用于单细胞遗传分析的系统和方法
发明领域
本发明涉及用于分子诊断的试剂盒和方法。具体地但非排他地，本发明涉及可用于单细胞的遗传分析的方法和系统。
发明背景
在许多生物医学应用中，表征细胞中的RNA群体是重要的。这在许多研究应用和临床诊断中是有用的。生物组织和生物体的某些数量遗传分析最好在单细胞水平进行。然而，单细胞仅包含皮克的遗传物质。已经引入了分子方案，以通过对个体细胞的RNA进行测序来揭示转录物组。
显微术、荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting；FACS)或基于实时PCR的方法可以提供单细胞角度的实验，但一次仅能够测定少数基因。高通量技术诸如微阵列和RNA-Seq提供所有基因表达的全视图，但需要比在单细胞中发现的遗传物质更多的遗传物质，并且通常用数千到数百万个细胞进行。这些技术在细胞群体水平提供有用的遗传信息，但对于在单细胞水平上理解生物学具有严重的限制。
最近，一种称为CEL-Seq方案的方法被开发用于克服少的起始量的RNA的限制(Hashimshony等，2012,Cell Reports 2，第666–673页)。该方法利用了将样品加条形码并将其汇集，然后通过使用一轮体外转录线性扩增mRNA。所描述的方法比基于PCR的扩增方法显示出更加可重复的、线性的且灵敏的结果。通过该方法能够实现的稳健的转录物组定量也被证明可用于包含不同细胞类型群体的复杂组织的转录物组分析。
为了鉴定转录物组，已经引入了几种放大(scale up)方法。当前的生物工具还缺乏在许多单细胞中并行进行遗传测量的能力。常规单细胞技术是缓慢的、冗长的，并且限制了可以一次性分析的细胞数量。微流体技术已经用于使过程自动化，达到每次运行近似100个细胞，每一次都非常昂贵。机器人技术也已经被开发，以将该过程放大至1000个细胞的数量级。然而，这两种方法都牵涉购买昂贵的机器和部件，并且在这两种技术中，过程都是耗时且不直接的。
美国专利申请第2014/0066318号描述了用于组织样品中核酸的定位或空间检测的方法和产品。国际专利申请第WO 2013/180567号、第WO2007/022026号、第WO 2010/142954号、第WO 2013/188872号、第WO2014/201273号及美国专利申请第US2011/0111981号涉及单细胞分离和/或分析。
国际专利申请第WO 2015/118551号提供了用于将细胞从液体介质分离并进行细胞术分析的设备和方法。WO 2015/118551的内容通过引用以其整体并入本文。
对用于进行单细胞的大规模并行核酸分析(例如，转录物组分析)的改进的方法和系统存在需求。
发明概述
根据一个方面，提供了一种用于并行分析单细胞的核酸的方法，所述方法包括：
(a)将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；
(b)从通过细胞笼(cage)阵列与所述细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸所述液体介质，直至分离的单细胞进入到所述细胞笼阵列的每一个细胞笼中，从而将单细胞分离在细胞笼中以产生分离的细胞；
(c)提供微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，其中每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；
(d)将所述细胞笼阵列安装在所述微阵列上；
(e)向所述细胞笼阵列提供裂解缓冲液以及适于核酸合成和扩增的缓冲液和条件，从而产生扩增的核酸分子的文库；以及
(f)将所述扩增的核酸分子的文库测序，并且根据所述核酸条形码确定所测序的核酸分子的细胞来源。
根据另一个方面，提供了一种系统，所述系统包括：
i.微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含对所述斑点独特的探针和核酸条形码，所述探针包含聚胸腺嘧啶区域；以及
ii.设备，所述设备被配置为将细胞从液体介质分离，所述设备包括：
(a)细胞储存器；
(b)封闭式储存器；
(c)细胞笼阵列，所述细胞笼阵列在所述细胞储存器与所述封闭式储存器之间，每一个细胞笼包括与所述第一细胞储存器相邻的大开口、细胞笼和与所述封闭式储存器相邻的至少一个小开口；
(d)液体介质泵，所述液体介质泵被连接至所述封闭式储存器，所述泵被配置为通过使所述液体介质从所述细胞储存器流动通过所述细胞笼阵列到达所述封闭式储存器而使得所述悬浮的细胞移动进入到细胞笼中；以及
(e)机械元件，所述机械元件当被致动时将所述细胞笼阵列推向所述微阵列，从而所述微阵列形成针对所述大开口的连续屏障，将每一个细胞分离在所述细胞笼的每一个中。
提供该概述，以便以简化的形式介绍概念的选择，这些概念在下文的详述中被进一步描述。该概述既不意图识别所要求保护的主题的关键特征或基本特征，其也不意图被用于限制所要求保护的主题的范围。
附图简述
