA。
适合于特定限制性酶的缓冲液和底物量是由制造商指定的。通常使用的孵育时间为37℃约1小时，但可根据供应商的建议有所变化。消化后，反应物直接进行凝胶电泳，分离出所需的片段。
本文使用的“DNA改组”表示在大致上同源但不完全相同的序列之间的重组，在一些实施方案中，DNA改组可包括通过非同源重组，如通过cer/lox和/或flp/frt系统等进行交换(crossover)。DNA改组可以是随机的或非随机的。
本发明使用的术语“抗原表位”是指抗原上的抗原决定簇，如植酸酶多肽，抗体如植酸酶的特异性抗体的互补位可与其结合。抗原决定簇通常由分子的表面化学活性基团，如氨基酸或糖侧链组成，且可以有特定的三维结构特点以及特定的带电特性。本文使用的“抗原表位”是指抗原或其它高分子上能形成结合相互作用的那部分，其与抗体的可变区结合体(binding body)发生相互作用。通常情况下，这种结合相互作用表现为CDR的一个或多个氨基酸残基发生分子间接触。
术语“演化”是指，与模板蛋白或抗体相比，基因工程改造的或综合修饰的蛋白或抗体的至少一种属性、特性或活性发生变化。
当涉及到参考多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”包括保留了至少一种至少基本上与参考多肽相同的生物学功能或活性的多肽。此外，术语“片段”、“衍生物”或“类似物”的典型实例是原形式(pro-form)”分子，如可由切割修饰而产生具有显着高活性的成熟酶的低活性前体蛋白。
本文提供从模板多肽产生其中在每个氨基酸位置表现为“全部单个氨基酸替换”的一组子代多肽的方法。本文使用的“全部单个氨基酸替换”是指如本文所述的形成自然编码的多肽的20个自然编码的α-氨基酸。
术语“基因”是指生产多肽链所涉及的DNA片段，它包括编码区前面和编码区后面的区域(前导序列和拖尾序列)，以及单个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
本文使用的“遗传不稳定性”是指通过减少事件(reductive events)的过程高度重复序列丢失的自然倾向，一般涉及到通过重复序列的丢失使序列简化。缺失往往涉及重复序列单拷贝的丢失和重复序列之间的一切丢失。
术语“异源”是指单链核酸序列无法与另一条单链核酸序列或它的互补序列进行杂交。因此，异源区是指多核苷酸区或多核苷酸的序列中含有无法与另一条核酸或多核苷酸杂交的区域(area)或区(region)。这些区(region)或区域(area)的实例如突变区。
术语“同源(homoologous)”或“部分同源(homeologous)”是指单链核酸的核酸序列可与互补的单链核酸序列进行杂交。杂交的程度可能取决于许多因素，包括序列之间相同碱基的数目和杂交条件，如后面讨论的温度和盐浓度。优选相同区大于约5bp，更优选相同区大于约10bp.
术语“人源化”用来描述抗体，其中来自哺乳类动物，如小鼠的互补决定区(CDR)与人类框架区相结合。通常将编码独立CDR的多核苷酸移植(graft)到编码合适的可变区框架(任选恒定区)的多核苷酸上，以形成编码完整抗体(如，人源化或完全人类)、抗体片段等的多核苷酸。在另一个方面，除了小鼠抗体，其它物种可以被人源化，例如，其它啮齿动物、骆驼、兔、猫、狗、猪、马、牛、鱼、美洲驼和鲨鱼。在广阔的方面，任何产生抗体的物种可用于生产人源化抗体。此外，为了减少其潜在的抗原性，而不降低它们对靶标的亲和力，本发明的抗体可以为嵌合的，类人类的、人源化的或完全人类的抗体。嵌合的，类人类的和人源化的抗体通常为如本领域所述。通过在杂合抗体中整合尽可能少的外源序列来降低抗原性。可采用本领域众所周知的方法来制备这些杂合抗体。
另一方面，为了给受体物种提供治疗，同时保护它们免受负免疫反应，使人类或小鼠抗体适应不同的受体物种，如濒临灭绝的物种。在这方面，使用来自受体物种的框架与已知的或第二物种抗体的CDR相结合。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区，也称为CDR隔开的“框架”区的组成。框架区和CDR的范围已被精确的定义(见“免疫学目标蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，Kabat等，1987)。物种内不同的轻链或重链框架区的序列相对保守。本文使用的“人的框架区”与天然存在的人类免疫球蛋白的框架区大致相同(约85或以上，通常90-95或以上)。由轻链和重链组成的结合的抗体框架区用于定位和比对CDR。CDR主要负责结合抗原表位。按照本发明，框架区涉及到免疫球蛋白的V域(VH或VL域)中的区，其为与所述抗原接触的高变互补决定区(CDRS)提供了蛋白骨架。在每个V域，有四个框架区，称为FRL、FR2、FR3和FR4。框架区1包括从V域的N-末端到CDRl的起始，框架区2涉及CDRl和CDR2之间的区域，框架区3包括CDR2和CDR3之间的区域，以及框架区4是指从CDR3的末端到V域的C-末端，特别见于，Janeway,免疫生物学(Immunobiology),Garland出版社，2001年，第5版。因此，所述框架区包括VH或VL域中CDR区以外的所有区。
本领域技术人员很容易在某个位置从给定的序列推断出框架区和CDR，参见Kabat(1991)免疫学目标蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,NIH公开号91-3242U.S.美国卫生和公众服务部(Department of Health and Human Services),Chothia(1987)J.MoI.Biol.196,901-917和Chothia(1989)自然,342,877-883。
本发明的益处延及“工业应用”(或工业生产过程)，该术语包括商业产业(或简单产业)中正确的应用以及非商业产业应用(例如，在非营利机构中进行生物医学研究)。相关应用包括在诊断、医药、农业、制造业和学术研究领域中的应用。
术语“相同的(identical)”或“同一性(identity)”是指两条核酸序列具有相同的序列或互补序列。因此，“相同的区域”是指多核苷酸的区(region)或区域(area)相同，或整条多核苷酸与另一条多核苷酸的区域或与所述多核苷酸是相同的或互补的。
术语“分离的”是指该物质从原始环境(例如，如果它是天然存在的，则指的是自然环境)中移出。例如，在活的动物体内存在的自然产生的多核苷酸或酶不是分离的，但是从自然体系中的某些或全部共存的物质中分离出的同样的多核苷酸或酶是分离的。这样的多核苷酸可作为载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或酶可作为组合物的一部分，且仍然可以在这种不是其自然环境的一部分的载体或组合物中是分离的。
“分离的核酸”是指核酸，例如DNA或RNA分子，其不直接与5'和3'侧翼序列相连，而在通常其来源的有机体的天然存在的基因组中是直接相连的。因此，该术语描述，例如，整合至载体，如质粒或病毒载体中的核酸；整合至异源细胞基因组(或同源细胞的基因组中，但与它天然存在的位置不同)中的核酸；及作为分离的分子存在的核酸，例如，通过PCR扩增或限制性酶消化产生的DNA片段，或通过体外转录产生的RNA分子。该术语还描述了形成编码其它可使用的多肽序列的杂合基因一部分的重组核酸，例如融合蛋白的生产。
本文使用的“配体”是指可被特定的受体识别的分子，如随机肽或可变片段序列。作为本领域的一名技术人员应知晓，分子(或大分子复合物)既可以是受体也可以是配体。在一般情况下，具有较小分子量的结合伴侣是指配体，具有较大分子量的结合伴侣是指受体。
“连接”是指在两条双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis等，1982，第146页)。除另有规定外，连接可使用已知的缓冲液和条件来完成，用10个单位的T4DNA连接酶(“连接酶”)连接每0.5μg约等摩尔量的DNA片段。
本文所用的“接头”或“间隔区”是指连接两个分子，如DNA结合蛋白和随机肽的分子或一组分子，并可以使两个分子置于优选的构型中，例如，使得所述随机肽能够以距所述DNA结合蛋白最小的空间位阻与受体结合。
术语“哺乳动物细胞表面展示”是指出于筛选的目的，从而使蛋白或抗体或抗体的一部分在哺乳动物宿主细胞表面表达和展示的技术，例如通过磁珠和荧光激活细胞分选相结合来筛选出特异性的抗原结合。在一个方面，哺乳动物表达载体用于免疫球蛋白同时以分泌的和细胞表面结合的形式表达，参见DuBridge等，US2009/0136950，其通过参考并入于此。在另一个方面，Gao等的技术用于编码抗体或抗体片段库的病毒载体，在细胞中表达时抗体或抗体片段展示于细胞膜上，参见Gao等，US2007/0111260，其通过参考并入于此。整个IgG展示于哺乳动物细胞表面上是已知的。例如，Akamatsuu等基于它们的抗原结合亲和力和生物活性，开发出适合于直接分离IgG分子的哺乳动物细胞表面展示载体。使用衍生自人类孢疹病毒(Epstein-Barr virus)的附加型载体，在细胞表面上展示整个IgG分子的抗体库，并通过磁珠和荧光激活细胞分选相结合的方法来筛选出特异性的抗原结合。从分选的细胞中回收编码具有理想的结合特性的编码抗体的质粒，并转化为用于生产可溶性抗体的形式。Akamatsuu等，J.Immunol.Methods 2007，327(1-2):40-52，其通过参考并入于此。Ho等使用人类胚胎肾细胞293T，其被广泛用于亲和性成熟的单链Fv抗体的细胞表面展示的瞬时蛋白表达。通过单次细胞分选，从大量的表达具有较低亲和力的野生型(WT)抗体的细胞中使表达具有较高亲和力的稀有突变抗体的细胞富集了240倍。此外，对随机的内在抗体热点组合库进行单筛选后，获得了具有增强的CD22结合亲和力的高度富集的突变体。Ho等，通过在人类细胞上展示Fv，分离出具有高亲和力的抗-CD22Fv(Isolation of anti-CD22Fv with high affinity by Fv display on human cells)，Proc Natl Acad Sci，美国，2006年6月20日；103(25)：9637-9642，其通过参考并入于此。
Beerli等，使用直接从人类供体的外周血单核细胞(PBMC)中分离出的，对目标抗原特异的B细胞。从该B细胞库(pool)生成了重组的、抗原特异的单链Fv(scFv)库，并使用辛德毕斯病毒表达系统通过哺乳动物细胞表面展示技术进行筛选。这种方法可通过单轮的FACS分离出抗原特异性抗体。从阳性克隆中分离出重链(HC)和轻链(LC)的可变区(VR)，并产生出作为完整IgG或Fab片段的重组的完全人类抗体。在这种方式中，几个结合Qβ病毒样颗粒(VLP)的超突变的(hypermutated)高亲和力抗体、模型病毒抗原以及尼古丁特异性抗体被分离出来。在细胞培养中，全部抗体呈高表达水平。人类尼古丁特异性mAbs在小鼠模型中进行了临床前验证。Beerli等，通过哺乳动物细胞展示分离出人类单克隆抗体(Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display),Proc Natl Acad Sci美国，2008年9月23日；105(38):14336-14341，其通过参考并入于此。
酵母细胞表面展示也是已知的，例如，见Kondo和Ueda 2004,分子展示的酵母细胞表面展示应用(Yeast cell-surface display-applications of molecular display),Appl.Microbiol.Biotechnol.,64(1):28-40，其描述了例如，利用酿酒酵母的细胞表面工程系统。几个用于在酿酒酵母中表达的代表性展示系统描述于Lee等,2003,微生物细胞表面展示(Microbial cell-surface display,)TRENDS in Bitechnol.21(1):45-52。还参见Boder和Wittrup 1997,用于筛选组合多肽库的酵母表面展示(Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries),Nature Biotechnol.,15(6):553。
术语“生产”是指以足够量产生蛋白，以保证治疗性蛋白的至少I期临床试验或用于监管机构审批诊断蛋白的量。
术语“错义突变”是指单核苷酸发生改变的点突变，其产生编码不同氨基酸的密码子。使氨基酸变为终止密码子的突变，称为无义突变。
本文所用的“待演化的分子属性”包括由多核苷酸序列组成的分子、由多肽序列组成的分子，以及部分由多核苷酸序列且部分由多肽序列组成的分子。特别相关的，但绝不用于限制的待演化的分子属性的实例包括在特定条件下的酶活性，如涉及温度、盐度、压力、pH值以及甘油浓度、DMSO、去污剂和/或在反应环境中所接触的任何其它分子。其它特别相关的--但绝不用于限制的待演化的分子属性的实例包括稳定性--例如，在暴露于特定的环境中一段特定的时间后，残存的分子属性的量，该环境为诸如可能在存储过程中遇到的环境。
术语“进行突变(mutating)”是指在核酸序列中产生突变；当所述突变发生于蛋白编码区的情况下，将导致密码子改变，其可能会或可能不会产生氨基酸的变化。
术语“突变(mutation)”是指野生型核酸序列的变化或肽或多肽序列的变化。这种突变可以是点突变，如转换或颠换。所述突变可能是缺失、插入或重复。
本文使用的简并“N,N,G/T”核苷酸序列表示32种可能的三联体，其中“N”可以是A、C、G或T。
本文使用的简并“N,N,N”核苷酸序列表示64种可能的联体，其中“N”可以是A、C、G或T。
本文使用的术语“天然存在”所适用对象是指可以在自然界中发现的对象的事实。例如，有机体(包括病毒)中存在的、可从自然界来源分离出的、尚未在实验室中被人为修饰的多肽或核苷酸的序列，是天然存在的。一般来说，术语天然存在是指在非病理(未患病)个体中存在的，例如对于该物种是普遍的对象。
本文使用的“核酸分子”由至少一种碱基或一种碱基对组成，取决于其分别为单链或双链。此外，核酸分子可完全地或嵌合地(chimerically)属于任何含有核苷酸的分子，例如但不限于以下核酸分子的组：RNA、DNA、基因组核酸、非基因组核酸、天然存在和非天然存在的核酸及合成的核酸。非限制的实例包括与任何细胞器相关的核酸，如线粒体、核糖体RNA和由一种或多种成分(component)嵌合组成的且不是与自然存在的成分自然共存的核酸分子。
此外，“核酸分子”可部分包含一种或多种非核苷酸成分，例如但不仅限于，氨基酸和糖类。因此，通过举例，但不限于此，部分基于核苷酸和部分基于蛋白的核酶，被认为是“核酸分子”。
此外，通过举例，但不限于此，由可检测的基团，如放射性或者非放射性标签(label)标记的核酸分子，同样被认为是“核酸分子”。
术语“编码特定蛋白的核酸序列”或“编码特定蛋白的DNA序列”或“编码特定蛋白的核苷酸序列”以及其它同义词是指当处于适当的调控序列控制下时，DNA序列被转录和翻译成酶。“启动子序列”是在胞内能够结合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)编码序列转录的DNA调控区。所述启动子是DNA序列的一部分。该序列区在其3'端具有起始密码子。所述启动子序列的确包含最少的碱基数，其对于启动以高于背景的可检测水平进行转录是必要元件(elements)。然而，在RNA聚合酶结合至该序列并从起始密码子处(含启动子的3'端)开始转录后，转录沿3'方向向下游进行。在所述启动子中可发现转录起始位点(可由核酸酶S1的酶切图谱来方便地确定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(一致性序列)。
术语“编码蛋白的核酸”或“编码蛋白的DNA”或“编码蛋白的多核苷酸”和其它同义词包括多核苷酸，其包括仅编码蛋白的序列以及包括其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
在一个优选实施方案中，“特定的核酸分子种类(species)”是由它的化学结构来限定的，例如但不限于，它的一级序列，在另一个优选实施方案中，特定的“核酸分子种类(species)”是通过该核酸种类的功能或通过由该核酸种类衍生的产物的功能来限定的。因此，通过非限制性的实例，“特定的核酸分子种类(species)”可由一种或多种属于它的活性或属性，包括属于其表达产物的活性或属性来限定。
本发明的即时定义“将核酸工作样品组装成核酸库”包括将核酸样品整合至基于载体的集合(collection)中，如连接至载体并转化宿主的过程。相关载体、宿主和其它试剂以及它们的非限制性的实例将在后面描述。本发明的即时定义“将核酸工作样品组装成核酸库”还包括将核酸样品整合至非基于载体的集合中，如连接至接头的过程。优选所述接头可与PCR引物退火，以便于PCR扩增。
因此，在一个非限制性的实施方案中，“核酸库”由基于载体的一种或多种核酸分子的集合(collection)组成。在另一个优选实施方案中，“核酸库”由非基于载体的核酸分子的集合组成。在又一个优选实施方案中，“核酸库”由部分基于载体和部分非基于载体的核酸分子的组合集合组成。优选地，各种核酸分子的含有库的分子集合是可搜索的且可分离的。
本发明提供“核酸构建体”或者“核苷酸构建体”或者“DNA构建体”。本文使用的术语“构建体”用来描述分子，如可任选地化学结合一种或多种其它分子基团，如载体或载体的部分的多核苷酸(例如，植酸酶多核苷酸)。在具体的，但不用来限制的方面，核苷酸构建体的实例为适合于宿主细胞转化的DNA表达构建体。
“寡核苷酸”(或同义地“寡”)是指可化学合成的单链多聚脱氧核苷酸或两条互补的多聚脱氧核苷酸链。这种合成寡核苷酸可含有或不含有5'磷酸。除非在激酶存在下向ATP中添加磷酸，否则那些不含有5'磷酸的合成寡核苷酸不会与另一条寡核苷酸连接。合成寡核苷酸可与没有被去磷酸化的片段连接。为了实现基于聚合酶的扩增反应(如PCR)，需提及“由系列的至少第一同源序列，简并N,N,G/T序列和第二同源序列组成的32倍简并寡核苷酸”。本文使用的“同源的”是指进行基于聚合酶的扩增反应的寡核苷酸和亲本多核苷酸之间的同源性。
本文使用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件(elements)按功能关系进行连接。当核酸被置于与另一条核酸序列的功能关系中时，则它被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响到该编码序列的转录，则它被可操作地连接到编码序列。可操作地连接是指将要连接的DNA序列通常是连续的，且对于连接阅读框中邻近的两个蛋白编码区是必要的。
编码序列与另一条编码序列“可操作地连接”，此时RNA聚合酶将两条编码序列转录为一条mRNA，然后其被翻译成含有源自两条编码序列的氨基酸的一条多肽。该编码序列不必彼此连续，只要所表达的序列最终被加工以产生所需的蛋白。
