筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指一种筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片及其制备方法和应用。
背景技术
医学研究表明：衰老是一种疾病，通过不同途径对整个生命系统产生退行性变化过程。这一过程一旦开始，就会使人体心血管系统，内分泌系统、免疫系统等的功能逐渐减退，诱发各种疾病，最终导致生命的衰亡。目前心脑血管、糖尿病、癌症等疾病发病的低龄化恰恰是人类早衰的表现。抗衰老医学已经成长为单独的一门学科，其研究和治疗的目的，就是要通过多种方法遏制衰老的进程，预防、阻止老化疾病的发生或延缓其发生的时间，从而提高生活质量与健康水平。从现代医学的观点来看，遏制衰老进程应该从青壮年时期开始，养成良好的生活习惯，健康饮食，保持运动，心理健康，延缓衰老，保证生命的质量。
细胞衰老是Hayflick及同事在1961年提出的一个概念。他们发现体外培养的正常人成纤维细胞增殖能力是有限的，在经过一定次数的有丝分裂后，细胞增殖能力逐渐下降，最终细胞不可逆地停止增殖，他们将这种现象称为细胞衰老。后来许多实验证明，无论是体内生长还是体外培养的正常动物细胞，其分裂次数都是有限的。停止分裂的衰老细胞仍会存活几周，但是即使提供足够的生长空间，丰富的营养和充足的生长因子，也不会再分裂繁殖。除了停止分裂之外，衰老细胞还有其他的特点，如抗凋亡、基因表达改变等。正常情况下，细胞衰老是机体内发生的自然现象，它对机体有重要的生理意义。一方面具有肿瘤抑制作用，另一方面又会促进机体和组织老化。
当细胞发生衰老时，细胞会不可逆的停止增殖(生长停滞)，生长停滞的细胞可以抵抗细胞死亡信号(抗凋亡)，并且基因表达会有很大改变(改变基因表达)，以上这三大特点是衰老细胞的主要表型特征。
衰老细胞的基因表达会发生显著的改变，其中包括细胞周期抑制因子或活化因子的基因表达。此外，衰老细胞还可以过表达很多分泌蛋白基因，从而改变邻近组织的微环境，这些分泌蛋白称为衰老相关的分泌型。例如，衰老的成纤维细胞会过表达改变细胞外基质或介导局部炎症的蛋白。随着年龄增大衰老细胞会在体内积聚，其分泌的炎症因子可能与组织结构和功能随年龄增大而减退有关。很多因素可以导致细胞衰老，如端粒缩短、DNA损伤、癌基因激活、氧化应激等。细胞衰老在体内具有重要的生理作用，一方面细胞衰老是体内重要的肿瘤抑制机制，另一方面，细胞衰老影响着机体和组织的老化。细胞衰老促进组织老化表型的出现，并影响衰老相关疾病的发生发展。随着机体年龄的增大，体内衰老细胞会越来越多，衰老细胞在体内的积聚会促进组织的老化，影响组织的功能。神经、造血和胰腺功能递减是机体老化的三大指标，最近的研究发现这三者功能下降与p16-pRB途径引发的细胞衰老有关。随着年龄增长，p16在小鼠的大脑、骨髓和胰腺的干细胞和祖细胞中的表达增加，并且抑制了这三个组织的干细胞增殖和组织再生；沉默小鼠的p16基因，发现干细胞增殖和组织更新能力随着年龄增高而下降的情况得到缓解。细胞衰老对皮肤老化也有重要影响。在老年狒狒的真皮层中，p16蛋白的表达会随着年龄的增大而积聚，同时HIRA和衰老的异染色体有关的其他特征也会随着年龄的增大而积聚。细胞衰老会破坏胶原平衡，减少表皮层干细胞数量，损伤表皮层干细胞功能，从而影响皮肤破坏胶原平衡，破坏皮肤结构完整性使出现老化表型。细胞衰老也会影响很多退行性疾病，如骨质疏松、阿尔兹海默心脏等。增殖抑制作用可能是衰老细胞促进组织老化的原因。通过增殖抑制作用，细胞衰老可以影响干细胞的增殖分化，损伤组织再生和修复功能，进而促进组织老化。另一个可能的原因是衰老细胞会增加细胞外基质降解酶、炎性因子和生长因子表达和释放。这些细胞因子可以影响组织中邻近细胞甚至是末梢细胞的生理生化活动，干扰正常组织的结构和功能。此外，衰老细胞分泌的细胞因子可以刺激邻近的前癌细胞的恶性转化和血管生成活性。所以，衰老细胞虽然它们本身不会形成肿瘤，但可以促进邻近前癌形成肿瘤，因此衰老还可能促进老化机体中癌症的发生展。
尽管目前有关衰老研究的报道越来越多，也在基础研究中确立了衰老与心脑血管、糖尿病、癌症等疾病发生发展过程中发挥重要作用。然而关于衰老芯片的报道甚少，其次大部分研究只选取年轻组和老年组做对比，或者选用各种应激模型模拟细胞衰老，忽略了衰老的动态变化过程，无法深入研究衰老的机制。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片及其制备方法和应用。本发明利用筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片成功筛选得到与肝脏衰老密切相关17个mRNA，为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。同时利用该基因芯片制备试剂盒，鉴别年轻肝脏组织和衰老肝脏组织。
为实现上述目的，本发明提供的一种筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片，包括基片和固定在基片表面的靶核苷酸的探针，所述探针序列如下表所示：
进一步地，所述基片为自载破片、硅片、膜或高分子材料。
本发明还提供了一种筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)对不同年龄段大鼠肝脏衰老相关的基因分别进行对比分析，设计肝脏衰老的靶基因的用特异性引物，扩增得到靶基因的序列，针对靶基因的序列设计检测探针，
2)将探针5’端以氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔相连，制得氨基修饰与加臂探针；
3)将修饰与加臂探针稀释成探针溶液，再将探针溶液按顺序点样于基片表面，固定得到基因芯片。
本发明还提供了一种利用上述基因芯片筛查与肝脏衰老相关mRNA的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的RNA；
2)对步骤1)提取得到的RNA进行逆转录，然后进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将扩增产物与杂交液混合均匀后涂布于上述筛查与肝脏衰老相关mRNA的的基因芯片，杂交得到杂交芯片；
4)杂交芯片显色读取，获取杂交信号并分析检测结果，筛查与肝脏衰老相关mRNA。
作为优选方案，所述检测结果为：检查得到与肝脏衰老相关mRNA有17条，分别为：
本发明还提供了一种上述方法筛选得到肝脏衰老相关mRNA作为生物标志物在制备用于诊断或防治与老年相关的肝脏疾病的药品中应用。
本发明还提供了一种鉴别年轻肝脏组织和衰老肝脏组织的试剂盒，所述试剂盒含有筛查与肝脏衰老相关mRNA的芯片。
作为优选方案，所述试剂盒还包括预杂交液、杂交反应液、洗液和显色液。
本发明的有益效果在于：
1)首次揭示和证明了17个mRNA与衰老肝脏密切相关，找到了可作为衰老肝脏临床诊断的重要生物标志物，为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。
2)首次揭示如基因IGF1表达其同衰老肝脏的相关性，为判断移植的生理年龄防治提供了有效途径。
3)本发明人分析了从年轻到年老不同肝脏的mRNA核糖核酸的水平，并采用RT-PCR和western blot针对不同年龄阶段的移植肝脏加以验证，因此结果准确可靠。
综上所述，本课题组自3月龄老鼠开始收集样本，每隔3个月收集一次，直到24月龄，动态的模拟的正常的衰老进程。于此同时，我们选取6月龄大鼠作为受者，12月，18月，24月龄大鼠分别作为供者。不同于其他研究的血浆置换，我们的不同年龄段大鼠肝脏互换移植，更符合临床的实际情况，为研究内环境诱导衰老肝脏年轻化的研究提供了很好的基础。
附图说明
图1为Agilent表达谱芯片的微阵列分析图；
图2为组织收集和基因分析的流程图；
图3为组间同质性检验图；
图4为69个基因的表达与肝脏年龄具有一致的相关性图；
图5为肝组织中17个基因的差异表达图；
图6为针对17个基因RT-PCR定量统计结果图；
图中，图6A为IGF1 mRNA定量结果图，图6B为Igf2bp2 mRNA定量结果图，图6C为ITIN1 mRNA定量结果图，图6D为IL18 mRNA定量结果图，图6E为IL3ra mRNA定量结果图，图6F为Rup2 mRNA定量结果图，图6G为RGD1562814 mRNA定量结果图，图6H为MBL2 mRNA定量结果图，图6I为CBX6 mRNA定量结果图，图6J为Adamts3 mRNA定量结果图；
图7为肝脏组织western blot结果图；
图8为不同移植肝脏组织western blot结果图；
图9为17个候选基因发关联互作图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
下述实施例使用仪器和试剂如下：
a.主要仪器
b.主要试剂
实施例1
基因芯片制备方法，包括以下步骤：
1)对不同年龄大鼠肝脏衰老相关的基因分别进行对比分析，设计肝脏衰老的靶基因的用特异性引物如下表所示，扩增得到靶基因的序列，针对靶基因的序列设计检测探针，
2)将探针5’端以氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔相连，制得氨基修饰与加臂探针；
3)将修饰与加臂探针稀释成探针溶液，再将探针溶液按顺序点样于基片表面，固定得到基因芯片。
实施例2利用上述基因芯片筛选与肝脏衰老相关mRNA
1、材料与方法
2、大鼠肝脏样本的收集：
以3m、6m、12m、18m、24m正常的健康Lewis大鼠为正常对照组。以6m雄性同系大鼠作为受体，行原位全肝移植，建立不同月龄供体的肝移植模型。术后3月，观察存活率、检测肝功能、收集肝脏组织做病理检测及芯片检测。
3、单标芯片实验操作流程
3.1总RNA的纯化