本文使用的术语“生理条件”是指温度、pH值、离子强度、粘度等与活的有机体相适应的生化指标，和/或通常存在于活的培养酵母细胞或哺乳动物细胞内的生化指标。例如，在常规实验室培养条件下生长的酵母细胞的胞内条件为生理条件。适于体外转录混合物(cocktail)的体外反应条件为生理条件。一般而言，体外生理条件包括50-200mM NaCl或KCl,pH 6.5-8.5,20-45℃和0.001-10mM二价阳离子(例如，Mg++,Ca++)；优选约150mM NaCl或KCl,pH 7.2-7.6,5mM二价阳离子,且通常包括0.01-1.0％的非特异性蛋白(如BSA)。常存在有约0.001-2％，特别是0.05-0.2％(v/v)的非离子型去污剂(吐温,NP-40,Triton X-100)。特殊的水溶液条件可由操作者按照常规方法加以选择。用于一般性的指导，可使用以下缓冲水溶液条件：10-250mM NaCl,5-50mM Tris HCl,pH 5-8及可任选添加二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子去污剂和/或膜组分和/或消泡剂和/或闪烁材料(scintillants)。
本文使用的术语“群体”是指组分如多核苷酸、其部分或多核苷酸或蛋白的集合(collection)。“混合群体”是指属于同一核酸或蛋白家族(即相关的)但其序列不同(即不相同)的组分的集合，因此它们的生物活性不同。
具有“原形式”的分子是指分子经过一种或多种共价和非共价化学修饰(如，糖基化、蛋白水解、二聚化或寡聚化、温度诱导的或pH诱导的构象变化、与辅酶结合等)的组合，以获得与对照的原形式分子相比，具有不同属性的(例如，活性增加)更成熟的分子形式。在成熟分子的产生过程中，当两种或多种化学修饰(例如，两种均为蛋白质水解，或一种为蛋白质水解和一种为去糖基化)可区别开来时，该对照前体分子可称为“原前体形式”的分子。
“属性”可以描述任何特性，包括待优化的蛋白或抗体的任何物理的、化学的或活性特点属性。例如，在某些方面，待优化的预定的属性、特性或活性可选自下组：蛋白-蛋白聚集的减少、蛋白稳定性的增强、蛋白溶解度的增加、蛋白pH稳定性的增加、蛋白温度稳定性的增加、蛋白溶剂稳定性的增加、选择性增强、选择性下降、糖基化位点的引入、结合位点的引入、免疫原性的下降、蛋白表达的增强、抗原亲和力增加、抗原亲和力下降、结合亲和力的变化、免疫原性的变化、催化活性的变化、pH值的优化或特异性增强。“优化的”属性是指分别与模板蛋白、抗体或细胞相比，突变蛋白、抗体或细胞中特定属性的可取的变化。
本文使用的术语“伪随机”是指具有有限变化的一组序列，例如，另一个位置上残基的变化程度，但在任何伪随机位置上允许一定程度的残基变化，然而这种变化是有限的。
本文使用的“准重复单元”是指待重排的重复单元，且根据定义是不相同的。事实上，该方法不仅是为由相同的起始序列产生的几乎相同的编码单元而提出的，也是为那些可在某些区域显著不同的相似或相关序列的重排而提出的。然而，如果该序列中含有足够的可通过这种方法重排的(be reasserted)同源序列，它们可称作“准重复”单元。
本文使用的“随机肽库”是指编码一组随机肽的一组多核苷酸序列，以及由这些多核苷酸序列编码的一组随机肽，以及包含这些随机肽的融合蛋白。
本文使用的“随机肽序列”是指由两种或两种以上的氨基酸单体组成的氨基酸序列，并采用随机(stochastic)或随机(random)方法构建。随机肽可包括含有不变序列的框架或骨架基序。
本文使用的“受体”是指对给定的配体具有亲和力的分子。受体可以为自然产生或人工合成的分子。受体可在未改变状态下进行应用，或与其它种类物质聚合后应用。受体可共价或非共价地，直接地或通过特异性的结合物质连接于结合成员上。受体的实例包括，但不限于，抗体，包括单克隆抗体和带有特定抗原决定簇(如病毒、细胞或其它物质)的抗血清反应、细胞膜受体、复合碳水化合物和糖蛋白、酶、激素受体。
“重组的”蛋白是指通过重组DNA技术产生的，即由编码所需酶的外源DNA构建体转化的细胞产生的蛋白。“合成的”蛋白是那些通过化学合成而制备的蛋白。
术语“相关的多核苷酸”是指所述多核苷酸的区(region)或区域(area)是相同的，以及所述多核苷酸的区(region)或区域(area)是异源的。
本文使用的“减少性重排(Reductive reassortment)”是指通过由重复序列介导的缺失(和/或插入)事件(events)而获得的分子多样性增加。
下列术语用来描述两条或两条以上多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列相同”、“序列相同百分数”和“大致相同”。
“参考序列”是用作序列比较基础的具体序列；参考序列可以是较大序列的子序列(subset)，例如，序列表中给出的全长cDNA或基因序列的片段或可包含完整的cDNA或基因序列。一般来说，参考序列至少为20个核苷酸长，常见至少25个核苷酸长，通常至少50个核苷酸长。由于两条多核苷酸可分别(1)包含与所述的两条多核苷酸相似的序列(即完整核苷酸序列的一部分)，以及(2)可进一步包括与所述的两条多核苷酸不同的序列，两条(或两条以上)多核苷酸的序列比较通常是通过在“比较窗口”中比较所述的两条多核苷酸序列从而确定和比较局部区域的序列相似性来进行的。
本文使用的“重复指数(RI)”是克隆载体中含有的准重复单元的平均拷贝数。
术语“饱和”是指其中在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上发生各种可能变化的演化技术；然而每个位置上的变化不是通过检测来确定的，但仅为统计学推测，其中估计出模板每个位置上发生的大多数可能的变化或几乎每种可能的变化。
“序列同一性”是指在比较窗口中两条多核苷酸序列是相同的(即基于核苷酸-核苷酸比对)。术语“序列同一性百分数”是通过在所述比较窗口中比较两条最佳比对序列而计算得到的，确定两条序列中出现的相同核酸碱基数(例如，A、T、C、G、U或I)，产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口(即窗口大小)中的位置总数，所得结果乘以100得到序列同一性百分数。本文使用的术语“大致相同”表示多核苷酸序列的特性，其中所述多核苷酸序列与含至少25-50个核苷酸的比较窗口参考序列相比，具有至少80％序列同一性，优选至少85％序列同一性，通常90-95％序列同一性，最通常至少99％序列同一性，其中通过将所述参考序列与可包括比较窗口中所述参考序列的20％或以下的缺失或添加的多核苷酸序列相比，计算得出序列同一性百分数。
术语“沉默突变”是指密码子的变化不会导致所表达的多肽中的氨基酸改变，且基于插入氨基酸的密码子使用的冗余。
本领域已知的两种酶之间的“相似性”是通过比较所述氨基酸序列和一种蛋白的保守氨基酸替换成第二种蛋白的序列来确定的。可采用本领域众所周知的方法来确定相似性，例如，BLAST程序(美国国家生物信息中心网站(the National Center for Biological Information)上的Basic Local Alignment Search Tool)。
本文使用的术语“单链抗体”是指多肽连接中包含VH域和VL域的多肽，一般像通过间隔肽(例如，[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x)连接，且可能在氨基-和/或羧基-末端包括额外的氨基酸序列。例如，单链抗体可包括用于连接至所述编码多核苷酸的系绳部分(tether segment)。例如，scFv为单链抗体。单链抗体一般是由含有完全由免疫球蛋白超家族的基因编码的至少10个连续氨基酸的一种或多种多肽片段组成的蛋白(例如，见Williams和Barclay,1989，361-368页，其通过参考并入于此)，最常见由啮齿动物、非人类灵长类动物、禽类、猪、牛、绵羊、山羊或人类重链或轻链基因序列编码。功能性的单链抗体一般包含了免疫球蛋白超家族基因产物的足够部分，从而保留了结合特定目标分子，通常为受体或抗原(抗原表位)的属性。
所述的一对分子(例如，抗体-抗原对或核酸对)的成员，如果它们彼此结合的亲和力比与其它非特异性分子结合的亲和力更大，则称为彼此“特异性地结合”。例如，如果抗体与抗原的结合比它与非特异蛋白的结合更有效，则可描述为与该抗原特异性地结合。(同样地，如果通过碱基配对相互作用使核酸探针与靶核酸形成特异的二聚体，则可描述为该核酸探针与靶核酸特异性地结合(见上文))。
本文所述的“特异的杂交”是指第一多核苷酸和第二多核苷酸之间形成杂交体(例如，含有与第一多核苷酸不同，但大致相同序列的多核苷酸)，其中在混合物中基本上不相关的多核苷酸序列不形成杂交体。
术语“特定的多核苷酸”是指具有特定的末端和特定的核酸序列的多核苷酸。两条多核苷酸，其中一条多核苷酸与第二条多核苷酸的一部分序列相同，但末端不同，则形成了两条不同的特定的多核苷酸。
“严格的杂交条件”是指仅在序列之间具有至少90％，优选至少95％，更优选至少97％同一性时，才会发生杂交。见Sambrook等，1989年，其全文通过参考并入于此。
本发明还包括与多肽序列“大致相同”的多肽序列，如本发明提供的任何一个SEQ ID NO。“大致相同”的氨基酸序列是参考序列的保守的氨基酸发生替换从而形成的不同的序列，例如，一种氨基酸替换成同一类的另一种氨基酸(例如，一种疏水性氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸被替换成另一种疏水性氨基酸，或一种极性氨基酸被替换成另一种极性氨基酸，如精氨酸替换为赖氨酸，谷氨酸替换为天门冬氨酸，或谷氨酰胺替换为天门冬酰胺)。
此外，“大致相同的”氨基酸序列是与参考序列不同的序列，或由一种或多种非保守替换、缺失或插入，特别是当这种替换发生在分子的非活性位点上时，且前提是所述多肽基本上保留了其行为属性的序列。例如，植酸酶多肽上可以缺失一种或多种氨基酸，从而形成了没有显著改变其生物活性的多肽结构修饰。例如，可以去掉对于植酸酶生物活性非必需的氨基或羧基末端的氨基酸。这种修饰可导致较低活性植酸酶多肽的形成。
本发明提供“基本上纯的酶”。本文使用的术语“基本上纯的酶”用来描述分子，如多肽(例如，植酸酶多肽或其片段)，其基本从在自然情况下与其相结合的其它蛋白、脂类、碳水化合物、核酸和其它生物材料中游离出来。例如，基本上纯的分子如多肽，可占目标分子至少60％的干重。可使用标准方法包括，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(如SDS-PAGE)、柱层色谱(如高效液相色谱(HPLC))和氨基末端氨基酸序列分析来确定多肽纯度。
本文使用的“基本上纯的”表示目标物种类(species)是所存在的主要物质(即在摩尔量上，它比组合物中任何其它单独的大分子更丰富)，优选地，基本上纯的级分(fraction)是指组合物中，目标物占存在的所有大分子的至少约50％(在摩尔量上)。一般来说，基本上纯的组合物包括在组合物中存在的所有大分子的约80-90％或更多。更优选地，将所述目标物纯化成基本均一(采用常规检测方法检测不到组合物中的污染物)，其中所述组合物基本上由一种大分子组成。溶剂、小分子(<500道尔顿)和元素离子不被认为是大分子。
本文使用的“模板寡肽”是指用于生成所需第二突变体库的蛋白。本领域技术人员应知晓，本发明中可使用任何数量的模板。“蛋白”或“寡肽”的定义特别包括已知蛋白的片段和域(domain)，包括功能域如酶功能域、结合结构域等，以及更小的片段，如转角、环等。也就是说，也可以使用蛋白的部分。此外，本文使用的“蛋白”包括蛋白、寡肽和肽。此外，可以使用蛋白突变体，即非天然产生的蛋白的近似结构。
适合的蛋白包括，但不限于，工业上和制药业中的蛋白、包括配体、细胞表面受体、抗原、抗体、细胞因子、激素、转录因子、信号转导模块(signaling modules)、细胞骨架蛋白和酶。适合的酶的种类包括，但不限于，水解酶如蛋白酶、糖酶、脂肪酶；异构酶如消旋酶、表异构酶、互变异构酶或变位酶；转移酶、激酶、氧化还原酶和磷酸酶。适合的酶列于SWISS-PROT酶数据库中。适合的蛋白骨架包括，但不限于，由结构生物信息学合作研究室(the Research Collaboratoryfor Structural Bioinformatics)(RCSB，前身为布鲁克海文国家实验室(Brookhaven National Lab))构建并提供服务的蛋白数据库中所有的蛋白骨架。
本文使用的术语“可变区段(variable segment)”是指包括随机的、伪随机的或具体内核序列的新生肽的部分。“可变区段”是指包括随机的、伪随机的或具体内核序列的新生肽的部分。可变区段既可包括可变残基位置，又可包括不可变残基位置，且在可变残基位置上的残基变化程度可以是有限的：以上两种选择可根据操作者的判断来进行选择。通常情况下，可变区段长度约5-20个氨基酸残基(如8-10个)，尽管可变区段可以更长，且可包括抗体部分或受体蛋白，如抗体片段、核酸结合蛋白、受体蛋白等。
术语“野生型(wild-type)”或“野生型(wild type)”是指该多核苷酸不包括任何突变。“野生型”蛋白是指该蛋白在以自然界中发现的活性水平存在时具有活性，且含有自然界中发现的氨基酸序列。
发明详述
本发明提供在哺乳动物宿主中整合了治疗性蛋白(包括抗体)的产生和/或筛选、演化和表达的方法，以实现在单一系统中生产。在CIAO法的一个实施方案中，在同一哺乳动物宿主系统中产生、优化并生产治疗性蛋白，包括抗体。在另一个实施方案中，在同一宿主中发现并生产治疗性蛋白。这从一开始就优化生产，节约成本(时间和资源)。
从历史上看，抗体是在真核(euk)和原核(prok)宿主中发现的。通常情况下，在细菌(大肠杆菌)中发现了部分长度的抗体，例如，在噬菌体展示技术中，Fabs得以修复并有时转化为全长的下游。这些方法有一些潜在的不利因素。
在一个实施例中，有一些证据表明，Fc和Fv区相互作用可影响抗体的属性，如结合和表达。因此，当对抗体片段进行属性优化，如表达优化时，这种改善不总是转化为在组装的全长抗体中的表达改善。例如，构建Fc库试图发现可连接到任何Fv上以提高在任何宿主中表达的“圣杯(holy grail)”Fc。
在一个方面，密码子突变是在恒定区进行的，用于哺乳动物细胞的表达优化。具体地，在在恒定区构建了326个突变，并在HEK 293和CHO-S细胞中表达。用ELISA法进行筛选。几个Fc达到了提高表达的标准，甚至发现一部分优化的Fc's跨多个细胞系转移有益的影响；然而，当不同的Fv连接到Fc上时，表达的改善没有转移(translate)。这表明，Fc's和Fv's相互作用。
为了避免抗体片段重组后不期望看到的结果，在一个优选的方面，利用CIAO法来发现全长抗体分子。在另一个优选的方面，所述CIAO法使用真核宿主。
在一个实施方案中，所述真核系统是选自下组的哺乳动物系统：CHO、HEK293、IM9、DS-1、THP-1、Hep G2、COS、NIH 3T3、C33a、A549、A375、SK-MEL-28、DU 145、PC-3、HCT 116、Mia PACA-2、ACHN、Jurkat、MM1、Ovcar 3、HT 1080、Panc-1、U266、769P、BT-474、Caco-2、HCC 1954、MDA-MB-468、LnCAP,NRK-49F和SP2/0细胞系；及小鼠脾细胞和兔外周血单核细胞(PBMC)。在一个方面，所述哺乳动物系统选自CHO或HEK293细胞系。在一个特定的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S细胞系。在另一个特定的方面，所述哺乳动物系统是HEK293细胞系。在另一个实施方案中，所述真核系统是酵母细胞系统。在一个方面，所述真核系统选自酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞。
在另一个实施方案中，哺乳动物细胞系可由商业合同研究组织或定制生产组织而获得。例如，为了获得重组抗体或其它蛋白，采用GS基因表达系统TM(GS Gene Expression SystemTM)技术，使用CHOK1SV或NSO宿主细胞系，Lonza公司(Lonza Group Ltd,瑞士巴塞尔)可构建载体来表达产物。
在另一个实施方案中，只要筛选与生产发生于同一宿主中，演化可在原核宿主(如大肠杆菌)中进行，筛选可在真核宿主(例如，CHO)中发生。
先导候选蛋白的筛选
可使用多种方法发现、生成和/或筛选出一种或多种待演化的治疗性候选蛋白。选定的分子可以为现有的重组蛋白，或可来自于重组蛋白的集合，包括酶、激素和抗体。治疗性蛋白可以包括克隆的人类酶和激素。可使用可获得的任意数量的产生和筛选平台来发现重组抗体。抗体可以是任何形式，包括单链、完全人源化的、Fab、Fv、Fc、双功能的、嵌合的、人源化的或完全人类抗体或它们的片段。在一个优选方面，使用CIAO法来发现全长抗体分子。可利用优化和非优化的哺乳动物宿主中的选择或筛选系统来产生和筛选重组抗体库，从而产生用于演化的候选物。几个真核表达系统是公开的，例如，哺乳动物或酵母细胞系统。
在本发明的方法中，使用这样的哺乳动物表达系统，特别是利用分子的细胞表面展示进行筛选和选择的系统，从而确定和筛选出用于生产的候选物，或生产后进行演化。优选地，这种哺乳动物宿主为成纤维细胞(3T3，小鼠；BHK21，叙利亚仓鼠(Syrian hamster))、上皮细胞(MDCK，狗；Hela，人类；PtK1，鼠袋鼠)、浆细胞((SP2/0和NS0，小鼠)、肾细胞(293，人类；COS，猴)、卵巢细胞(CHO，中国仓鼠)、胚胎细胞(R1和E14.1，小鼠；H1和H9，人类；PER C.6，人类)。使用细胞表面展示技术在哺乳动物细胞表面展示蛋白，从而进行筛选。例如，蛋白与膜分子作为融合体被克隆，其被表达时将蛋白展示于细胞表面，从而进行快速、高通量筛选。
在某些实施方案中，本发明提供一种优化抗体的方法。在一个实施方案中，筛选出抗原，生成人类抗体库并在哺乳动物系统，例如CHO-S细胞中表达。对库进行筛选，以确定完全人类抗体苗头(hits)例如，通过荧光激活细胞分选(FACS)。然后通过任何相关检测来进一步筛选/定征(characterize)所述完全人类抗体苗头，以获得具有至少一种预定的属性、特性或活性的抗体。在一个方面，筛选演化分子以获得同时具有多个特性，如改进的功能和表达的分子。相关检测可包括例如，ELISA或阵列技术。从所述人类抗体苗头中筛选出模板抗体。采用任何演化方法对所述模板抗体或其多肽片段进行演化，从而制备一组突变抗体。在一个方面，通过综合性蛋白工程方法进行所述演化，从而制备该组突变抗体。例如，所述综合性蛋白工程方法可选自，例如，综合性定位演化(CPETM)、综合性蛋白合成(CPSTM)、Flex演化、协同演化、综合性定位插入演化(CP ITM)或综合性定位缺失演化(CPDTM)中的一种或它们的组合。另一个方面，所述突变抗体表达于同一哺乳动物系统中，从而产生所述人类抗体库。
定征/筛选该组突变抗体以获得具有至少一种预定的属性、特性或活性的突变抗体。在一个方面，例如，筛选该组突变抗体以获得功能和表达同时改进的突变抗体。在一个方面，通过一种或多种本领域已知的蛋白演化技术，使用功能定位图谱(EvoMapTM)形式的特异性分子数据库，进行额外的优化；然后确定并定征增强型突变(up-mutant)。通过在至少一种预定的属性、特性或活性方面，与所述模板抗体进行比较，筛选出优化的抗体。
在一个方面，对筛选出的优化抗体进行革兰氏规模的表达；然后进行非GLP毒理学检测。进行稳定的细胞系转染，形成工艺过程开发(process development)并产生主细胞库(Master Cell Bank)。在同一哺乳动物系统中进行GMP生产，从而产生所述人类抗体库，例如，CHO-S细胞，以得到优化的治疗性重组mABs。
在另一个实施方案中，所述CIAO法开始于模板杂交瘤细胞或重组抗体的筛选；演化所述抗体，从而通过在哺乳动物细胞系统中应用抗体细胞表面展示提供筛得的一组突变抗体；以及在用于筛选的同一哺乳动物细胞系统中进行生产。