Trizol抽提的RNA，因纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果，需使用QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。
1)取总RNA 100μg溶解于100μl RNase free水中，加入350μl Buffer RLT并充分混匀。
2)加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。
3)将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。
4)吸取350μl Buffer RW1到RNeasy mini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。
5)将10μl的DNaseⅠ加入到70μl的Buffer RDD，混匀。
6)将80μl的mix加入到柱子内，室温放置15min。
7)吸取350μl Buffer RW1到RNeasy mini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。
8)吸取500μl Buffer RPE到RNeasy mini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。
9)重复步骤8一次。
10)换新的套管，13200rpm，2min。并将柱子转入到洗脱管中。
11)将RNeasy mini柱子转入收集管中。
12)吸取30μl RNase free水，静置1min，13200rpm离心1min。
13)重新将洗脱管中的30μl样品转回柱子，静置1min，13200rpm离心1min。
14)Nano Drop测得RNA浓度和260/280。
3.2荧光标记
3.21准备单标的spike in。
按照不同的RNA起始量，用Dilution Buffer稀释spike-in。
3.22反转录
a.配置如下反应溶液：
b.PCR仪器上65℃保温10min，冰浴5min。
c.同时将5X first strand buffer在80℃预热3min，室温备用。
d.配置反转录mix
e.将上述4.7μlmix加入变性后的冰浴的RNA中，混匀，离心。
f.PCR：40℃反应2小时；70℃灭活15分钟；4℃反应5分钟。
3.3荧光标记
a.配置标记mix
b.加入上述6.0μlmix，混匀，离心。
c.PCR：40℃反应2小时；4℃反应5分钟。
3.4标记产物纯化
1)加84μl的Nuclease-free water，总体积至100μl。
2)加350μl的RLT，混匀。
3)加250μl的无水乙醇，混匀，不要离心。
4)将700μl的mix，转到柱子上。13000rpm，4℃离心30sec。丢弃流过液。
5)加500μl的RPE，13000rpm，4℃离心30sec。丢弃流过液。
6)另加500μl的RPE，13000rpm，4℃离心60sec。丢弃流过液。
7)换新的套管，13000rpm，4℃空转30sec。并将柱子转入到洗脱管中。
8)加30μl的Nuclease-free water，静置1min，13000rpm，4℃离心30sec。
9)重新将洗脱管中的30μl样品转回柱子，静置1min，13000rpm，4℃离心30sec。
10)用NanoDrop测得RNA浓度，Cy3浓度，260/280。
11)探针量的要求：
4、芯片杂交
1)按以下表格配片段化mix
2)60℃保温30min。
3)冰浴1min，短暂离心。
4)加等体积的2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM，混匀。
5)13000rpm，离心1min。6)置于冰上。
7)将杂交仓放在水平桌面上，放上带垫圈盖玻片。8)按以下体积加入样品。
9)将芯片上带有“Agilent”面朝下，盖到盖玻片上。
10)迅速组装好杂交仓。
11)在杂交炉中，65℃，10rpm，杂交17h。
5、芯片洗涤和扫描
1)洗液1和洗液2加入2ml的10％Triton X-102，洗液2需要37℃预热过夜。
2)将已经完成杂交的芯片从杂交炉中取出，拆开杂交仓，按以下步骤洗涤芯片。
3)将洗好的芯片装入片夹中，放入扫描仪进行扫描。扫描参数如下：
如图1～5所述：总共3853个mRNA在5组中表达差异显着(FDR＝0.01)。其中69个mRNA的表达量与肝脏年龄(上调表达或下调表达)具有一致的相关性。此外，基于DAVID的基因功能再分析获得了17个mRNA，分别为：
实施例3
验证3m，6m、9m、12m、15m、18m、21m、24m以及四个不同年龄段6m-6m、12m-6m、18m-6m、24m-6m移植肝脏的17个mRNA的表达变化，以进一步验证芯片结果。
1、逆转录
1)准备材料：逆转录酶(fermentas，EP0442)，脱氧核糖三磷酸核苷(fermentas，R0191)，RiboLock核糖核酸酶抑制剂(fermentas，E00381)