在另一个实施方案中，在生产宿主中对选定的模板杂交瘤细胞/重组抗体进行人源化和筛选，然后在生产宿主中进行生产，其中优化(演化)的步骤完全省略。
在本发明的其它方面，通过演化抗体的Fc区、抗体中的沉默密码子和/或蛋白表达中使用的载体和/或宿主基因，在生产宿主中进行下游表达的优化。在一个方面，Fc库可由任何演化技术产生。在表达优化的一个具体方面，对抗体的Fc功能域进行CPE，以构建可用于筛选出任何Fv的最适配体的Fc突变体库。设计出可使全部Fc CPE突变体迅速结合到每个新Fv区的优化。或者，这些Fc的子序列(subset)可用于连接到不同的Fv上。筛选出在哺乳动物细胞(如CHO，经济高效的培养基)中表达全长抗体的每种Fc CPE突变体/Fv组合，以获得优化的表达。此外，可通过CPS在哺乳动物细胞中筛选所有理论上变化(permutations)高达12种或更多这些CPE苗头，以获得提高的表达。也可选定具体想要的改变的密码子，从而确定表达增强的克隆。确定出沉默密码子，并在这些位置上进行CPE。筛选该CPE库，从而确定出最佳表达苗头。此外，所有的理论上变化高达12种或更多的CPE苗头可用于CPS法中，从而形成新的可在哺乳动物细胞中进行筛选的库，以获得提高的表达。首选的CPS沉默突变苗头被用来制备能够在特定细胞系和培养基中进行最佳表达的蛋白。这为生物仿制药的精细结构控制提供了机会。
其它增强表达的领域包括：载体优化，包括启动子、剪接位点、5'和3'端、侧翼序列、基因缺失和重排的减少、宿主细胞基因活性的提高、宿主糖基化酶的优化及染色体广泛宿主细胞的突变和筛选。已证实5'氨基酸序列对于增强表达是重要的。
先导候选物的演化
任何蛋白演化方法可用于蛋白的性能和表达优化的同时演化。蛋白性能的优化可以包括各种特性的改善，如亲和力、药物代谢动力学特性、组织定位、蛋白-蛋白聚集、体内其它特性的高检测突变及修饰(addressing high assay variability and modifying other in vivo characteristics)。
用于演化分子，包括本发明的选定候选物的方法，包括随机和非随机方法。公开的方法包括随机和非随机诱变法。这些方法中的任一种可用于将本发明的治疗性蛋白的属性演化成想要的特性，如在不同的温度或pH值环境下更好的稳定性或在宿主细胞中更好的表达。其它潜在的理想属性，如增加的催化活性、在各种条件下蛋白稳定性的提高、改善的选择性和/或溶解度以及通过改善特性如减少聚集而获得的增强表达，可筛选出以用于演化实验。
演化是在真核宿主，如哺乳动物细胞宿主或酵母细胞宿主中直接进行的，其可用于所述治疗性蛋白的下游生产。可在用于筛选和/或演化并用于生产的相同的宿主中演化出最佳表达的候选物。可通过优化使用的载体(载体组成，如启动子、剪接位点、5'和3'端及侧翼序列)来实现表达优化，宿主细胞的基因修饰以减少基因缺失和重排，通过在体内或体外演化相关基因的方法从而演化宿主细胞基因活性，通过演化相关基因从而优化宿主糖基化酶，和/或通过大规模宿主细胞染色体诱变和筛选策略而筛选出表达能力增强的细胞。本文进一步描述了宿主细胞。
细胞表面展示表达和筛选技术(例如，定义如上)，可用于筛选演化蛋白库，从而获得用于生产的候选物。
目前广泛使用的用于从起始分子构建可替代蛋白的方法为寡核苷酸定向诱变技术、易错聚合酶链式反应和盒式诱变，其中进行优化的特定区被综合诱变的寡核苷酸取代。在这种情况下，在原始序列中的某些位点周围形成许多突变位点。
在寡核苷酸定向诱变中，短序列被综合诱变的寡核苷酸取代。易错PCR使用低保真聚合条件，以在长序列中随机引入低水平的点突变。在未知序列片段的混合物中，易错PCR可用于诱变该混合物。在盒式诱变中，一条模板的序列块通常(部分地)被随机序列所取代。
嵌合基因是通过将2条多核苷酸片段用由限制性酶产生的匹配粘性末端进行连接而形成的，其中每个片段衍生自单独的祖(或亲本)分子。另一个实例是在亲本多核苷酸中单个密码子位置上的诱变(即实现密码子替代、添加或缺失)，从而生成编码单个位点突变的多肽的单个子代多核苷酸。
此外，使用体内位点特异性重组系统产生基因杂合体，以及体内重组的随机方法，及质粒上的同源但为截短基因之间重组的随机方法。也有通过重叠延伸和PCR进行诱变的报道。
已经使用非随机方法来获得大量的点突变和/或嵌合(chimerizations)，例如全面或详尽的方法已被用于生成特定突变组内的所有分子，以将功能赋予模板分子中特定的结构群(例如，特定的单个氨基酸位置或由两个或两个以上氨基酸位置组成的序列)，并进行分类和特定突变群体的比较。美国专利号US7033781，题为“全细胞工程，诱变起始基因组的大部分，结合突变并任选地重复(Whole cell engineering my mutagenizing a substantial portion of a starting genome,combining mutations,and optionally repeating)”，描述了使有机体演化成所需特性的方法。美国专利号US6764835，题为“定向演化中的饱和突变(Saturation mutagenesis in directed evolution)”和美国专利号US6562594，题为“定向演化中的合成连接重组(Synthetic ligation reassembly in directed evolution)”，详尽描述了所需特性分子的演化和筛选方法。任何这样的方法可用于本发明的方法中。
在已知的“饱和诱变”法和本文优选的“综合性”演化技术之间存在差异。饱和诱变是指在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上发生每一种可能变化的演化技术；然而在每个位置上的变化不是通过检测证实，而仅为统计学推测。综合性演化是指在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上发生每一种可能变化，且所述多核苷酸或多肽被检测以证实所需变化确已形成的演化技术。
饱和法本质上是统计的、非综合性的方法，也从来没有实现真正的综合性贯穿(across)所有步骤(例如，贯穿突变产生、突变鉴定、突变蛋白表达、突变蛋白筛选，以及重组的增强型突变产生、鉴定、表达和筛选的步骤)。在综合性演化技术中，在诱变的第一步以及随后第二步的高表达突变或苗头的重组中筛选和确认每种分子。
除非通过测序或其他方法来证实饱和诱变，否则出于几种可能的原因，不能认为该技术是全面的。例如，1)由于克隆或合成的错误，或难以克隆分子，克隆系统不是100％有效，或2)一些蛋白表达时是有毒的，从而不能有效地表达。因此，通过测序或在每步中采用其他一些技术来证实是重要的。为了筛选表达型，给每一步打分是有用的，不表达的克隆不再向之前工作中那样被指定为“负”，它们只是被打分为不表达。因此综合性技术被认为是比饱和技术更纯的非随机系统，正像通过“确认”步骤确认的那样。
综合性定位演化
参考图1，以线性肽(linear peptide)为简单的实例，在第一步中，通过本发明提到的综合性定位演化(CPETM)的方法产生一组从1-n位(n对应于该多肽链的残基数)各密码子天然存在的氨基酸突变体(或其亚组，或氨基酸衍生物)。此步骤对所述目标分子的每条多肽链重复。氨基酸突变的最小的组仅包含19个天然氨基酸中每一个氨基酸的一个密码子。然而，我们都知晓，每个表达系统可能发生密码子偏性(codon bias)，其中不足的tRNA库可以导致翻译延迟，过早的翻译终止，翻译移码和氨基酸错误插入(misincorporation)。因此，为了进行表达优化，每组含多达63个不同的密码子，包括终止密码子。在下一步中，通过对每种新的分子进行测序来证实突变。也可使用其他方法来确认。
然后从每组氨基酸中筛选出至少以下一种：
-改善的功能
-中性突变
-抑制突变
-表达
-克隆与宿主系统相容。
优选地，同时筛选出多种特性，例如，改善的功能和表达。
将整条多肽链的各组数据相结合，形成所述目标分子的详细功能图谱(本文中称作EvoMapTM)。该图谱包含了有关每种突变是如何影响目标分子的性能/表达和/或克隆能力的详细信息。它能够确定所有只要发生变化则导致蛋白功能丧失的位点(例如，在抗体的情况下抗原/受体结合)。它还表明了可以发生变化而不影响蛋白功能的位点。它进一步明确了导致分子在宿主系统中不表达的那些变化，因此不评价该突变的影响。
假设的EvoMapTM示意图如图1所示。模板的每个位置上被认定为限制性位点(非可变)、完全可变位点、部分可变位点或特定氨基酸替换的增强增强型突变。每个部分可变位点可被进一步认定为能够被替换为，例如，带电的残基或非极性残基替换，以及不能在宿主系统中克隆的非表达克隆和/或分子。
为了鉴定和重组有益的单氨基酸替换，并筛选以进一步优化目标分子所需的特性，利用EvoMapTM是可行的。然而，某些特征的演化可能同时需要两种或两种以上突变才能被观察到。EvoMapTM可被有效而经济地利用，以非随机的方式产生一组多位点突变的多肽。然后可筛选该组多位点突变多肽，获得增强型多位点突变(multi-site upmutants)。
CPE能够在完全在体内验证蛋白突变图谱。整个增强增强型突变组的鉴定使进一步的组合演化步骤成为可能。CPE可用以降低由选择非表面突变所带来的演化蛋白的免疫原性风险；消除T细胞抗原表位；以及模拟体细胞突变(mimicry of somatic mutations)。
在一个方面，CPE可用来生成多达5个、10个或15个，或多达所有19个氨基酸的库。在蛋白的每个位置上发生变化并筛选出想要的特性，如结合亲和力或表达，并构建EvomapTM。随后的几轮突变和筛选可用于产生全部19个氨基酸的数据。从该图谱上看，可确定完全可变位点。这些位点可用于确定可被修饰以形成可产生和测定新特性的新分子集合的位置。例如，信息可用来确定序列中的HLA单体型，并可通过在根据该图谱确定的“中性”(“完全可变的”)位点上发生特定的变化，形成想要的改变来避免这些单体型，其中基本特性将不会受到影响。这将潜在地降低免疫原性风险(技术人员可选择非表面突变、消除T细胞抗原表位、模拟超体细胞突变(mimic hypersomatic mutations)。此外，该图谱可显示出用于位点特异性修饰(糖基化和化学共轭)以改善各种特性的位点。此外，优化沉默突变可提高蛋白在不同宿主中的表达。
协同演化
在本发明的一个实施方案中，生成EvoMapTM并用于协同演化，如图2所示。在协同演化中，可将2-20个选定位点的同时突变相结合以产生组合效应。所述模板多肽的EvoMapTM用于筛选出特定的单个氨基酸点突变以组合形成多位点多肽突变。
在协同演化中，从EvoMapTM上非可变位点附近的部分可变位点中筛选出非失活氨基酸点突变。在一个方面，所选定的非失活点突变与非可变位点相邻。在协同演化中，同时对2-20个选定位点的氨基酸进行突变，以获得组合效果。在一个方面，选定的2-20个突变的重组用于产生编码大量多位点突变多肽的密码子突变体库。克隆和表达后，然后从所产生的多位点突变多肽中筛选出，与所述模板抗体相比，具有至少一种预定的属性、特性或活性的多肽。以这种方式，可确定增强型多位点突变多肽。在一个方面，多位点突变多肽是由组合的蛋白合成生产的。协同演化的一个好处是，它不需要蛋白X射线晶体结构来指导所述模板多肽的演化。这种技术尤其对具有高检测突变和其他多位点效果的蛋白是有用的。
根据本发明，协同演化的应用包括，但不限于复杂分子机理变化的演化、具有高检测突变的蛋白的演化、蛋白特异性演化、在各种表达宿主中的表达改善、蛋白催化活性和稳定性的改善、以及pH值的优化。协同演化适用于所有治疗性蛋白，包括但不限于，激素、酶、细胞因子和抗体。
在本发明的一个方面，协同演化可用来优化作为蛋白分子一部分的多肽的一个或多个方面，采用本领域已知的克隆、翻译和表达技术，可通过将编码多肽的一种或多种突变核苷酸与编码框架多肽的零个、一个或多个核苷酸连接以生成突变蛋白，从而组装所述蛋白分子。在一个方面，框架多肽衍生自野生型蛋白分子。在这方面，协同演化可与抗体人源化技术相结合使用。例如，可选择小鼠单克隆抗体进行演化和人源化。克隆并测序所述抗体的CDR区，可合成各CDR区(CDRl、CDR2、CDR3)并与其他编码人类抗体框架多肽的核苷酸连接，然后产生人类突变IgG库。然后筛选该人类突变IgG库，获得与小鼠mAb相比，具有至少一种属性，例如两种或两种以上属性包括改善的功能和表达的人类突变IgG。在另一个方面，框架多肽(framework polypeptide)是人工合成的多肽框架(scaffold polypeptide)。在实施例部分提供了ds DNA片段制备、核酸连接和组装、克隆、转染、表达、库的固相合成、库的液相合成、综合性定位演化、综合性蛋白合成、通过ELISA定量和β-半乳糖苷酶检测进行定量表达及功能性ELISA。
在本发明的另一个实施方案中，协同演化可用来提高抗体的结合亲和力。在该实施方案中，可进行抗体可变区的优化。例如，为了生产突变抗体，对选定抗体的轻链和重链可变区进行CPE并生成EvoMapTM。筛选出用于重组的突变体，例如，筛选出用于组装的轻链突变体和重链突变体。从非可变位点附近的部分可变位点筛选非失活氨基酸点突变。利用CPS的该重组技术可用于构建重链库。所述轻链突变体可与重链突变体相结合，克隆、表达，并从真核细胞系上清中筛选完整的IgG突变体。采用例如ELISA、BIAcore和/或Sapidyne仪器检测或本领域已知的其他技术来评价某些突变体的结合亲和力。
Flex演化
在另一个实施方案中，CPE/EvoMap可用于鉴定和发现完全可变位点。在一个方面，多个完全可变位点的发现被称为Flex演化，并被用来形成定向改变如引入糖基化位点(如用于N-或O-连接的糖基化的氨基酸的密码子；共有序列Asn-Aa-Ser-Thr或Ser/Thr中的Asn)和化学共轭。Flex演化还可用于蛋白酶切位点的设计，纯化和/或检测标签的引入，位点特异性标签的引入等。此外，沉默突变的密码子优化可用于提高蛋白表达。在该实施方案中，称为Flex演化，然后是蛋白表达，重新筛选产生的突变多肽库，以获得与所述模板多肽相比，具有至少一种预定属性、特性或活性的多肽。在一个方面，预定属性包括蛋白-蛋白聚集下降、蛋白稳定性的提高或蛋白溶解度的增加。在一个方面，筛选突变多肽库，以获得同时具有两种或两种以上属性的多肽。在另一个方面，任何可进行糖基化的真核表达系统，可用于引入糖基化位点，例如，哺乳动物、植物、酵母和昆虫细胞系。
在Flex演化中，生物信息学评价和相关蛋白的蛋白x-射线晶体结构，或模板蛋白或多肽，对于模板优化是有用的。在一个方面，选定的位点不在接触残基上。在另一个方面，选择非表面蛋白突变可降低免疫原性风险。
Flex演化的应用包括但不限于，蛋白-蛋白聚集下降，蛋白溶解度的提高，通过糖基化库的药代动力学优化，蛋白二级和三级结构的优化，以及直接通过突变组的抗原位点脱免疫或间接通过糖基化掩蔽(masking)的抗原位点脱免疫。
在Flex演化的一个方面，EvoMapTM可用来鉴定完全可变位点，通过向完全可变位点(或用于翻译效应的沉默突变)插入糖基化残基生成CPS，通过解析分析(如质谱分析，动态光散射)进行组合糖化库的筛选，免疫原性降低(生物信息学或检测)和/或药代动力学分析(例如在Foxnlnu小鼠中)。
在一个方面，Flex演化可用于脱免疫以消除免疫原性，同时保持功能。Flex演化脱免疫可通过糖基化掩蔽免疫原性来进行，确定可消除免疫原性并同时保持功能的人类超体细胞突变谱氨基酸替换，减少剂量以避免潜在的免疫原性，以及非表面氨基酸残基变化的最小化。此外，免疫原性数据库和算法可用于鉴定和替换潜在的MHC结合抗原表位。在一个方面，电子(in silico)修饰预测结合CPE/CPS数据以形成突变体。
产生T细胞抗原表位和/或脱免疫的减少倾向可采用本领域已知的技术测定。优选地，蛋白的脱免疫可通过体外T细胞增殖实验进行检测。在该实验中，筛选来自供体的代表世界上>80％HLA-DR等位基因的PBMC，进行增殖，以响应野生型或脱免疫肽。只有在加载含有野生型多肽的抗原呈递细胞时，才检测到理想的细胞增殖。脱免疫的其它检测包括人类PBMC体外再刺激实验(如γ干扰素(TH1)或IL-4(TH2)ELISA)。或者，人们可通过表达呈现所有单体型的HLA-DR四聚体来检测脱免疫。为了检测脱免疫肽是否呈现于HLA-DR单体型中，例如可测定PBMC上结合的荧光标记肽。测定HLA-I类和II类转基因小鼠对靶抗原的反应(如干扰素γ或IL-4)。或者，用驯化的T细胞(educated T cell)(MHCI 9mer；MHCII 20mer)从PBMC中筛选抗原表位库，和/或转基因小鼠实验。此外，可通过检测给药后患者是否产生了抗所述脱免疫分子的抗体来证实脱免疫。
在另一个实施方案中，本发明的Flex演化技术可用于表达优化。在一个方面，本发明公开了利用蛋白工程方法在真核细胞中开发提高表达的沉默突变密码子优化的Fc突变体。沉默突变是指其中DNA序列的变化不会导致蛋白氨基酸序列的变化。在一个方面，在恒定区进行密码子诱变，用以优化真核细胞表达。具有提高的表达属性同时保留了介导效应子功能能力的密码子优化Fc突变体提高了治疗性抗体的产量。在这方面，例如，可演化抗体分子的恒定区，以实现在不同表达宿主中进行筛选，例如，利用CHO、HEK293和COS-7进行哺乳动物细胞系表达的筛选。用于哺乳动物细胞表达的通过恒定区中密码子诱变来优化表达的实例如图3所示，并描述于实施例19中。所示的表达水平分别为4个数据点的平均值，并经过多个实验证实。在HEK293和CHO细胞系表达系统中检测首次突变，从而证实多细胞系的能力。
此外，EvoMapTM可用于生成寡肽的3-维计算机分子模型或其特定区，以探究涉及到的结构机制，如抗体-抗原表位的特异性和稳定性。假设的三维EvoMapTM示于图13中。
EvoMap中的信息也可与结构信息(如果可获得)相结合，从而筛选出，例如仅表面残基发生的突变，以增加溶解度/减少聚集。
综合性定位插入演化
在一个实施方案中，本发明提供了对由模板多肽形成的或基于模板多肽的突变多肽进行鉴定和绘制其图谱的方法。参考图8，以线型肽作为一个简单的实例，在第一步中，采用本文中所述的综合性定位插入(CPITM)演化方法，生成从位置2至n(n对应于多肽链中的残基数)的每个密码子上天然存在的一组氨基酸突变(或其亚组，或氨基酸衍生物)。
在CPITM中，在整条模板多肽上，在每个氨基酸后插入氨基酸，一次生成一组加长的多肽。CPI可用于一次插入1、2、3、4或多达5个新位点。在每个新位置上添加20种氨基酸中的每一个，每次添加一个，在所述模板的每个新位置上形成一组20个不同的分子。在这种情况下，位置1为蛋氨酸且不变，其被跳过。对每个目标分子的多肽链重复该法。最少的一组氨基酸突变只包含20个天然氨基酸的一种密码子。
本发明涉及对由模板多肽形成的或基于模板多肽的突变多肽进行鉴定和绘制其图谱的方法。通常情况下，所述多肽包括个氨基酸残基，其中该方法包括：(a)产生n+[20×(n-1)]个单独的多肽，其中每个多肽不同于模板多肽之处在于：它在所述模板的每个位置后面每次插入20种氨基酸中每一个(如图1所示)；检测各条多肽，以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的多肽；以及(b)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化。
在一个实施方案中，选择一个或多个区进行诱变，如上所述一次添加一个位置。在这种情况下，n代表模板多肽的亚组或区。例如，所述多肽为抗体，则对整条抗体或该抗体的一个或多个互补决定区(CDR)进行突变，以在所述模板的每个位置后面一次添加一个位置。
因此，本发明包括对由含有至少一个，优选六个互补决定区(CDR)的模板抗体形成的一组突变抗体绘制其图谱的方法，所述CDR共包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生n+[20×(n-1)]个单独的抗体，其中每条抗体不同于模板抗体之处在于：其是在所述模板序列每个位置后面一次插入一个预定的位置；(b)检测每组抗体，以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的抗体；以及(c)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化。对于抗体而言，预定的属性、特性或性质可以为例如，结合亲和力和/或免疫原性。
此外，本发明提供由含有至少一个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的一组突变抗体的制备方法，所述CDR包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生n+[20×(n-1)]个单独的抗体，其中每条抗体与所述模板抗体的不同之处在于：其在所述CDR的每个预定位置上含有一个额外添加的氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体包括6个CDR，所述CDR共包括n个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，在筛选鉴定出，与缩短的多肽相比，属性、特性或活性发生变化的新加长的多肽之后，对上述加长的多肽进行进一步突变并绘制图谱。通常情况下，所述加长的多肽包括n个氨基酸残基，其中该方法包括：(a)产生n(起始残基为蛋氨酸时，为n-1)个单独的多肽组，每组包括的多肽成员在所述多肽的单个预定位置上含有X个不同的预定氨基酸残基；其中单个预定位置上的每组多肽不同；检测每组多肽中具有至少一种预定属性、特性或活性的多肽；(b)检测各成员与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化；以及任选地(c)绘制出反映这种变化的功能图谱。优选地，产生的不同多肽成员数目等于n×X(或[n-1]×X，视情况而定)。
替代性方法包括产生含有来自所述加长的多肽的突变多肽组的单个群体。在该实施方案中，筛选整个新群体，鉴定个别成员并产生功能图谱。
通常情况下，使用每种天然存在的氨基酸时，X为19(代表20个天然存在的氨基酸残基，且不包括在模板多肽给定位置存在的特定残基)。然而，全过程中可使用氨基酸的任何亚组，每组多肽可被用于整个群体的总X的全部或其亚组替代。
然而，据认为每个表达系统可能受到偏性密码子影响，其中不足的tRNA库可导致翻译延迟、过早的翻译终止、翻译移码和氨基酸错误插入(misincorporation)。因此，为了进行表达优化，每组含多达63个不同的密码子。
然后筛选每组氨基酸，以获得具有至少一种，优选两种或以上所需特性，如改善的功能、中性突变、抑制突变和表达的氨基酸。
在一个方面，可绘制所述加长的多肽的图谱，从而确定出导致形成相对于“野生型”缩短的多肽的属性、特性或活性的变化。将每组的数据结合得到整条多肽，或“靶分子”。然后从所述加长的多肽(靶分子)中筛选出的苗头(hit)可进一步用于本文所述的综合性诱变链和筛选。产生由诱变得到的提供了所述靶分子详细功能图谱(本文称为EvoMapTM)的数据。该图谱包含了有关每种突变是如何影响所述靶分子的性能/表达的详细信息。它能够确定所有的只要发生变化就会导致蛋白功能丧失(或在抗体的情况下抗原/受体结合)的位点。它还表明了可发生变化而不影响蛋白功能的的位点。
在另一个方面，CPE可用来生成在每个目标位置上5、10、或多达15个，或多达全部19个氨基酸的库。
综合定位缺失演化
综合性定位缺失演化(CPDTM)涉及对由模板多肽形成的或基于模板多肽的突变多肽进行鉴定和绘制其图谱的方法。CPD演化一次在该蛋白的一个位置上缺失每个氨基酸。通常情况下，所述多肽包括个氨基酸残基，其中该方法包括：(a)产生n-1(起始残基是蛋氨酸的情况下，为n-2)个单独的多肽，其中每个多肽与模板多肽的不同之处在于：它缺少单个的预定位置；检测各条多肽，以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的多肽；以及(b)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化。
在CPD演化的一个实施方案中，选定一个或多个区用于突变而一次删除一个位置。在这种情况下，n代表所述模板多肽的亚组或区。例如，所述多肽为抗体，则对整条抗体或该抗体的一个或多个互补决定区(CDR)进行突变，而一次删除所述模板多肽的一个位置。
因此，在一个实施方案中，CPD包括对由含有至少一个，优选六个互补决定区(CDR)的模板抗体形成的一组突变抗体进行图谱绘制的方法，所述CDR共包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生(n-1)个单独的抗体，其中每条抗体不同于模板抗体之处在于：其缺少单个预定的位置；(b)检测每组抗体以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的抗体；以及(c)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化。对于抗体而言，预定的属性、特性或性质可以为例如，结合亲和力和/或免疫原性。
CPD演化的一个方面包括由含有至少一个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的一组突变抗体的制备方法，所述CDR包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生(n-1)个单独的抗体，其中每条抗体与所述模板抗体的不同之处在于：其缺少所述CDR的单个预定位置。在另一个实施方案中，所述抗体包括6个CDR，所述CDR共包括n个氨基酸残基。
在CPD演化的另一个实施方案中，在筛选鉴定出，与缩短的多肽相比，属性、特性或活性发生变化的新缩短的多肽之后，对上述缩短的多肽进行进一步突变并绘制其图谱。通常情况下，所述缩短的多肽包括n个氨基酸残基，其中该方法包括：(a)产生n(起始残基为蛋氨酸时，为n-1)个单独的多肽组，每组包括的多肽成员在所述多肽的单个预定位置上含有X个不同的预定氨基酸残基；其中单个预定位置上的每组多肽不同；检测每组多肽以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的多肽；(b)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化；以及(c)绘制出反映这种变化的功能图谱。优选地，产生的不同多肽成员数目等于n×X(或[n-1]×X，视情况而定)。
替代性的CPD方法包括产生含有来自所述缩短的多肽的突变多肽组的单个群体。在该实施方案中，筛选整个新群体，鉴定个别成员并产生功能图谱。通常情况下，使用每种天然存在的氨基酸时，X为19(代表20个天然存在的氨基酸残基，且不包括在模板多肽给定位置存在的特定残基)。然而，全过程中可使用氨基酸的任何亚组，每组多肽可被用于整个群体的总X的全部或其亚组替代。
在CPD演化中，可采用任何突变或人工合成的方法来产生该突变体组。在一个实施方案中，多肽的产生包括：(i)对含有编码所述模板多肽的密码子的多核苷酸进行聚合酶扩增反应，每个待突变的密码子使用64倍简并寡核苷酸，其中每个所述的64倍简并寡核苷酸是由第一同源序列和N,N,N三联体简并序列组成的，从而生成一组子代多核苷酸；以及(ii)对该组子代多核苷酸进行克隆扩增，使由该子代多核苷酸编码的多肽得以表达。
在CPD演化的一个实施方案中，对整条缩短的多肽进行饱和突变。在另一个实施方案中，选定一个或多个区进行饱和突变。在这种情况下，n代表所述模板多肽的亚组或区。例如，所述多肽为抗体，则对整条抗体或该抗体的一个或多个互补决定区(CDR)进行饱和突变。
因此，本发明公开的CPD演化包括对由含有至少一个，优选六个互补决定区(CDR)的模板抗体形成的一组突变抗体进行图谱绘制的方法，所述CDR共包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生n个单独的抗体组，每组包括的抗体成员在所述CDR的单个预定位置上含有X个不同的预定氨基酸残基；其中单个预定位置上的每组抗体不同；(b)检测每组抗体以获得具有至少一种预定属性、特性或活性的抗体；(c)检测各成员中，与所述模板多肽相比，在属性、特性或活性方面的任何变化；以及(d)绘制出这种变化的结构位置图谱。对于抗体而言，预定的属性、特性或性质可以为例如，结合亲和力和/或免疫原性。如上所述，在替代性方法中，可产生包括所有突变抗体组的单个群体。
此外，本发明提供了由至少含有一个互补决定区(CDR)的缩短模板多肽形成的一组突变抗体的制备方法，所述CDR包括n个氨基酸残基，该方法包括：(a)产生n个单独的多肽组，每组包括的抗体成员在所述CDR的单个预定位置上含有X个不同的预定氨基酸残基；其中单个预定位置上的每组抗体不同；以及产生的不同抗体成员数目等于n×X。在另一个实施方案中，所述抗体包括6个CDR，所述CDR共包括n个氨基酸残基。
该CPDTM演化法包括采用上述方法生成的功能位置图谱(EvoMapTM)。在另一个实施方案中，可在EvoMapTM上标明对变化特别敏感的某些残基。可通过在这些敏感位置以外的位置上形成其它突变变化来实现进一步优化。为了识别和重组有益的单氨基酸替换，利用EvoMapTM也是可行的，并在称为综合性蛋白合成(CPSTM)方法中进行筛选从而进一步优化靶分子中的所需特性。
综合性蛋白合成
综合性蛋白合成(CPSTM)包括结合了由CPE、CPI、CPD或或任何其他演化技术获得的单个苗头，从而结合两种或两种以上突变。CPS用于合成具有组合突变的蛋白，然后从所述组合突变中筛选出优化的基因和蛋白特性。CPSTM示意图如图3所示。在一个方面，形成增强增强型突变或中性突变的两种或两种以上的点突变结合于CPS中。
在一个实施方案中，CPE与CPS结合以产生突变体，从所述突变体中筛选出具有所需特性的突变体。在一个方面，在CPE法中，通过每次改变2个氨基酸或3个氨基酸或4个氨基酸，而不是每次1个氨基酸，而节省时间和资源；因此，如果蛋白中氨基酸的数目是N，那么每次产生和筛选到2个氨基酸的总数为(202)×1/2N；每次产生和筛选到3个氨基酸的总数为(203)×1/3N等。例如，在一个特定的方面，(在2个氨基酸的实例中)：将第一位上1号的氨基酸与第二位上的所有20个氨基酸结合，其它氨基酸保持不变，然后将第一位上的2号氨基酸与第二位上的所有20个氨基酸相结合，且其它氨基酸保持不变。从整个群体中筛选出增强型突变，然后进行下游的后续2个氨基酸的第二组突变。在类似的方面，可一次进行3个或4个氨基酸突变。在另一个方面，CPE法之后任选对增强型突变(包括其任何亚组)进行CPS。
在一个方面，通过使用新技术，如所附相关论文中所述的四倍体密码子，将非天然氨基酸掺入该方法中(因此所有其他19个氨基酸或它们的亚组，加上非天然氨基酸)。Neumann等。通过四倍体解码核糖体的演化来编码多个非天然氨基酸(Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome)，自然 464,441-444(2010年2月14日)。在这方面，进行CPE/CPS，从而掺入非天然氨基酸。
在另一个方面，合成构建整个CPE库(在市售机器上合成所有分子)。在此过程中，合成机器不能生成足够长的链，先合成片段然后连接生成全长分子。筛选该库，然后进行CPS，从而合成所需的突变。此为两步法，其中CPE之后进行CPS，不是仅CPE一步。
在另一个方面，产生并筛选CPE库，然后通过CPS合成增强型突变，如下：如果有10个增强型突变，用全部10个变化测试单个分子，然后检测所有的9个突变，然后是8个、7个、6个、5个等，直到一组内没有发现较之前任何组相比改进的分子。一旦鉴定出改进的分子，该过程可以终止。
在另一个方面，进行CPE，以确定增强型突变和中性突变的亲和力和表达，然后利用增强型突变和中性突变的组合进行CPS，然后再筛选该库以获得进一步改善的特性，如功能、亲和力和/或表达。
在另一个方面，对Fc或其它域的密码子进行CPE，以获得糖基化改变。
在另一个方面，进行CPE或CPE结合小分子RNA或内含子的CPS。
在另一个方面，进行CPE或CPE结合啮齿动物抗体CDR的CPS，然后筛选出增强型突变，随后人源化。
在一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，以产生在最终反应中导致所需突变的替代性中间核苷酸，例如，转化为尿嘧啶的甲基化胞嘧啶。
在一个方面，进行CPE或结合升级版CPS信息学的CPE，用于小鼠CDR向人类CDR的转化，反之亦然。
在一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，整个蛋白上间隔2个和3个突变。
在另一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，用于在双链载体中筛选评估敏感性增加的突变。
在进一步的方面，进行CPE或结合CPS的CPE，用于筛选变构变化。
任何几种筛选技术可用于评价CPE/CPS突变。在一个方面，CPE或结合CPS的CPE的突变可分泌并展示于真核宿主中。或者，可在大肠杆菌中产生并在真核宿主中筛选CPE或结合CPS的CPE的突变。在另一个方面，可在15个氨基酸或10个氨基酸处开始CPE，然后进行CPS；随后是余下的19个氨基酸。在另一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，用于演化特别是非表面氨基酸变化的蛋白。在一个方面，CPE可用于绘制多维抗原表位图谱。在另一个方面，CPE或结合CPS的CPE的筛选可在真核细胞中瞬时进行。在另一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，然后测序和所有克隆的阵列分析，例如在基于芯片或基于孔板的形式中进行表达和筛选。在另一个方面，通过在不同离子浓度中筛选，进行CPE或结合CPS的CPE，用于演化金属离子配位。在另一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE，并在不含细胞的条件下和非人类有机体中表达和筛选蛋白。在一个方面，进行干细胞的CPE或结合CPS的CPE的筛选，以获得对分化以及蛋白和RNA及mRNA的表达的不同影响。在另一个方面，进行CPE或结合CPS的CPE的多重筛选，以获得多个蛋白特性，像表达和结合。在另一个方面，对参与脑运输和跨膜的模板分子进行CPE或结合CPS的CPE；并从突变体中筛选出具有改善特性的突变。在一个方面，筛选CPE或结合CPS的CPE的突变体，以获得具有蛋白吸湿特性的突变。在另一个方面，检测CPE或结合CPS的CPE的突变体，以筛选出动态蛋白(dynamic protein)。在一个方面，在目标条件之外进行CPE或结合CPS的CPE的筛选，从而确定在目标条件以内的突变，反之亦然。
在一个实施方案中，上述CPE或结合CPS的CPE的任何方面可与选自CPI、CPD和结合CPI的CPD方法结合使用。
在另一个实施方案中，上述CPE或结合CPS的CPE的任何方面可与选自Flex演化及由模板进行的协同演化方法结合使用。
术语“模板”可指编码基础多肽或编码该多肽的多核苷酸。本领域技术人员应知晓，任何模板可用于本发明的方法和组合物中。可突变进而演化的模板可以用来指导另一种多肽或本发明所述的多肽库的合成。如本文更详细的描述，可演化的模板编码多肽的合成，并可随后用于解码多肽的合成过程，间接地扩增多肽和/或演化(即，多样化、筛选和扩增)多肽。在某些实施方案中，可演化的模板为核酸。在本发明的特定实施方案中，所述模板基于核酸。在其它实施方案中，所述模板为多肽。
本发明中使用的核酸模板由DNA、RNA、DNA和RNA的杂合体，或DNA和RNA的衍生物组成，且可能是单链或双链。模板序列用于编码多肽，优选不组装的或不发生组装的化合物、核酸或核酸类似物(例如，非天然聚合物或小分子)的合成。在某些非天然聚合物的情况下，所述核酸模板用于对齐序列中将出现在聚合物中的单体单元，使它们沿模板与相邻的单体接近，从而它们将会发生相互反应并通过共价键连接。在某些其它实施方案中，通过PCR扩增由核苷酸的随机区组成的合成的DNA模板库，所述模板可用于产生非天然聚合物。
应知晓所述模板的碱基数目可大不相同。例如，在某些实施方案中，所述模板可为10-10000个碱基长，优选10-1000个碱基长。当然所述模板的长度将取决于密码子的长度，库的复杂程度，要合成的非天然聚合物的长度，要合成的小分子的复杂程度，空间序列的使用等。可采用本领域已知的任何制备核酸序列的方法来制备所述核酸序列。这些方法包括体内和体外方法，包括PCR、质粒制备、内切酶消化、固相合成、体外转录、链分离等。在某些实施方案中，用DNA自动合成仪来合成所述核酸模板。
如上所述，在本发明的某些实施方案中，所述方法用于合成不组装的多肽或不发生组装的多肽、核酸或核酸类似物。因此，在本发明的某些实施方案中，所述核酸模板包括编码非天然聚合物或小分子的合成的碱基序列。在所述核酸模板中编码的信息优选起始于可形成化学反应位点的特定密码子，从该位点可发生聚合反应，或在合成小分子的情况下，所述“起始”密码子可编码与小分子骨架或第一种反应物相关的反密码子。本发明的“起始”密码子与编码蛋氨酸的“起始”密码子，ATG相似。
在本发明的其它实施方案中，所述核酸模板本身可被修饰成包括用于合成聚合物(例如，亲核试剂)或小分子骨架的起始位点。在某些实施方案中，所述核酸模板的一个末端包括以反应基团结束的发夹环，用于起始所述单体单元的聚合。例如，DNA模板可包括以5'-氨基基团结束的发夹环，其中5'-氨基可被保护或不被保护。非天然聚合物的聚合可以从氨基基团开始。反应氨基基团也可用来将小分子骨架连接到所述核酸模板上，从而合成小分子库。
为了终止非天然聚合物的合成，所述核酸模板中应包括“终止”密码子，优选在编码序列的末端。本发明的“终止”密码子与mRNA转录物中发现的“终止”密码子(即，TAA、TAG、TGA)类似。这些密码子导致蛋白合成的终止。在某些实施方案中，选择与用于编码非天然聚合物的人工遗传密码子相容的“终止”密码子。例如，该“终止”密码子不应与任何用于编码所述合成的其它密码子相冲突，它应与该模板中使用的其它密码子为相同的常见模式。“终止”密码子可编码通过不供给用于进一步添加的反应基团而终止聚合反应的单体单元。例如，终止单体单元可包含封闭反应基团(blocked reactive group)如乙酰胺而不是伯胺。在其它实施方案中，所述终止单体单元包括生物素标记的末端，其提供终止所述聚合步骤和纯化所得聚合物的便捷方式。
在一个实施方案中，诱变的DNA产物直接用作对应的突变蛋白体外合成的模板。由于可在单个残基位置上形成全部19个氨基酸替换的高效率，使得单独地或与蛋白内的其它突变相结合地，在多个目标残基上进行饱和诱变是可行的。本文使用的“完全饱和”突变，定义为在蛋白内用其它19个天然产生的氨基酸替换给定的氨基酸。例如，基因的定点饱和突变，系统地探讨了沿蛋白序列所有可能的单氨基酸替换的最低可能性，见Kretz等,酶学方法(Methods in Enzymology)，2004,388:3-11；Short,美国专利No.6,171,820；及Short,美国专利No.6,562,594，其分别通过参考并入于此。