2)步骤：
a.加入
b.轻轻混匀，65℃变性10min，后立即置于冰上2min后加入：
25℃孵育10min后42℃孵育60min，70℃加热灭活10min。-20℃保存。
2、实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)
1)材料：
2)步骤：
①引物由primer5.0软件设计，并由英俊公司合成。
PT-PCR的引物序列：
②引物的配制
a.将引物瞬时离心；
b.按照说明书加入去离子水，加盖混匀，配成100μM/L的贮存液；
c.另取一EP管，将上、下游引物稀释为10.0μM/L终浓度的工作液。
3、cDNA的配置
将cDNA从冰箱中取出，加入适量的去离子水，稀释至合适的浓度。
4、反应体系
5、反应条件
结果表明，芯片检测结果具有一定的假阳性，用PCR再次验证，得到如下10个具有显著意义的10个基因，这与肝脏的糖代谢，蛋白代谢，炎症及蛋白再生密切相关，这也与目前的衰老肝脏相关的报道吻合，然而我们所筛查的候选基因暂时还没有相关报道。
实施例4
在生物体内mRNA最终会翻译成蛋白质发挥重要的生理功能，mRNA的表达量与蛋白质的表达并不完全一致，为了寻求精确的衰老marker，我们进一步用western blot加以验证。
Western Blot检测不同年龄阶段肝脏组织相关基因的表达
1.组织总蛋白提取：
组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2.蛋白浓度定量
使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。
3.SDS-PAGE电泳
1)样品处理
①根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量均为40μg。
②在蛋白样品中加入适当量的5×蛋白上样缓冲液，95-100℃沸水浴5min。
2)制胶与上样
①配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
②配制浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
③拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。
④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿。
4.转膜
1)准备转膜滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。
2)按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡。
3)按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。
5.抗体孵育
1)将转好的膜加入封闭液室温封闭1h。
2)除去封闭液，加入已稀释好的一抗4℃过夜。
3)回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min
4)加入稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min。
6.化学发光检测
1)滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。
2)根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。
7.结果分析
将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。
结果如图7～9所示IGF1，CBX6的结果有显著性的表达意义。我们做的分子关联性分子，发现这两个分子可以相互作用，从不同的路径调控衰老。
实施例5
即通过杂交测序方法，通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以快速得到所测DNA碎片的基因序列。通过人工点样的方法将17个已知的基因的寡核苷酸分子点样于化学处理后的基片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。
1.提取待检测样本的RNA并进行逆转录，然后进行PCR扩增，得到扩增产物；
2.将扩增产物与杂交液混合均匀后涂布于上述筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片，杂交得到杂交芯片；
3.杂交芯片显色读取，获取杂交信号并分析检测结果，以判断肝脏衰老情况。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120>筛查与肝脏衰老相关mRNA的基因芯片及其制备方法和应用
<211>60bp
<212>DNA