在一个方面，本发明提供密码子引物(含简并N,N,G/T序列)的应用以将点突变引入核苷酸，从而产生一组子代多肽，其中在每个氨基酸位置上进行全方位的单氨基酸替换(见美国专利No.6171820；另见，美国专利No.5677149，其分别通过参考并入于此)。使用的寡核苷酸由第一同源序列，简并N,N,G/T序列，以及优选但非必需的第二同源序列连续组成。使用这些寡核苷酸得到的下游子代翻译产物，包括沿所述多肽的各个位置上所有可能的氨基酸变化，由于所述N,N,G/T序列的简并性包括所有20个氨基酸的密码子。
密码子的使用是真核基因表达中的重要因素之一。不同密码子的使用频率在不同宿主之间，以及在相同的有机体中以高或低的水平表达的蛋白之间存在显著的不同。这种差异最可能的原因是偏爱密码子与胞内同源tRNA的丰度有关。它可能是密码子使用和tRNA受体浓度为共同演化，而这种共同演化的选择压力对于高表达的基因比低水平表达的基因更明显。
在一个方面，这样一种简并寡核苷酸(由简并N,N,G/T盒组成)用于使亲本多核苷酸模板的每个起始密码子经过全方位替换。在另一个方面，至少使用两个简并N,N,G/T盒--在相同的寡核苷酸或不同的寡核苷酸中，使亲本多核苷酸模板的至少两个起始密码子经过全方位替换。因此，一条寡核苷酸中可包含一种以上的N,N,G/T序列，从而在一个以上的位点中引入氨基酸突变。这些多个N,N,G/T序列可以为直接连续的，或由一个或多个额外核苷酸序列隔开。在另一个方面，适用于引入添加和缺失的寡核苷酸，可单独或与含有N,N,G/T序列的密码子结合使用，从而引入氨基酸添加、缺失和/或替换的任意组合或排列。
在另一个方面，本发明提供简并性低于N,N,G/T序列的简并盒的应用。例如，在某些情况下使用(例如，在寡核苷酸中)仅由N组成的简并三联体是可取的，其中所述N可以在该三联体的第一、第二或第三位置上。任何其它碱基包括它们的任意组合及排列可用于该三联体的其余两个位置上。或者，在某些情况下使用(例如，在寡核苷酸中)简并N,N,N三联体是可取的。
然而，应知晓，出于几个原因，使用本文公开的简并N,N,G/T三联体是有利的。在一个方面，本发明提供在多肽的每个氨基酸位置上系统地且相当容易地形成可能的氨基酸(共20个氨基酸)全方位替换的方法。因此，对于100个氨基酸的多肽而言，本发明提供系统地且相当容易产生2000个不同物种(即每个位置20个可能的氨基酸×100个氨基酸位置)的方法。应知晓，通过使用含简并N,N,G/T三联体的寡核苷酸，提供32条分别编码20种可能氨基酸的序列。因此，在用一种这样的寡核苷酸对亲本多核苷酸序列进行饱和突变的反应容器中，产生编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相比之下，在定点诱变中使用非简并寡核苷酸导致每个反应容器中只有一种子代多肽产物。
因此，在优选的实施方案中，每个饱和突变反应容器包含编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸，这样所有20种氨基酸在对应于所述亲本多核苷酸的突变密码子位置的一个特定氨基酸位置上出现。可以对由每个饱和突变反应容器产生的32倍简并子代多肽进行克隆扩增(例如，用表达载体克隆到合适的大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当通过筛选鉴定出呈现属性变化(与模板多肽相比)的单个子代多肽时，可对其测序以确定与多肽中所含的这种变化有关的氨基酸替换。
所述模板多肽可以是任何蛋白，但优选便于检测活性如催化活性或配体结合的蛋白。本文使用的配体是与较大分子特异结合的任何分子，如结合蛋白的小分子。目标相互作用的代表性实例包括催化、酶-底物相互作用、蛋白-核酸相互作用、受体-配体相互作用、蛋白-金属相互作用和抗体-抗原的相互作用。代表性的靶蛋白包括酶、抗体、细胞因子、受体、DNA结合蛋白、螯合剂和激素。
任何化学合成或重组诱变的方法可以用来产生突变多肽群体。除非另有说明，本发明的实际操作可使用本领域技术人员已知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中充分说明。例如，见分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第二版，Sambrook,Fritsch和Maniatis(冷泉港实验室出版社：1989)主编；DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和卷II(D.N.Glover主编,1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主编,1984)；Mullis等，美国专利No：4683195；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins主编,1984)；转录和翻译(Transcription And Translation)(B.D.Hames&S.J.Higgins主编,1984)；动物细胞培养(Culture Of Animal Cells)(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；固定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社,1986)；B.Perbal，分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；专题论文，酶学方法(the treatise,Methods In Enzymology)(Academic Press,Inc.,纽约)；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)(J.H.Miller和M.P.Cabs主编,1987,冷泉港实验室)；酶学方法(Methods In Enzymology)，卷154和卷155(Wu等主编)；细胞和分子生物学中的免疫化学法(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(Mayer和Walker主编,学术出版社，伦敦，1987)。免疫学实验手册(Handbook Of Experimental Immunology)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986)；小鼠胚胎操作技术(Manipulating the Mouse Embiyo)，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1986)。
在一个实施方案中，所述模板多肽为抗体。所述抗体采用本文所述的方法，例如，绘制图谱并确定CDR内的哪些位置影响结合亲和力。制备技术和使用各种抗体构建体及其片段是本领域众所周知的。本发明的一个重要方面是确定在目标分子的相互作用中发挥或可能发挥作用的残基(如抗原-抗体相互作用、金属螯合、受体结合、底物结合等)。可使用本发明的任何抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，任何演化平台CPE、CPI、CPD和CPS可用于产生激动剂抗体，即激活抗体。这些演化技术使得可以基于简单蛋白交联型激活之外产生激动剂抗体，特别是使得可以激活受体如传统上由肽激活的GPL-1或2。
在一个方面，使用FACS或显微镜筛选抗体，或用相当的用于筛选弱激活抗体的方法筛选抗体，其使用当细胞表面的受体被激活时所具有的荧光信号会发出荧光的细胞。随后，使用演化工具以增强这种激活。然后使用CPS技术来合成增强型突变。
在另一个方面，选择结合由抗原表位图谱确定的受体激活位点的抗体。CPE、CPI和/或CPD技术用于筛选出由胞内读数如响应钙离子释放的荧光或其它本领域已知的检测确定的引起受体刺激的突变。然后利用CPS技术合成增强型突变。
在一个特定方面，具有单个、两个或三个氨基酸插入的CPI的一些关键优势在于，这些插入的氨基酸可延伸至受体的结合口袋中，从而激活该受体。在另一个特定方面，CPD可重新改造和/或重新定位与该实体相互作用的氨基酸，以改善或影响激活，并且最终CPE可发生相对较小的变化从而影响受体激活。
抗体的特异性由在所述轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)内的互补性决定区(CDR)来确定。约为完整抗体的三分之一大小的抗体的Fab片段包含重链和轻链可变区、完整的轻链恒定区和重链恒定区的一部分。由于恒定区序列所起的作用，Fab分子是稳定的且结合较好。然而，表达于细菌系统中的功能性Fab的产量低于只包含重链和轻链可变区的较小Fv片段。所述Fv片段是仍保留了功能性的抗原结合位点的抗体最小部分。所述Fv片段具有与Fab相同的结合属性，但是没有恒定区所赋予的稳定性，所述Fv的两条链在稀释条件下可以相对容易地解离。
在一个方面，VH和VL区可通过多肽接头进行融合(Huston等，1991)，以稳定所述抗原结合位点。这种单个多肽Fv片段被称为单链抗体(scFv)。VH和VL可以任一区域在前排列。所述接头将第一链的羧基末端连接到第二链的氨基末端。
本领域技术人员应知晓，单链Fv、重链或轻链Fv或Fab片段可用于该系统。可诱变重链或轻链，然后向溶液中加入所述互补链。然后将两条链结合起来并形成功能性抗体片段。加入随机非特异性轻链或重链序列可形成组合体系(combinatorial system)以产生不同成员的库。
一般来说，产生单链表达多核苷酸。所述表达多核苷酸包含：(1)由VH域、间隔肽和VL域组成的可操作地连接以编码单链抗体的单链抗体盒，(2)适合用于体外转录的启动子(例如，T7启动子、SP6启动子等)，其可操作地连接以确保单链抗体盒在体外转录形成编码单链抗体的mRNA，以及(3)适合于在体外转录反应中发挥功能的转录终止序列。任选地，所述表达多核苷酸还可包括复制起始和/或筛选标记。合适的表达多核苷酸的一个实例为pLM166。
可方便地从由使用V基因家族特异性引物或V基因特异性引物的PCR扩增产生的VH和VL序列库中获得VH和VL序列(Nicholls等J.Immunol.Meth.,1993,165:81；W093/12227)，或根据本领域已知的标准方法，基于可获得的序列信息设计VH和VL序列。通常，小鼠或人类的VH和VL序列是分离的。然后常用间隔序列(例如编码框内柔性间隔肽)连接VH和VL序列，以形成编码单链抗体的盒。通常，使用含大量VH和VL序列的库(有时也用大量呈现的间隔肽)，其中该库是用一种或多种VH和VL突变序列构建的，以增加序列多样性，特别是在CDR残基，有时是在框架残基的序列多样性。V区序列可方便地克隆为用于表达免疫球蛋白的细胞的cDNA或PCR扩增产物。例如，合成细胞表面或分泌的免疫球蛋白的来自人类杂交瘤细胞或淋巴瘤或其它细胞系的细胞可用于polyA+RNA的分离。然后，使用逆转录酶，所述RNA用于前端带寡聚dT的cDNA的合成(一般方法参见，Goodspeed等，基因(Gene)1989，76:1；Dunn等,J.Biol.Chem.,1989,264:13057)。一旦分离出V区cDNA或PCR产物，即将它克隆到载体上以形成单链抗体盒。
为了完成抗体和抗体片段的构建，分离和鉴定出所述编码基因。所述基因可被修饰，使其可以克隆到表达载体中或适于体外转录/翻译。虽然可以使用方法如从杂交瘤cDNA中用探针检测VH和VL区的DNA(Maniatis等，1982)，或构建VH和VL区的合成基因(Barbas等，1992)，然而方便的方式是使用模板定向方法来扩增抗体序列。根据称为框架的可变区3'和5'端的保守序列或抗体恒定区来设计引物，可从模板样品中扩增出大量不同的抗体基因(Iverson等，1989年)。可在引物内设置限制位点，以便于克隆到表达载体中。通过引导所述引物到这些保守区上，保持抗体群体的多样性，从而可以构建各种库。可根据所述引物序列的筛选，如用于所有抗体类型的大量序列，见Kabat等，1987，其通过参考并入于此，而定义抗体的具体种类。
从动物脾或外周血中分离的信使RNA可用作扩增抗体库的模板。在某些情况下，在细胞表面上展示大量同源的抗体片段是可取的，可从大量单克隆抗体中分离出mRNA。可采用标准方法来制备任一种来源的信使RNA，并可直接用于或用于cDNA模板的制备。可以按照众所周知的抗体制备和特性分析的方法来生成用于克隆抗体的mRNA(例如见，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，1988；其通过参考并入于此)。
一般按照制备多克隆抗体同样的方法来生成单克隆抗体(MAb)。简言之，多克隆抗体是通过用相应的免疫原性组合物免疫动物并收集免疫动物血清而制备的。广泛的动物种类可用于抗血清的制备。通常用于生产抗血清的动物是兔子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。由于兔子相对较大的血量，通常优选兔子用来生产多克隆抗体。
免疫原性组合物的免疫原性往往各不相同。因此，增强宿主的免疫系统往往是必要的，可通过将肽或多肽免疫原偶联载体来实现。典型的和优选的载体为锁孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。已知的将多肽偶联至载体蛋白上的方法是众所周知的，包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和双-重氮化联苯胺。
特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用称为佐剂的免疫响应非特异性刺激剂而增强。典型的和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含灭活结核分枝杆菌的免疫响应非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于多克隆抗体生产的免疫原组合物的用量根据免疫原的性质以及所使用的免疫动物而不同。多种途径可用于免疫原的施用(皮下注射、肌肉注射、皮内注射、静脉注射和腹腔注射)。可通过免疫后在不同点采集免疫动物的血液来监测多克隆抗体的产生。也可给予第二次加强免疫注射。反复进行加强免疫和滴定的方法，直到达到合适的滴度。当获得所需水平的免疫原性后，可采集免疫动物的血液并分离血清，存储，摘取自多克隆响应或动物的用于分离出mRNA的脾可用于产生MAbs(单克隆抗体)，从而从同源抗体群体中分离出mRNA。
可使用众所周知的技术容易地制备MAbs，如美国专利No.4196265中例举的，其通过参考并入于此。通常，这种技术涉及到用选定的免疫原组合物，如与载体相连的免疫小分子半抗原、纯化或部分纯化的蛋白、多肽或肽，来免疫合适的动物。施用的免疫组合物应能够有效地刺激产生抗体的细胞。啮齿动物，如小鼠和大鼠为常用动物；然而，也可使用兔、绵羊、青蛙细胞。使用大鼠的可提供某些优势(Goding，60-61页，1986)，但优选小鼠，特别是BALB/c小鼠，因为它是最经常使用的且通常具有更高的稳定融合比例。
免疫后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，以用于该产生MAbs的方案中。可从经过活检的脾、扁桃体或淋巴结或从血样中获得这些细胞。优选脾细胞和血细胞，前者是因为它们是处于浆细胞分裂阶段的产抗体细胞的丰富来源，而后者是因为血液易于获得。通常，会免疫一组动物，然后摘取抗体滴度最高的动物的脾，用注射器匀浆所述脾以获得脾淋巴细胞。通常，免疫小鼠的脾约含5×107-2×108个淋巴细胞。
然后将从免疫动物中获得的产抗体的B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞融合，通常为与免疫动物相同物种中的一种。适用于融合生产杂交瘤细胞方法的骨髓瘤细胞系优选不产生抗体，融合效率高，酶缺失使其不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤细胞)生长的特定选择培养基中生长。
可使用本领域技术人员已知的多种骨髓瘤细胞中的任一种(Goding,65-66页,1986；Campbell,1984)。例如，如果免疫动物是小鼠，人们可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠而言，人们可以使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6可用于人类细胞融合。
一种优选的小鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称P3-NS-1-AG4-1)，其可通过查询细胞系保藏号GM3573容易地从NIGMS人类遗传突变细胞库中获得。可使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系为抗8-氮杂鸟嘌呤小鼠骨髓瘤SP2/0非生产细胞系。
形成产抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂合体的方法通常包括，在促进细胞膜融合的制剂(化学的或电学的)存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，尽管这一比例可分别为约20:1-约1:1。使用仙台病毒的融合方法见Kohler&Milstein(1975；1976)，用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的融合方法见Gefter等，1977。也可使用电诱导的融合方法(Goding 71-74页，1986)。
融合方法通常以约1×10-6-1×10-8的低频率产生杂合体。然而，这并不构成问题，因为通过在选择培养基中进行培养，从亲本、非融合细胞(特别是通常会继续无限分裂的非融合骨髓瘤细胞)中分化出融合杂合体。通常选择培养基含有能够阻断核苷酸在组织培养基中从头合成的制剂。典型的和优选的制剂是氨蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤的合成。使用氨蝶呤或甲氨蝶呤的情况下，向培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧作为核苷酸源(HAT培养基)。使用重氮丝氨酸的情况下，向培养基中添加次黄嘌呤。
优选的筛选培养基为HAT。只有能够进行核苷酸补救合成途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径中的关键酶，例如，次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)，因此它们无法存活。B细胞可进行该途径，但它们在培养基中寿命有限，一般大约两周内死亡。因此，能够在选择培养基中存活的细胞只是那些由骨髓瘤细胞和B细胞形成的杂合体。
这种培养提供了大量杂交瘤细胞，以从其中筛得特定的杂交瘤细胞。通常，通过在微量滴定板上对单克隆进行稀释并培养细胞，然后检测各克隆上清(大约两到三周后)中具有所需反应性的克隆，从而筛选杂交瘤细胞。简单和快速的检测包括放射性免疫检测、酶免疫检测、细胞毒性检测、菌斑试验、斑点免疫结合检测等。