<213>Igf1
<400>1
CCCACAAAACAACACATGTTCTTAAGTCCTGGGCTTTGTTTTCACTTCGGCCTCATAATA
<210>2
<211>60bp
<212>DNA
<213>Igf2bp2
<400>2
GGCTTTTGCGCTGAAGGATGACCACGTCCTGGTTATTGTGAAGAAACCATGACAACTACC
<210>3
<211>60bp
<212>DNA
<213>Itln1
<400>3
CAGGCAGTGTGGAGACTTCGGGGCGTTTGATTGGAACGGATACGGAACTCACACTGGGTA
<210>4
<211>60bp
<212>DNA
<213>Il3ra
<400>4
GTGTTCACTCTGCAGATCAACCAGAGTTCACAGACAGAGCCAAAGCTTGAGATGGTATAT
<210>5
<211>60bp
<212>DNA
<213>Rup2
<400>5
ATCTCAGCATACAGCCAGCTCTTTTACTGGCTATTGCTTATTTATTCACCAGAGCCACAA
<210>6
<211>60bp
<212>DNA
<213>Mbl2
<400>6
TGCTCCTTTCTATGAGTGAAAATGTTGGAAAGAAGTACTTCATGAGCAGTGTTAGAAGGA
<210>7
<211>60bp
<212>DNA
<213>Cbx6
<400>7
GTGAGCTGTATGGGCCCAAGAAGAGGGGACCTAAACCCAAAACTTTCCTCCTAAAGGCCC
<210>8
<211>60bp
<212>DNA
<213>Adamts3
<400>8
TGCTATCACTGATTCCATAGGTGCTTCTCCCCAGACAAGAACCCCAAAGAAAGATGGAAA
<210>9
<211>60bp
<212>DNA
<213>RGD1562814
<400>9
TCCCAGTAAACATGGAAGCCTGATGCTTACACAGTTCATCCTTCTTCCTCTTTCTAACTA
<210>10
<211>60bp
<212>DNA
<213>Gk
<400>10
CCTGCTTGTTTGCTTTTAACAGCTCAGATGTCTTTTCTACATATTAGAAGACCACAACAC
<210>11
<211>60bp
<212>DNA
<213>Pgbd5
<400>11
CATCGCCGTCAACAACGCCTACATCCTGTACAAAATGTCAGACGCCTACCATGTGAAGAG
<210>12
<211>60bp
<212>DNA
<213>Gsc
<400>12
CTCTTCCAGGAGACAAAGTACCCAGACGTGGGCACTCGGGAGCAACTGGCCCGGAAGGTG
<210>13
<211>60bp
<212>DNA
<213>Tnfrsf9
<400>13
TCAGGAAGAAGTTCCCCCACATATTCAAGCAACCATTTAAGAAGGCGGTTAGAACTGCTC
<210>14
<211>60bp
<212>DNA
<213>Dnmbp
<400>14
TGTCTACAGCTCCTTCCTGAAGCCTTACAACCCTCGATGCAGCCATTCGGATTCCTCTGT
<210>15
<211>60bp
<212>DNA
<213>Il18
<400>15
ATCTTCTGCAACCTCCAGGATCAGGAAAAAGAAAGAGGCCTCGAAGCTTCCAAATCACTT
<210>16
<211>60bp
<212>DNA
<213>Rasl11a
<400>16
TGAGCTGGGTAGTCTCTTCCTTGAAATTTCTACTAGTGAAAACTACGAAGACGTCTGCGA
<210>17
<211>60bp
<212>DNA
<213>Tbc1d9
<400>17
TACCGCATCGACTTCGAGCAGTTCAAGGGCATGTTTGTGCTCCTCTTTCCCTGGGCGTGT
<210>18
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Igf1- chr7
<400>18
UAUUAUGAGGCCGAAGUGAAAACAAAGCCCAGGACUUAAGAACAUGUGUUGUUUUGUGGG
<210>19
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Igf1- chr7
<400>19
UAUUAUGAGGCCGAAGUGAAAACAAAGCCCAGGACUUAAGAACAUGUGUUGUUUUGUGGG
<210>20
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Igf2bp2- chr11
<400>20