对选定的杂交瘤细胞进行系列稀释，并分别克隆到产抗体的细胞系中以对克隆进行无限增殖，生产克隆抗体。可通过两种基本方式将该细胞系用于单克隆抗体的生产。可将杂交瘤细胞样本注射到可用于提供进行原始融合的体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物的体内(通常是注射入腹膜腔)。经过注射的动物体内形成肿瘤，分泌出由所述融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体(MAb)。然后抽出(tap)动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的MAbs。单独的细胞系也可在体外培养，MAbs被自然分泌到培养基中，从而可以很容易地获得高浓度的MAbs。由以上两种方法中的任一种生产的单克隆抗体可进一步纯化，如果需要的话，通过过滤、离心和各种色谱方法，如HPLC或亲和层析。
对目的mRNA单克隆抗体进行分离和特性分析后，可使用本领域众所周知的技术分离得到所述mRNA模板，并作为用于扩增靶序列的模板。
突变前和突变后，可采用许多依赖模板的方法来扩增靶序列。最常用的一种扩增方法是聚合酶链式反应(简称PCR)，详细描述于美国专利No.4683195、No.4683202和No.4800159，以及Innis等，1990中，均通过全文参考并入于此。简单地说，在PCR中，制备两条与靶序列的相反互补链上的区域互补的引物序列。过量的脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，如Taq聚合酶，一起添加到反应混合物中。如果样品中存在有靶序列则引物将结合到靶序列上，通过添加核苷酸，聚合酶将使得该引物沿着靶序列延伸。通过提高和降低反应混合物的温度，延长的引物将从靶序列上分离以形成反应产物，过量的引物将结合到靶序列上，并重复这一过程。为了对扩增的靶序列进行定量，优选进行反转录PCR扩增。聚合酶链式反应方法是本领域众所周知的。利用酶的扩增技术如PCR，目标调控元件(elements)可被设计到所述引物中，从而整合至DNA产物中。
另一种扩增方法是连接酶链式反应(“LCR”)，公开于EPA No.320 308本发明提供，通过全文参考并入于此。在LCR中，制备两对互补的探针，并在靶序列存在下，每对探针将结合到靶序列相反的互补链上，使它们毗连。在连接酶存在下，两对探针将连接形成一个单元。如同在PCR中，通过温度循环，结合的连接单元从靶序列上分离，然后作为“靶序列”用于连接过量探针对。美国专利No.4883750描述了与LCR类似的使探针对结合到靶序列上的方法。
Qbeta复制酶，描述于PCT申请PCT/US87/00880中，也可作为一种扩增方法。在该方法中，在RNA聚合酶存在下，将含有与靶序列互补的区域的RNA复制序列加至样品中。所述聚合酶将复制该复制的序列，然后对其进行检测。
核苷酸的扩增也可使用等温扩增法，其中限制性内切酶和连接酶用于实现靶分子的扩增，在所述靶分子一个限制位点的一条链中含有核苷酸5'-[α-硫代]-三磷酸(Walker等，1992年)。
链置换扩增(SDA)是另一种进行核酸等温扩增的方法，其涉及多个回合的链置换和合成，即缺口平移。类似的方法，称为修复链式反应(RCR)，涉及到在扩增靶区域上几种探针的退火，然后进行修复反应，在修复反应中只存在四种碱基中的两种。其它两种碱基可作为便于检测的生物素化的衍生物而添加。类似的方法用于SDA中。也可使用循环探针反应(CPR)来检测特定的靶序列。在CPR中，使具有非特异性DNA的3'和5'序列以及特异性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA进行杂交。杂交后用RNaseH处理反应物，从而鉴定出经过酶消化后释放的不同的(distinctive)探针产物。原始模板与另一种循环探针进行退火，并重复反应。
其它扩增方法描述于GB申请No.2 202 328和PCT申请No.PCT/US 89/01025中，均通过全文参考并入于此，其可用于本发明中。在前一个申请中，“修饰的”引物被用于PCR的模板和酶依赖的合成中。通过用捕获基团(如，生物素)和/或检测基团(如酶)进行标记来对引物进行修饰。在后一个申请中，向样品中加入过量的标记探针。在靶序列存在下，所述探针结合到靶序列上并催化裂解。裂解后，靶序列被完整释放，以与过量探针结合。标记探针的裂解，表明了靶序列的存在。
其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989)。在NASBA中，可采用以下方法制备用于扩增的核酸：标准酚/氯仿抽提法、临床样本的热变性、用裂解缓冲液处理并用minispin柱分离DNA和RNA法或RNA的盐酸胍提取法。这些扩增技术涉及使含有特异靶序列的引物发生退火。聚合后，用RNase H消化DNA/RNA杂合体，同时双链DNA分子再次发生热变性。在每种情况下，通过加入第二条特异靶引物，然后进行聚合反应，使单链DNA完全变成双链。然后经聚合酶如T7或SP6对双链DNA分子进行大量转录。在等温循环反应中，所述RNA被反转录成双链DNA，并用聚合酶如T7或SP6再转录一次。所产生的产物，无论是截短的或完整的产物，都表明生成了特异靶序列。
Davey等，EPA No.329 822(通过全文参考并入于此)公开了涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增方法，可用于本发明中。所述ssRNA是第一引物寡核苷酸的第一模板，其通过逆转录酶(RNA依赖的DNA聚合酶)延伸。然后通过核糖核酸酶H(RNase H，对RNA-DNA二聚体或RNA-RNA二聚体特异的RNase)的作用，从得到的DNA:RNA二聚体中去掉RNA。得到的ssDNA作为第二引物的第二模板，其还包括与所述模板同源的RNA聚合酶启动子(以T7RNA聚合酶为例)5'序列。然后，采用DNA聚合酶延伸该引物(以大肠杆菌DNA聚合酶I的“Kienow”大片段为例)，得到双链DNA(“dsDNA”)分子，其具有与引物之间的原始RNA相同的序列，另外，在一末端具有启动子序列。该启动子序列可以被适当的RNA聚合酶利用，以产生所述DNA的许多RNA拷贝。然后这些拷贝可以重新进入循环，导致非常迅速的扩增。通过选择适当的酶，这种扩增可在等温下进行，而无需在每个循环添加酶。由于该法的循环性质，起始序列可选择DNA或RNA的形式。
Miller等，PCT申请WO 89/06700(通过全文参考并入于此)公开了基于启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssDNA”)杂交的核酸序列扩增过程，然后是该序列的许多RNA拷贝的转录。该过程不是循环的，即新的模板不从由RNA转录物产生的。其它扩增方法包括“race”和“单边PCR(one-sided PCR)”(Frohman,1990；O'Hara等,1989)。
在含有得到的“双-寡核苷酸”序列的核酸存在下，基于两条(或两条以上)寡核苷酸的连接，从而扩增所述双-寡核苷酸的方法也可用于扩增步骤(Wu等。1989)中。
可采用标准方法对扩增产物进行琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(例如见，Maniatis等，1982)。例如，我们可以使用溴化乙锭对1％琼脂糖凝胶进行染色，并在紫外光下观察。或者，所述扩增产物可以是整体被放射性或荧光标记的核苷酸。然后可将凝胶分别进行x-光片(x-ray film)曝光或在适当的激发光谱下进行观察。
本发明的诱变方法可包括任何能够适合于(be tailored to)基因上特定位点的诱变方法，即定点或特异位点突变。由于本发明依赖于全面诱变，本发明以那些快速、高效和符合成本效益的诱变方法为优选实施方案。
在一个实施方案中，突变方法利用了化学合成技术。这样做，可以在该基因的一个或多个特定位置上进行精确地替换，且还能够具体确定改变的性质。DNA的化学合成方法是本领域众所周知的。在这方面优选固相技术。
基因合成的固相法一个优点在于，使用组合合成技术进行突变的机会。组合合成技术被定义为通过按序连接不同的组成单元(building block)，从而同时产生化合物的大型集合或库的那些技术。建库可以使用溶液中游离的化合物，但优选化合物连接于固定支持物如珠(bead)、固体颗粒上，或甚至展示于微生物的表面上。
存在的几种组合合成方法(Holmes等，1995；Burbaum等，1995；Martin等，1995；Freier等，1995；Pei等，1991；Bruce等，1995；Ohlmeyer等，1993)包括拆分合成(split synthesis)或并行合成(parallel synthesis)。拆分合成，可用于产生少数相对较大数量的化合物，而并行合成将产生多数较少数量的化合物。总体而言，使用拆分合成，化合物合成于微粒表面上。在每一步中，所述微粒被分成几个组用于下一组分的添加。然后重组所述不同的组并分成新的组。重复该过程，直到完成该化合物。每个微粒含有相同化合物的几个拷贝，使得能在表面分离和纯化。拆分合成只能发生于固定支持物上。
另一项技术称为并行合成可发生于固相或溶液中。使用并行合成，通常使用自动化在单独容器中合成不同的化合物。并行合成可在微量滴定板上进行，可通过预定的方式向各孔中加入不同的试剂，从而制备组合库。并行合成是使用酶技术中的优选方法。已知该项技术已有多种改进，可适用于本发明。使用组合方法，可合成大量的突变基因模板。
还可采用本领域已知的半合成方法(Barbas等，1992)产生突变基因。使用抗体片段的保守区作为框架，可变区可以是一次一个或一次多个以随机组合的方式插入，以改变所述抗体片段的特异性并产生新的结合位点，特别是产生不利于有毒或不稳定化合物免疫的、作用于抗原的抗体。按照同样的思路，可通过随机引入突变使已知的抗体序列发生变化。可采用本领域众所周知的方法，如使用易错PCR来完成。
使用合适的寡核苷酸引物，进行PCR以快速合成所述结合蛋白基因中含有一个或多个突变的DNA模板。可使用特定位点突变(Site-specific mutagenesis)技术，通过对基本DNA(underlying DNA)的特定突变，制备单条肽或生物功能相当的蛋白或多肽。结合之前的一种或多种考虑，通过向所述DNA中引入一种或多种核苷酸序列的变化，该技术进一步提供现成的制备和检测序列突变的能力。通过使用编码所需突变的DNA序列的寡核苷酸序列以及足够量的相邻核苷酸，特定位点突变可产生突变体，以提供足够大小及序列复杂程度的引物序列，从而在横贯于该缺失连接处的两侧形成稳定的二聚体。通常，优选约17-25个核苷酸长度的引物，该序列连接处两侧的约5-10个残基将发生改变。
该技术通常使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括如M13噬菌体载体。这些噬菌体载体可市售获得，且它们的使用通常是本领域众所周知的。双链质粒也经常用于定点诱变中，从而省却了将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。
一般情况下，定点诱变首先是获得单链载体，或融合序列中含有编码目的蛋白的DNA序列的双链载体的两条链。综合地制备出带有目标突变序列的寡核苷酸引物。然后，在选择杂交条件时，应考虑到错配的程度，该引物与单链DNA制剂退火，然后发生DNA聚合反应，使用酶如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段，从而完成含突变链的合成。因此，形成异源双链，其中一条链编码原始的非突变序列，而第二条链含有所述目标突变。然后用该异源双链载体转化适当的细胞，如大肠杆菌细胞，筛选出含有所述突变序列排列的载体克隆。
提供利用定点诱变制备选定基因的突变序列的方法，从而产生可能有用的物种，然而不限于此，可通过其它方法来获得基因的突变序列。例如，可用诱变剂，如羟胺处理编码所述目的基因的重组载体，从而获得突变序列。
在某些应用中，应理解通过定点诱变的氨基酸替换需要较低的严格条件。在这些条件下，即使探针和目标链的序列不完全互补，也可能发生杂交反应，但会在一个或多个位置上发生错配。通过增加盐浓度和降低温度可使条件变得较不严格。例如，培养基严格条件应提供约0.1-0.25M NaCl，约37℃-约55℃，而低的严格条件应提供约0.15M-约0.9M的盐，温度范围从约20℃-约55℃。因此，可以容易地控制杂交反应条件，从而通常会根据所需结果来选择方法。
在其它实施方案中，杂交可以在以下条件下实现，例如，50mM Tris-HCl(pH 8.3),75mM KCl,3mM MgC12,10mM二硫苏糖醇，温度约20℃～约37℃。可以使用的其它杂交条件包括约10mM Tris-HCl(pH 8.3),50mM KCl,1.5μM MgC12,温度约40℃～约72℃。甲酰胺和SDS也可用于改变杂交条件。
在一个特定的实施方案中，可使用重叠PCR。简言之，质粒作为第一轮PCR的模板。纯化第一轮的PCR产物，并连同外侧引物用于重叠延伸PCR反应。终产物中含有所有其它可能的氨基酸残基对给定的氨基酸的定点替换。
目的多肽的突变DNA模板可被克隆到质粒中，用于体外转录/翻译，或在一个优选实施方案中，所述PCR产物内包含直接在体外进行转录/翻译的适当调控元件。基因的体外转录/翻译使用不含细胞的提取物，以提供所需的酶、核糖体和蛋白因子。由从目的DNA模板合成的mRNA指导蛋白合成。所述DNA模板一定含有供该系统使用的适当调控元件，包括核糖体结合位点和启动子序列。本领域技术人员应清楚地知晓每种系统所需的适当元件。
首先使用的是用于蛋白生产的体外原核技术(Zubay等，1970)。随后开发出利用小麦胚芽(Roberts，1973)和兔网织红细胞(Pelham，1976)的真核系统。若干新的研发提高了这些技术的效率。实例包括，用以提高效果的大肠杆菌核酶缺陷株的开发，其是采用线性DNA模板(Yang，1980)并用微球菌的核酶处理网织红细胞裂解物，以降低系统的任何背景表达。
最近在通过噬菌体RNA聚合酶，包括SP6和SP7进行转录的基础上开发出体外转录/翻译系统(Krieg，1987，Studier，1990)。处于T7启动子元件控制下的DNA可用作由T7RNA聚合酶启动的体外转录模板，或用于通过向原核或真核细胞蛋白合成系统中加入所述聚合酶从而实现在体外完全的转录/翻译。尽管本发明的方法可用于任何体外转录/翻译系统，所述T7系统优选用于转录，且由于所述RNA无需加帽，优选使用原核翻译系统。
利用体外翻译的方法，通过向蛋白合成系统混合物中加入氨基酸衍生物，可使氨基酸衍生物整合至该蛋白中。改变相关标准氨基酸衍生物的浓度，人们可以得到混合的集合并测定相对的影响。
本发明所产生的突变多肽可使用各种技术来进行特性分析。一般情况下，可使用SDS-PAGE来分析蛋白产物的精确表观分子量。这初步表明事实上合成了所述多肽。当与天然分子比较时，它还表明了是否正常折叠或加工与突变一起发生。在这方面，标记所述多肽被证明是有用的。或者，可通过凝胶染色来确定所述多肽。
除合成之外，可根据不同的属性和广泛的功能特点来定性分析蛋白。属性包括等电点、热稳定性，沉降率和折叠。检测折叠的方式之一是被同源结合伴侣识别的能力。这种功能的最初的实例是抗原-抗体的相互作用。多种不同的免疫分析法可用于此目的，且为本领域技术人员众所周知。原则上，当所述蛋白与特定的配体或多组相关配体接触时，可检测到亲和力或特异性的变化。
免疫分析通常可分为两类：需要多个分别的步骤的异相分析(heterogeneous assays)和可以直接进行的同相分析(homogeneous assays)。异相免疫分析一般包括固定于固体基质上的配体或抗体。使含有配体的样品与固定的抗体接触，并根据直接或间接地与该固定复合物相连的标签来测定在所述基质支持物上形成的复合物的量。在本发明中，配体是指与不完全相同的分子相互作用从而形成紧密结合的稳定复合物的物质。出于操作目的，所述结合亲和力通常大于约106M-1，优选109-1015M-1。所述配体可为几种类型的有机分子中的任一种，包括脂环烃、多核芳香烃、卤代化合物、苯环型化合物、多核碳氢化合物、氮杂环、硫杂环、氧杂环、烷烃、烯烃、炔烃碳氢化合物等，特别值得关注生物分子包括氨基酸、多肽、蛋白、脂类、糖类、核酸和它们的组合。当然，应知晓这些仅是通过举例的方式，只要能够获得结合目标配体的抗体，可考虑采用适用于检测极其广泛的化合物的免疫分析法。
异相免疫分析可作为免疫夹层法来进行，其中目标分子与能够以高亲和力与该分子特异性结合的固定的抗体发生相互作用。在第二步中，由相同或不同的抗体与抗原形成的共轭物和标记分子与固定基质上的抗原-抗体复合物发生反应。去除过量的游离标记共轭物后，测定与样品中配体的量成正比的所述结合的标记共轭物。
免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的，可通过众多方法的应用来实现。这些方法通常是基于标签或标记的检测，如放射性、荧光、化学发光、电化学发光、生物或酶标记或本领域已知的标签中的任一种。有关这种标签的使用的美国专利，包括美国专利Nos.3817837、3850752、3939350、3996345、4277437、4275149和4366241各自通过参考并入于此。当然，如本领域已知的，通过使用第二种结合配体，如二抗或生物素/亲和素配体结合的排列，我们可以发现其它的优势。
优选的检测方法包括放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)，由于普遍提高的灵敏度，ELISA法是最受欢迎的。ELISA被广泛用于生物技术应用中，特别是免疫分析法适用于广泛的抗原性物质。ELISA的灵敏度是基于酶的信号放大。
依据本发明，优选使用的其它蛋白是那些便于活性检测的蛋白。目标物相互作用的代表性实例包括催化、酶-底物相互作用、蛋白-核酸相互作用、受体-配体相互作用和蛋白-金属相互作用。在这些检测中，突变的蛋白可与野生型蛋白在行使上述任何功能的能力上进行变化比较。
本文使用的术语“接触”被定义为，使所述反应组分相互靠近至足以使得所需的相互作用发生。接触可通过在溶液中混合所述组分来实现，例如，或通过异相相互作用，如通过流经结合组分之一的柱或固定化基质进行流动接触。
对于具有催化活性的蛋白，适当的反应可通过催化速率的变化或特异性的改变来监控。
筛选由本发明方法生产和分离出的能够与预定靶标结合的抗体。通常，鉴于所述预定靶标作为诊断和/或治疗靶标应用而进行筛选。所述预定靶标可以是已知的或未知的抗原表位。通常抗体以至少约l×107M-1的亲和力，优选至少约5×107M-1的亲和力，更优选以至少l×108M-1-l×109M-1或以上，有时高达l×1010M-1或以上的亲和力，结合预定的抗原(如免疫原)。通常，预定的抗原是人类蛋白，如人体细胞表面抗原(例如，CD4、CD8、IL-2受体、EGF受体、PDGF受体)，其它人类生物大分子(如血栓调节蛋白、蛋白C、糖类抗原、唾液酸化的Lewis抗原、L-选择素)，或非人类疾病相关的大分子(如细菌LPS、病毒颗粒衣壳蛋白或包膜糖蛋白)等。
在另一个实施例中，已公开了scFv的诊断和治疗用途的几篇报道(Gruber等,1994前面引用的书；Lilley等,1994前面引用的书；Huston等,Int.Rev.Immunol 1993,10:a 195,Sandhu JS,Crit.Rev.Biotechnol.,1992,12:437)。
可以在不同系统中基因工程改造和表达具有所需特异性的高亲和力抗体。例如，由植物产生的scFv(Firek等(1993)Plant Mol.Biol.23:861)，可容易地在原核系统中生成(Owens RJ和Young RJ,J.Immunol.Meth.,1994,168:149；Johnson S和Bird RE,Methods Enzymol.,1991,203:88)。此外，单链抗体可用于构建完整抗体或及其各种片段的基础(Kettleborough等，Euro J.Immunol,1994,24:952)。可分离出编码可变区的序列(例如，通过PCR扩增或亚克隆)，并将序列剪接成为编码所需人类恒定区的序列，以编码免疫原性优选最小化且更适于人类治疗使用的人类序列抗体。含有所述完全人类编码序列的多核苷酸可表达于宿主细胞(例如，真核细胞中的表达载体)中，并经过纯化用于药物制剂。
DNA表达构建体通常包括与编码序列可操作链接的表达调控DNA序列，包括天然连接的或异源启动子区。优选地，所述表达调控序列为载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统。一旦所述载体被整合至合适的宿主中，则在适于所述核苷酸序列高水平表达的条件下维持所述宿主，并收集和纯化所述经“基因工程改造的”突变抗体。
如前所述，在DNA序列与表达调控序列可操作地连接(即定位，以确保结构基因的转录和翻译)后，所述DNA序列将表达于宿主中。这些表达载体或者作为游离基因，或者作为宿主染色体DNA整体的一部分，其在宿主有机体中通常是可复制的。一般情况下，表达载体包含筛选标记，如四环素或新霉素，以实现对含有目的DNA序列的这些转化细胞进行检测(例如见，美国专利No.4704362，其通过参考并入于此)。
除了真核微生物，如酵母以外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于生产本发明的多肽(见Winnacker，“从基因到克隆(From Genes to Clones)，”VCH出版社，纽约，纽约(1987)，其通过参考并入于此)。优选真核细胞，由于本领域已开发出大量能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，且包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、B细胞或杂交瘤细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达调控序列，如复制起点、启动子、增强子(Queen等，Immunol.Rev.1986,89:49)和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达调控序列为来自免疫球蛋白基因、巨细胞病毒、SV40病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。
通过向载体中插入增强子序列可提高真核DNA转录。增强子为10-30bp的能通过启动子提高转录的顺式作用序列。增强子可有效提高5'或3'转录单元的转录。如果它们位于内含子中或本身位于编码序列内，则它们也是有效的。通常使用病毒增强子，包括SV40增强子、巨细胞病毒增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子。也常使用来自哺乳动物系统的增强子序列，如小鼠免疫球蛋白重链增强子。
通常哺乳动物表达载体系统还包括筛选标记基因(selectable marker gene)。合适的标记的实例包括，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、胸苷激酶基因(TK)或具有抗药性的原核基因。前两个标记基因偏爱使用在不添加胸苷的生长培养基中缺乏生长能力的突变细胞系。然后通过在不添加胸苷的培养基中的生长能力来确定转化的细胞。可用作标记的原核耐药基因的实例包括具有抗G418、霉酚酸和潮霉素的基因。
可采用众所周知的方法将含有所述目的DNA片段的载体转化至宿主细胞中，转化方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、脂质体或电穿孔可适用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括凝聚胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射的使用(一般见，Sambrook等，同上)。
表达后，抗体、各突变的免疫球蛋白链、突变的抗体片段和本发明的其它免疫球蛋白多肽可按照本领域的标准方法进行纯化，包括硫酸铵沉淀、分级柱层析、凝胶电泳等(一般见，Scopes,R.,蛋白质纯化(Protein Purification),Springer-Verlag,N.Y.(1982))。根据需要经部分或同质化纯化后，所述多肽可用于治疗，或用于研发和实施检测方法如免疫荧光染色法等中应用(一般见，免疫学方法(Immunological Methods)，卷I和卷II,Lefkovits和Pernis主编，学术出版社(Academic Press)，纽约(1979和1981))。
本发明的寡肽可用于诊断和治疗。以例举但不用来限制的方式，抗体可用于治疗癌症、自身免疫性疾病或病毒感染。对于癌症的治疗，通常抗体将会结合到癌细胞偏爱表达的抗原，如erbB-2、CEA、CD33以及本领域众所周知的许多其它抗原上，对于自身免疫性疾病的治疗，通常抗体将会结合到由T-细胞表达的抗原，如CD4，IL-2受体、各种T-细胞抗原受体以及本领域众所周知的许多其它抗原上(例如，见基础免疫学(Fundamental Immunology)，第二版，W.E.Paul主编，Raven出版社：纽约，其通过参考并入于此)。对于病毒感染的治疗，通常抗体将会结合到由特定病毒感染的细胞表达的抗原，如单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的各种糖蛋白(如gB、gD、gE)，以及本领域众所周知的许多其它抗原上(例如，见病毒学(Virology)，第二版，B.N.Fields等主编(1990)，Raven出版社：纽约)。
含有本发明抗体的药物组合物可用于肠外给药，即，皮下、肌注或静脉注射。用于肠外给药的组合物通常包括抗体溶液或其溶解于可接受载体，优选液态载体中的混合物(cocktail)。可使用多种含水载体，例如，水、缓冲水、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的且一般不含颗粒物。这些组合物可采用常规的、众所周知的灭菌技术来进行灭菌。所述组合物可含有用以满足近似于生理条件，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等的药用辅料，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的突变抗体浓度可有很大的不同，即，按重量计从低于约0.01％，通常至少约0.1％，至高达5％，且主要基于液体体积、粘度等进行选择，与选定的特定给药模式相一致。
因此，典型的用于肌肉注射的药物组成，可包含1ml无菌缓冲水和约1mg突变抗体。典型的用于静脉滴注的组成可包含无菌林格氏液250ml和突变抗体10mg。制备用于肠外给药的组合物的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或显而易见的，并更详细地描述于，例如，雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Science),第20版,Mack出版公司,Easton,Pa.(2000)，其通过参考并入于此。
候选物的生产和/或演化的候选物
在一个实施方案中，所述真核系统是选择下组的哺乳动物系统：CHO、HEK293、IM9、DS-1、THP-1、Hep G2、COS、NIH 3T3、C33a、A549、A375、SK-MEL-28、DU 145、PC-3、HCT 116、Mia PACA-2、ACHN、Jurkat、MM1、Ovcar 3、HT 1080、Panc-1、U266、769P、BT-474、Caco-2、HCC 1954、MDA-MB-468、LnCAP、NRK-49F和SP2/0细胞系，以及小鼠脾细胞和兔PBMC。
在一个实施方案中，多种哺乳动物宿主细胞可用于生产候选物，包括成纤维细胞(3T3，小鼠；BHK21，叙利亚仓鼠)、上皮细胞(MDCK，狗；Hela，人类；PtK1，鼠袋鼠)、浆细胞((SP2/0和NSO，小鼠)、肾细胞(293，人类；COS，猴)、卵巢细胞(CHO，中国仓鼠)、鼠胚胎细胞(R1和E14.1，小鼠；H1和H9，人类；PER C.6，人类)。
在某些方面，重组抗体由CHO和NSO以及SP2/0细胞系生产。在特定的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S细胞系。最常用的表达载体系统为谷氨酰胺合成酶表达系统和其它基于二氢叶酸还原酶基因的表达系统。
在另一个实施方案中，所述真核系统是酵母细胞系统。在一个方面，所述酵母细胞系选自酿酒酵母或毕赤酵母细胞。
在本发明的方法中，用于筛选演化的分子的宿主与下游生产苗头(hits)使用的宿主为相同的宿主。在本发明的另一个方面，用于发现和演化蛋白的遗传系统与用于生产商业用途蛋白的宿主为完全相同的遗传系统。
生物仿制药
生物仿制药是基于蛋白的治疗药物，其具有与不再受专利保护的经批准处方药相同的氨基酸序列(即化学组成)。一方面，CIAO法与生物仿制药特别相关。为使其具有市场竞争力，以相当的配方和组成来生产治疗性蛋白药物是必要的，生物仿制药应尽量迅速和廉价地生产。细胞培养的培养基和工艺过程开发是制备和生产生物仿制药中最昂贵和费时的部分。
治疗性蛋白内沉默突变密码子的变化改变了用于蛋白翻译的密码子，但保留了蛋白内的氨基酸序列。这些分子内各种位置上，特别是氨基末端的密码子的变化，可显著影响表达，在某些情况下甚至影响到糖基化。在一个方面，CIAO法用于筛选和演化与最终生产中使用的宿主细胞相似的宿主细胞内蛋白的沉默突变密码子。因此，由于较高的蛋白产量以及所述蛋白已选定在宿主细胞系中表达的事实，处理时间可缩短，因此，常规生产中遇到的大多数问题，被排除在所述分子之外。此外，通过筛选出在廉价、不含血清培养基中的分子，可选定含有允许进行廉价生产和纯化的密码子的分子。
没有进一步阐述，应知晓本领域技术人员能够根据前面的描述来最大程度地利用本发明。以下实施例用于例举说明，但不以任何方式限制本发明的其余部分。
实施例
实施例1抗体库的产生和筛选
该实施例描述了利用流式细胞仪分选和ELISA组合，产生和筛选哺乳动物细胞表面展示人类抗体库，从而分离出具有靶抗原结合活性的人类抗体的方法。
通过流式细胞分析筛选库
1、产生稳定整合于如以下附录1.2、1.3和1.4中所述的哺乳动物细胞中的人类抗体库。
2、在进行流式细胞分析前，扩增稳定的完全人类抗体库的克隆。
3、在进行流式细胞分析的当天，用1×PBS洗1×107个细胞。
4、用Detachin细胞分离培养基(Detachin cell detachment medium)分离细胞，并收集细胞于1×PBS中。
5、以3000rmp，离心细胞5分钟。去除上清液。
6、在1ml冷1×PBS中重悬细胞沉淀，3000rmp离心5分钟。
7、去除上清液，将细胞沉淀重悬于500μl的2μg/ml纯化人类蛋白001的冷1×PBS中。
8、冰上孵育1小时，偶尔手动混合。
9、3000rmp，离心细胞5分钟。去除上清液。
10、在1ml冷1×PBS中重悬细胞沉淀，3000rmp，离心5分钟。
11、重复步骤7和8。
12、去除上清液，在500μl含10％山羊血清的1μg/ml兔抗人001多克隆抗体的冷1×PBS中重悬细胞沉淀，
13、冰上孵育30分钟，偶尔手动混合。
14、3000rmp，离心细胞5分钟。去除上清液。
15、在1ml冷1×PBS中重悬细胞沉淀，3000rmp，离心5分钟。
16、重复步骤7和8。
17、去除上清液，在500μl含10％山羊血清的羊抗兔FITC标记的抗体和除虫菊酯(pyrethrin)标记的羊抗人抗体Fc的冷1×PBS中重悬细胞沉淀。
18、冰上孵育30分钟，偶尔手动混合。
19、3000rmp，离心细胞5分钟。去除上清液。
20、在1ml冷1×PBS中重悬细胞沉淀，3000rmp，离心5分钟。
21、重复步骤7和8。
22、去除上清液，在含2％山羊血清的冷1×PBS 1ml中重悬细胞沉淀。
23、用Dako MoFIo进行流式细胞分析。
24。绘制包括PE/FITC荧光比最高的占细胞总数0.1％细胞的分选窗口。在含有100μl生长培养基的96孔板上收集落入该分选窗口的细胞。
重链和轻链可变区序列的恢复
1、从96孔板扩增克隆到6孔板。当6孔板中细胞融合达到80％，用Qiagen DNeasy Tissue试剂盒分离基因组DNA。
2、从细胞中吸出培养基。向6个孔中分别加入1×PBS 500ml，用无菌吸管刮去6孔板中的细胞。将刮下来的PBS中的细胞转移至微量无菌离心管中。
3、3000rmp，离心细胞5分钟。
4、去除上清液，在200μl 1×PBS中重悬细胞沉淀。
5、向样品中加入20μl蛋白酶K和200μl缓冲液AL，振荡以充分混合，56℃孵育10分钟。
6、向样品中加入200μl乙醇，振荡以充分混合。
7、将步骤6的混合物吸取到离心柱中。8000rmp离心1分钟。弃掉渗出液。
8、加入500μl缓冲液AW1，8000rmp离心1分钟。弃掉渗出液。
9、加入500μl缓冲液AW2，14,,000rmp离心2分钟。弃掉渗出液。再次14,,000rmp离心1分钟。确保膜完全干燥。
10、将离心柱放入无菌的微量离心管中，并直接吸取200μl缓冲液AE到膜上。
11、室温孵育1分钟，8000rmp离心1分钟，以洗脱基因组DNA。
12、通过在1.5ml微量离心管中设置以下反应，对基因组DNA进行质量控制(QC)：
加样至含有0.5μg/ml溴化乙锭的0.8％琼脂糖TAE凝胶中。以1kB DNA梯度为标准。在1×TAE缓冲液中，100V电压，跑胶20-30分钟。
13、在无菌PCR管中设置以下PCR反应：
*见附录1.2
14、将PCR管置于加热循环器，并开始循环程序。
初始激活步骤：15分钟，95℃
3-步循环
变性：40秒，94℃
退火：40秒，55℃
延伸：2分钟，72℃
循环次数：30个
最后延伸步骤：10分钟，72℃
15、通过在1.5ml微量离心管中设置以下反应对PCR反应进行质量控制：
加样至含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖TAE凝胶中。以1kB DNA梯度为标准。在1×TAE缓冲液中，100V电压，跑胶20-30分钟。
16、使用Invitrogen TOPO 2.1试剂盒，在1.5ml微量离心管中设置以下克隆反应：
17、轻轻混合反应物，室温孵育5分钟。
18、将2μl步骤17的TOPO克隆反应物加入到一小瓶One Shot化学感受态大肠杆菌中(One Shot Chemically competent E.coli)，轻轻混匀。
19、冰上孵育30分钟。
20、42℃热休克细胞30秒。
21、将管转移到冰上，孵育2分钟。
22、加入250μl室温的S.O.C.培养基。
23、37℃、200rmp，水平地摇管1小时。
24、在复温的(re-warmed)LB-羟苄青霉素平板上涂布(spread)10μl转化子。
25、37℃孵育平板，过夜。
26、从各转化子中挑取6个克隆进行测序。
27、分析重链和轻链可变区序列。采用ELISA法进入第二轮筛选。
用限制性酶消化载体和人类抗体克隆
反应将取决于选定的限制性酶，根据制造商的建议，这里提供的实例是：将微量离心管置于冰上进行以下消化反应：
1、轻轻混匀，短暂离心(5秒)。
2、37℃过夜孵育所述反应物。
CIP消化载体并用QIA PCR快速纯化试剂盒纯化
3、向含有载体消化反应物的微量离心管中加入Apex磷酸酶2μl。
4、37℃孵育10分钟。
5、70℃加热5分钟，灭活Apex磷酸酶。
6、向微量离心管中加入缓冲液PBI 500μl。
7、涡旋混合并快速离心。
8、一次向柱中加样750μl。
9、12000×g离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
10、重复，直到所有样品经过处理。
11、用750μl PE缓冲液洗涤(添加乙醇！)
12、12000×g离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
13、将柱放回到收集管中，再次离心。
14、将柱置于新的离心管中，并用50μl EB缓冲液洗脱。
凝胶纯化经限制性酶消化的人类抗体克隆
1、在1.5ml微量离心管中设置以下反应：
2、加样至含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖TAE凝胶中。以1kB DNA梯度为标准。在1×TAE缓冲液中，100V电压，跑胶20-30分钟。
3、切下重链(HC)和轻链(LC)可变区对应的条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
4、向1体积凝胶中加入3体积的缓冲液QG。
5、50℃孵育10分钟，直到凝胶碎片完全溶解。向样品中加入1凝胶体积的异丙醇并混合。
6、将QIAquick离心柱至于2ml收集管中。
7、将样品加入QIAquick柱中，离心1分钟。
8、弃掉渗出液，并将QIAquick柱放回相同的收集管中。
9、向QIAquick柱中加入缓冲液PE 0.75ml，离心1分钟。
10、弃掉渗出液，以17900×g(13,000rpm)再离心QIAquick柱1分钟。
11、将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
12、向QIAquick膜的中心加入缓冲的EB 52μl，离心该柱1分钟。静置该柱1分钟，然后离心1分钟。
将人类HC和LC可变区连接到经消化的载体DNA中
将微量离心管置于冰上，进行以下连接反应：
1、轻轻混匀，用微量离心机短暂离心(5秒)。
2、室温孵育2小时或16℃过夜。
3、将各连接反应混合物转化至超级感受态大肠杆菌细胞中。
4、在冰上预冷14ml BD Falcon聚丙烯圆底试管。制备42℃的SOC培养基。
5、在冰上解冻超级感受态细胞。解冻时，轻轻混匀并向每只预冷的试管中分装细胞100μl。
6、向各等份的细胞中加入β-巯基乙醇1.7μl。细胞在冰上孵育10分钟，每2分钟轻轻旋转。
7、向一等份的细胞中加入2μl的连接反应混合物。轻弹管。
8、冰上孵育管30分钟。
9、42℃水浴中热脉冲管45秒。
10、冰上孵育管2分钟。
11、加入预热的SOC培养基900μl，37℃、225-250rmp，孵育管1小时。
12、将20μl和200μl的转化混合物平铺于含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。
13、37℃过夜孵育平板。
14、计数平板上的菌落，挑取6个菌落进行PCR筛选和测序。
15、筛选含有正确序列的克隆，制备质粒DNA，后续转染293F细胞。
293F细胞的转染
1、转染前一周，将293F细胞转移至添加了达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(D-MEM)的血清中培养成为单层细胞培养物。