GGUAGUUGUCAUGGUUUCUUCACAAUAACCAGGACGUGGUCAUCCUUCAGCGCAAAAGCC
<210>21
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Itln1- chr13
<400>21
UACCCAGUGUGAGUUCCGUAUCCGUUCCAAUCAAACGCCCCGAAGUCUCCACACUGCCUG
<210>22
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Il3ra- chr12
<400>22
AUAUACCAUCUCAAGCUUUGGCUCUGUCUGUGAACUCUGGUUGAUCUGCAGAGUGAACAC
<210>23
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Rup2- chr8
<400>23
UUGUGGCUCUGGUGAAUAAAUAAGCAAUAGCCAGUAAAAGAGCUGGCUGUAUGCUGAGAU
<210>24
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Mbl2- chr1
<400>24
UCCUUCUAACACUGCUCAUGAAGUACUUCUUUCCAACAUUUUCACUCAUAGAAAGGAGCA
<210>25
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Cbx6- chr7
<400>25
GGGCCUUUAGGAGGAAAGUUUUGGGUUUAGGUCCCCUCUUCUUGGGCCCAUACAGCUCAC
<210>26
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Adamts3- chr14
<400>26
UUUCCAUCUUUCUUUGGGGUUCUUGUCUGGGGAGAAGCACCUAUGGAAUCAGUGAUAGCA
<210>27
<211>60bp
<212>mRNA
<213>RGD1562814-1
<400>27
UAGUUAGAAAGAGGAAGAAGGAUGAACUGUGUAAGCAUCAGGCUUCCAUGUUUACUGGGA
<210>28
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Gk- chrX
<400>28
GUGUUGUGGUCUUCUAAUAUGUAGAAAAGACAUCUGAGCUGUUAAAAGCAAACAAGCAGG
<210>29
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Pgbd5- chr19
<400>29
CUCUUCACAUGGUAGGCGUCUGACAUUUUGUACAGGAUGUAGGCGUUGUUGACGGCGAUG
<210>30
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Gsc- chr6
<400>30
CACCUUCCGGGCCAGUUGCUCCCGAGUGCCCACGUCUGGGUACUUUGUCUCCUGGAAGAG
<210>31
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Tnfrsf9- chr5
<400>31
GAGCAGUUCUAACCGCCUUCUUAAAUGGUUGCUUGAAUAUGUGGGGGAACUUCUUCCUGA
<210>31
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Dnmbp- chr1
<400>31
ACAGAGGAAUCCGAAUGGCUGCAUCGAGGGUUGUAAGGCUUCAGGAAGGAGCUGUAGACA
<210>32
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Il18- chr8
<400>32
AAGUGAUUUGGAAGCUUCGAGGCCUCUUUCUUUUUCCUGAUCCUGGAGGUUGCAGAAGAU
<210>33
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Rasl11a- chr12
<400>33
UCGCAGACGUCUUCGUAGUUUUCACUAGUAGAAAUUUCAAGGAAGAGACUACCCAGCUCA
<210>34
<211>60bp
<212>mRNA
<213>Tbc1d9- chr19
<400>34
ACACGCCCAGGGAAAGAGGAGCACAAACAUGCCCUUGAACUGCUCGAAGUCGAUGCGGUA