2、转染前一天，将100μl添加了D-MEM的血清中含有的0.1×105个细胞，以96孔板的形式涂布每个转染样品。
3、对于每个转染样品，制备DNA-脂质体复合物(DNA-Lipofectamine complexes)。
4、在50μl Opti-MEM低血清培养基(Reduced Serum Medium)中稀释0.2μg DNA。轻轻混匀。
5、在50μl Opti-MEM低血清培养基中稀释0.125μl脂质体。轻轻混匀，室温孵育5分钟。
6、将稀释的DNA与稀释的脂质体进行合并。轻轻混匀，室温孵育20分钟。
7、向含有细胞和培养基的各孔中加入DNA-脂质体复合物100μl。通过来回晃动平板轻轻混匀。
8、37℃、5％CO2培养箱中孵育细胞。
9、6小时后，向每孔中加入添加了D-MEM的血清100μl。37℃、5％CO2培养箱中过夜孵育细胞。
10、吸出各孔中的培养基。用含有4mM L-谷氨酰胺的293SFM II 100μl洗涤各孔。向各孔中加入含有4mM L-谷氨酰胺的293SFM II 100μl。
11、转染后96小时，收集上清液用于ELISA。
附录1.1：缓冲液配方
含有2％山羊血清的1×PBS
·山羊血清2ml
·1×PBS 98ml
50×TAE缓冲液
·Tris碱242g
·冰醋酸57.1ml
·Na2EDTA-2H2O 37.2g
·添加蒸馏水至终体积1升
1×TAE缓冲液
·50×TAE缓冲液20ml
·蒸馏水800ml
含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶
·LE琼脂糖0.8g
·1×TAE缓冲液100ml
·在微波炉中熔化琼脂糖，晃动以确保混合均匀
·冷却琼脂糖至55℃
·向琼脂糖中加入20mg/ml溴化乙锭2.5μl
·向凝胶板上倒胶
含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶
·LE琼脂糖1g
·1×TAE缓冲液100ml
·在微波炉中熔化琼脂糖，晃动以确保混合均匀
·冷却琼脂糖至55℃
·向琼脂糖中加入20mg/ml溴化乙锭2.5μl
·向凝胶板上倒胶
LB
·NaCl 10g
·蛋白胨10g
·酵母提取物5g
·添加蒸馏水至终体积1升
·用5N NaOH调节pH值至7.0
·高压灭菌器
LB-羧苄青霉素琼脂
·NaCl 10g
·蛋白胨10g
·酵母提取物5g
·琼脂20g
·添加蒸馏水至终体积1升
·用5N NaOH调节pH值至7.0
·高压灭菌
·冷却至55℃
·加入10mg/ml过滤除菌的羧苄青霉素10ml
·倒入培养皿(25ml/100-mm平板)
SOC培养基
·NaCl 0.5g
·蛋白胨20g
·酵母提取物0.5g
·过滤除菌的20％葡萄糖2ml
·添加蒸馏水至终体积1升
·高压灭菌
·使用前加入过滤除菌的1M MgCl2 10ml和过滤除菌的1M MgSO410ml
洗液
·0.05％吐温-20的PBS溶液
封闭液
·2％Carnation脱脂牛奶的PBS溶液
热灭活的胎牛血清
·原始供应瓶中装有热灭活的胎牛血清500ml
·56℃加热30分钟，每5分钟晃动混合
·分装50ml并储存于-20℃
添加了达尔伯克氏改良伊格尔培养基的血清
·达尔伯克氏改良伊格尔培养基500ml
·热灭活的胎牛血清50ml
·10mM MEM非必需氨基酸5ml
含有4mM L-谷氨酰胺的293SFM II
·SFM II 500ml
·200mM L-谷氨酰胺10ml
DEAE-葡聚糖溶液
·DEAE-葡聚糖1g(二乙氨乙基葡聚糖)
·溶解于100ml蒸馏水中
·过滤除菌
附录1.2：完全的人类抗体库的构建
可从数据库V(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)中获得所有人类功能性生殖细胞系重链(VH)和κ轻链(Vκ)的V区，并进行比对。然后可通过比对分析多样性，特别是框架三个区的多样性。然后从得到的序列群体中筛选出用于构建库的所需数量的VH和Vκ基因
V区克隆
用基因特异性引物，从人类基因组DNA分两段扩增重链和轻链V区基因(包括框架1、2和3以及CDRl、CDR2和CDR3)。然后通过重叠PCR结合部分V区基因。在克隆到哺乳动物表达载体之前，通过巢式PCR将接头添加到全长LC的V区。克隆的LC可变区是确定的序列(产生LC V克隆)。重链可变区是TOPO克隆的和确定的序列(HC V TOPO克隆)。从相应的质粒中扩增确定序列的HC V区，接头添加到3'端，将产生的PCR产物克隆到的LC V可变区克隆中，从而形成Vκ/VH组合，并克隆到哺乳动物载体中。
全长IgG的表达
全长κ轻链和IgG1重链在目的哺乳动物载体中的表达，可由单一启动子驱动，例如，CMV启动子。每条链前端带有可将新生多肽链定向到内质网(ER)上的分泌信号肽。锚定信号可以融合到重链C-末端。分泌后该信号肽被切除，取而代之的是结合于全长IgG上的锚定物，其使全长IgG连接到细胞膜外。
附录1.3：通过转染在哺乳动物细胞中产生的稳定的完全人类抗体库
1、转染前一周，将CHO-S细胞转移至添加了达尔伯克氏改良伊格尔培养基(D-MEM)的血清中培养成为单层细胞培养物。
2、转染前一天，将15ml添加了D-MEM的血清中含有的6×106个细胞涂布于10-cm组织培养平板上，每个转染样品都进行涂布。制备10-cm平板。
3、对于每块10-cm平板，按照步骤4-7制备DNA-脂质体复合物。
4、在1.5ml Opti-MEM低血清培养基中稀释25μg大量制备的(maxi-prep)完全人类抗体库质粒DNA。轻轻混匀。
5、在1.5ml Opti-MEM低血清培养基中稀释60μL脂质体。轻轻混匀，室温孵育5分钟。
6、将稀释的DNA与稀释的脂质体合并。轻轻混匀，室温孵育20分钟。
7、向含有细胞和培养基的每个平板中加入DNA-脂质体复合物3ml。通过来回晃动平板轻轻混匀。
8、37℃、5％CO2培养箱中孵育细胞。
9、用15ml添加了D-MEM的血清更换每个平板中的培养基。37℃、5％CO2培养箱中孵育细胞48小时。
10、用Detachin细胞分离培养基(Detachin cell detachment medium)分离细胞，并在添加了D-MEM的血清中重悬细胞。
11、将10ml含有800μg/ml G418的添加了D-MEM的血清中所含有的0.4×106个细胞涂布于一块10-cm组织培养平板上。转移所有转染细胞，得到150×10-cm平板。
12、将10ml含有800μg/ml G418的添加了D-MEM的血清中所含有的0.4×106个未转染的CHO-S细胞涂布于一块儿10-cm组织培养平板上。
13、每4天用含有800μg/ml G418的添加了D-MEM的血清更换细胞培养液。
14、14天后，检查未转染的CHO-S细胞平板。平板上应该没有活细胞。
15、用Detachin细胞分离培养基分离余下的转染细胞，并以1×107个细胞/ml在冷冻培养基中冷冻细胞。
附录1.4：通过逆转录病毒感染在哺乳动物细胞中产生稳定的完全人类抗体库
1、转染前一天，将15ml添加了D-MEM的血清中含有的6×106个EcoPack-2 293细胞涂布于10-cm组织培养平板上，每个转染样品都进行涂布。制备10-cm平板。
2、制备含MBS的培养基。转染前才进行制备。对于每块10-cm组织培养平板而言，需制备12ml含MBS的培养基。
3、向每块10-cm平板中添加含MBS的培养基12ml，并把平板放在托盘中置于37℃培养箱中。需在加入DNA悬液之前20-30分钟进行该操作。
4、在450μl无菌水中重悬10μg大量制备的完全人类抗体库质粒DNA沉淀，并将DNA转移至单独的5-ml BDFalcon聚苯乙烯圆底试管中。
5、向DNA中加入来自Stratagene Transfection MBS哺乳动物转染试剂盒的溶液I 50μl和溶液II 500μl。
6、通过用设置在500μl的移液器上下吹打悬液，轻轻重悬DNA悬液中的所有沉淀。
7、室温孵育该DNA悬液10分钟。
8、从培养箱中取出待转染的10-cm平板，并以滴加的方式将DNA悬液添加到平板上，轻轻晃动以防止细胞从平板中浮起并使DNA悬液分布均匀。
9、将组织培养平板放回37℃培养箱中。
10、培养3小时后，去掉平板中的培养基，并用4ml含25μM氯喹的添加了D-MEM的血清代替。将平板放回37℃培养箱中。
11、再培养6-7小时后，去掉含25μM氯喹的生长培养基，并用4ml不含氯喹的添加了D-MEM的血清代替。
12、37℃培养箱中过夜培养平板。
13、去掉平板中的培养基，并用3.0ml添加了D-MEM的新鲜血清代替。将平板放回37℃培养箱中。
14、从培养箱中取出产病毒的包装细胞。
15、从第一块平板上收集含病毒的上清液，通过0.45μm过滤器过滤至50-ml无菌锥形管中。
16、将病毒上清分装到1.5ml冷冻管中，并在干冰/乙醇浴中进行快速冷冻。将病毒上清储存于-80℃。
17、将10ml添加了D-MEM的血清中含有的0.5×106个NIH-3T3细胞涂布于10-cm组织培养平板上，涂布102×10-cm的组织培养平板。
18、通过在37℃水浴中快速搅拌，快速解冻上清液。
19、在含有DEAE-葡聚糖溶液并添加了DMEM的胎牛血清中以0.3×105个病毒颗粒/ml的滴度稀释病毒，每块100-mm平板制备3ml稀释病毒以用于感染(20％细胞将被感染)。制得生长培养基加DEAE-葡聚糖的“模拟混合物(mock cocktail)”以用作阴性对照。
20、吸掉NIH-3T3细胞的培养基。对于每块儿平板，将3.0ml稀释病毒均匀地散布在细胞上。将平板置于37℃培养箱中3小时。
21、培养3小时后，向每块平板中再加入7.0ml添加了D-MEM的胎牛血清，并将平板放回37℃培养箱中。培养平板48小时。
22、用10ml含800μg/ml G418并添加了D-MEM的胎牛血清替换每块10-cm组织培养平板中的培养基。
23、每4天用含有800μg/ml G418的添加了D-MEM的胎牛血清更换细胞培养液。
24、14天后，检查模拟感染的NIH-3T3细胞的平板。平板上应该没有活细胞。
25、用Detachin细胞分离培养基分离余下的转染细胞，并以1×107个细胞/ml在冷冻培养基中冷冻细胞。
实施例2综合定位演化(CPE)突变反应中的反应
为每个待插入的密码子设计一对引物(引物组合1和引物组合2)。设计将取决于基因序列，序列分析数据库如Sequencher(Gene Codes Corporation，基因编码公司)或(Life Technologies，生命技术公司)可用来设计引物。对于CPE，为每个待突变的密码子设计一对引物。简并目标密码子(NNK或NNN)位于中间，两侧各20个碱基(引物总长度：43个碱基，9f克隆，用于测序以确定特定突变)。模板DNA为带有靶基因的载体DNA。
将96-孔薄壁PCR板或0.2ml薄壁PCR管置于冰上进行以下反应：
1、每块96-孔板设置一个阴性对照反应(用TE缓冲代替引物)
2、轻轻混匀，在台式离心机(table top centrifuge)中短暂离心(5秒)
3、采用下述循环参数进行循环反应：
质量控制(QC)分析
1、为了QC扩增反应，在96-孔薄壁PCR板或0.2ml薄壁PCR管中设置以下反应：
2、加样10μl至含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖TAE凝胶中。以1kb加DNA梯度为标准。在1×TAE缓冲液中，100V电压，跑胶20-30分钟。
用适合于克隆到载体DNA中的限制性酶消化诱变反应物--DpnI限制性酶的实例
1、将0.5μlDpnl限制性酶(10U/μl)直接添加到各反应中。
2、轻轻混匀，在台式离心机中短暂离心(5秒)
3、在37℃的PCR仪中孵育2小时。
4、用来自每个96-孔板的6个反应混合物转化XLI蓝色超级感受态细胞(XLI Blue Supercompetent cell)。
5、在冰上预冷0.2ml PCR管。将SOC培养基加热至42℃。
6、在冰上解冻XLI蓝色超级感受态细胞。解冻时，轻轻混匀，每个预冷管中分装50μl细胞。
7、向每等份细胞中添加β-巯基乙醇0.8μl。冰上孵育细胞10分钟，每2分钟轻轻晃动。
8、向每等份细胞中添加反应混合物2μl。轻轻弹管。
9、在冰块(cold block)上孵育管30分钟。
10、在42℃水浴中热激管45秒。
11、冰上孵育管2分钟
12、加入预热的SOC培养基100μl，37℃、225-250rpm振荡培养管1小时。
13、将整个转化混合物平铺在含有羧苄青霉素的LB琼脂板上。
14、37℃过夜培养平板。
15、计数平板上的菌落，并从每个转化反应物中挑取12个菌落，用于小量制备和测序。
大规模转化
1、在冰上解冻XLI蓝色超级感受态细胞。解冻20管的感受态细胞用于96个反应。解冻时，向每管250μl感受态细胞中加入β-巯基乙醇4μl。冰上孵育细胞10分钟，每2分钟轻轻晃动。
2、在冰上预冷0.2ml PCR管。将SOC培养基加热至42℃。
3、向每个预冷管中分装50μl细胞。
4、向每等份细胞中添加2μl反应混合物，轻轻弹管轻。
5、在冰块(cold block)上孵育管30分钟。
6、在42℃水浴中热激管45秒。
7、冰上孵育管2分钟
8、加入预热的SOC培养基100μl，37℃、225-250rpm振荡培养管1小时。
9、将整个转化混合物平铺在含有羧苄青霉素的LB琼脂板上。
10、37℃过夜培养平板。
11、细胞成长于96孔板(well block)中，用于小量制备。
12、使用QIAVac 96试剂盒，参照制造商的建议，小量制备DNA。
实施例3筛选出抗体亲和力提高的转染
转染前一周，将293F细胞转移至添加了达尔伯克氏改良伊格尔培养基(D-MEM)的血清中培养成为单层细胞培养物。转染前一天，将100μl添加了D-MEM的血清中含有的0.2×105及0.4×105个细胞，以96孔板的形式涂布每个转染样品。
1、对于每个转染样品，制备DNA-脂质体复合物。
2、在50μl Opti-MEM低血清培养基中稀释0.2μg DNA。轻轻混匀。
3、在50μl Opti-MEM低血清培养基中稀释0.125μl脂质体。轻轻混匀，室温孵育5分钟。
4。、将稀释的DNA与稀释的脂质体进行合并。轻轻混匀，室温孵育20分钟。
5、向含有细胞和培养基的各孔中加入DNA-脂质体复合物100μl。通过来回晃动平板轻轻混匀。
6、37℃、5％CO2培养箱中孵育细胞。
7、6小时后，向每孔中加入100μl添加了D-MEM的血清。37℃、5％CO2培养箱中过夜孵育细胞。
8、吸出各孔中的培养基。用含有4mM L-谷氨酰胺的293SFM II 100μl洗涤各孔。向各孔中加入含有4mM L-谷氨酰胺的293SFM II 100μl。
9、转染后96小时，收集上清液用于ELISA。
功能性ELISA
1、用100μl含有2μg/ml抗原的包被液包被Nunc-Immuno Maxisorp 96孔板。
2、用封板膜封板，4℃过夜孵育。
3、倒掉板中的液体并放掉(tap out)残液。
4、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
5、倒掉板中的液体并放掉残液。
6、加入封闭液200μl。200rpm室温振荡1小时。
7、倒掉板中的液体并放掉残液。
8、向96孔板中加入几份含有对照抗体(2μg/ml)的封闭液100μl/孔。
9、向96孔板中加入几份转染(SOP 5A)的上清液100μl。
10、200rpm室温振荡1小时。
11、倒掉板中的液体并放掉残液。
12、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
13、重复步骤11-12共3次。
14、向每孔中加入含标记有HRP的1:5000稀释的亲和纯化的(affinity purified)羊抗人抗体的封闭液100μl。
15、200rpm室温振荡1小时。
16、倒掉板中的液体并放掉残液。
17、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
18、重复步骤17-18共3次。
19、向每孔中加入Sigma TMB底物100μl。室温下孵育，每2-5分钟检查。
20、加入1N HCl 100μl终止反应。
21、450nm处读数。
ELISA定量
1、用100μl含有10μg/ml亲和纯化的Fc-特异性羊抗人IgG的包被液包被Nunc-Immuno Maxisorp 96孔板。
2、用封板膜封板，4℃过夜孵育。
3、倒掉板中的液体并放掉(tap out)残液。
4、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
5、倒掉板中的液体并放掉残液。
6、加入封闭液200μl。200rpm室温振荡1小时。
7、倒掉板中的液体并放掉残液。
8、向96孔板中加入几份含有标准浓度的纯化人血清IgG的封闭液100μl/孔。
9、向96孔板中加入几份转染(SOP 5A)的上清液100μl。
10、200rpm室温振荡1小时。
11、倒掉板中的液体并放掉残液。
12、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
13、重复步骤11-12共3次。
14、向每孔中加入含标记有HRP的1:5000稀释的亲和纯化的羊抗人抗体的封闭液100μl。
15、200rpm室温振荡1小时。
16、倒掉板中的液体并放掉残液。
17、加入洗液200μl。200rpm室温振荡5分钟。
18、重复步骤17-18共3次。
19、向每孔中加入Sigma TMB底物100μl。室温下孵育，每2-5分钟检查。
20、加入1N HCl 100μl终止反应。
21、450nm处读数。
实施例4用于最佳抗体表达的Fc密码子突变库的产生和筛选
本实施例提供用于产生Fc密码子突变库的方法，以及提供用于获得含有优化的，从而与Fc多肽的亲本形式相比，在生产宿主细胞中表达提高的Fc突变的筛选方法。
A.Fc密码子突变库的设计和构建
针对目标区的每个密码子(本例中为人类IgG1分子的Fc部分)设计包含目标密码子和每侧20个碱基的一对简并引物(正向和反向)。目标密码子的第三个位置上(摆动位置)包含了通过使用相同的密码子(实施例A)能够在目标位置上产生所有沉默突变的混合碱基(表3)。如果相应的氨基酸可由另一种密码子(实施例B)编码，则针对相同的密码子位置设计第二组简并引物。相应的正向和反向简并引物按1:1混合，退火结合到模板上，使用耐高温的DNA聚合酶通过链的位移进行延伸而得到全长产物。用DpnI消化模板，将全长延伸产物转化至大肠杆菌中。针对每个诱变反应进行高达12个菌落的测序。将确定序列的突变排列在96孔板中并保存于甘油中。甘油贮存物用于转染哺乳动物细胞的质粒DNA的小量制备和筛选。
表3：合成寡核苷酸中简并碱基的编码
实施例A：目标密码子＝CCC(脯氨酸)
→正向引物：CCD，反向引物：HGG
实施例B：目标密码子TCG(丝氨酸)
→正向引物1：TCH，反向引物1：DGA
→正向引物2：AGY，反向引物2：RCT
目标密码子侧翼的20个碱基未显示。引物总长度：43个碱基。
B.Fc密码子突变库的表达及基于ELISA的筛选
将来自Fc密码子突变库的克隆转染至哺乳动物细胞系中。产生全长IgG并分泌到培养基中。使用ELISA检测法，筛选表达的Fc密码子突变的上清液，以获得IgG表达水平高于亲本克隆的突变。通过β-半乳糖苷酶检测对ELISA数据进行归一化(normalize)处理，测定转染效率。对初筛中确定的排名靠前的苗头(hits)重新转染和重新筛选三次，从而确定增加的表达水平。