图1A-H阐释了作为本发明的一个实施方案的用于并行分析单细胞RNA表达的方法。(1A).具有微孔的膜被用于捕获隔离室(isolated chamber)中的个体细胞(1B)。然后将具有细胞的膜安装到具有成千上万个DNA斑点的DNA微阵列上：每一个斑点包含约一百万个DNA分子，其全部具有相同核苷酸序列(1C)。每一个斑点包含该序列的不同变体，并且充当分子条形码。将凝胶添加至膜(1D)，并且添加溶液以裂解细胞(1E)；该凝胶起到防止RNA从笼中漏出的作用。在一个实施方案中，然后在微阵列上进行RNA-Seq方案(逆转录(RT)、第二链合成(SSS)和体外转录(IVT))，产生游离的扩增的RNA(1F-H)。
发明详述
定义
除非另有说明，在讨论中，修饰词诸如修饰本发明的实施方案的一个特征或更多个特征的条件或关系特征的“基本上”和“约”被理解为意指将条件或特征定义为在对于其意图用于的应用的实施方案的操作可接受的公差内。除非另有指示，说明书和权利要求中的词“或”被认为是包括性的“或”而不是排除性的或，并且指示它所连接的项目的至少一个或任何组合。
在本申请的说明书和权利要求中，动词“包括(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”中的每一个及其词形变化(conjugates)，用于指示动词的一个宾语或更多个宾语不必然是动词的一个主语或更多个主语的组分、要素或部件的完整列表。
如本文使用的，“单细胞(single cell)”指一个细胞。术语“分离的单细胞”指从其他组分(例如，细胞或细胞碎片，包括但不限于膜、蛋白或核酸分子)完全、基本上或部分分开、分离、排除出(excluded)或纯化的单细胞。
术语“细胞”指活的生物体的功能基本单位。来自任何群体的悬浮的细胞可以被用于所描述的方法和/或系统；实例包括但不限于哺乳动物细胞、哺乳动物单核血细胞、原核细胞、植物细胞、真核单细胞生物体包括细菌或酵母、或其组合。可以以本领域熟知的几种方式从组织获得悬浮的细胞。细胞可以容易地从血液纯化；单核细胞可以通过用分解细胞外基质的酶诸如胶原酶、胰蛋白酶或链霉蛋白酶进行酶促消化从软组织释放。可选地，可以将组织块(pieces of tissue)置于生长介质中，并且生长出的细胞可用于培养。
如本文使用的，术语“分开(separating)”、“排除出(excluding)”或“分离(isolating)”意图意指物质已经从其他组分(例如，细胞或细胞碎片包括但不限于膜、蛋白或核酸分子)完全、基本上或部分分开、分离、排除出(excluded)或纯化。
在以下描述中，使用与重组DNA技术相关的许多术语。为了提供对说明书和权利要求包括由此类术语预期的范围的清楚和一致的理解，提供以下定义。
术语“核酸”为本领域中熟知的。如本文使用的“核酸”通常将指包含核碱基(nucleobase)的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即，链)。核碱基包括，例如，在DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。
术语“核酸分子”包括但不限于单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、小RNA诸如miRNA、siRNA及其他短的干扰核酸、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA、tnRNA、小rRNA、hnRNA、循环核酸、基因组DNA或RNA的片段、降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染起源的核酸、扩增产物、修饰的核酸、质粒或细胞器核酸和人工核酸诸如寡核苷酸。
如本文使用的，“转录物组”指所有RNA分子包括在一个细胞或细胞群体中转录的mRNA、rRNA、tRNA及其他非编码RNA的集合。除了分子身份(identities)以外，“转录物组”通常包括每一个RNA分子的量或浓度。
如本文使用的，“RNA-seq”(RNA测序)为一种使用下一代测序的能力揭示在给定时刻(at a given moment in time)来自基因组的RNA存在和量的快照(snapshot)的技术。CEL-Seq方案在本领域中称为RNA-seq方法，其用于克服少的起始量的RNA的限制，诸如由Hashimshony等，2012,同上,描述的，其通过引用以其整体并入本文。CEL-Seq方案利用了将样品加条形码并将其汇集，然后通过使用一轮体外转录线性扩增mRNA。本领域技术人员将理解，虽然CEL-Seq方案如由Hashimshony等，2012描述的在悬浮液中进行，但本发明的核酸合成和扩增步骤的方法可以以固态，即通过使用微阵列来进行。可选地，核酸合成和扩增步骤可以通过使用用于将DNA斑点的寡核苷酸结合至微阵列的光裂解接头和裂解寡核苷酸探针的光在悬浮液中进行。
如本文使用的，术语“引物”包括天然或合成的寡核苷酸，其能够在与多核苷酸模板形成双链体后充当核酸合成的起始点并沿着模板从其3’末端延伸使得形成延伸的双链体。本发明的范围内的引物毗邻靶序列结合。“引物”可以被认为是短的多核苷酸，通常具有通过杂交或连接与潜在地存在于感兴趣的样品中的靶或模板结合并此后启动与靶互补的多核苷酸的聚合作用的游离3’-OH基团。
在一些实施方案中，本发明的引物包含范围为从8个至30个核苷酸的核苷酸或由范围为从8个至30个核苷酸的核苷酸组成。在一个方面，引物为至少8个核苷酸，或可选地至少9个核苷酸，或可选地至少10个核苷酸，或可选地至少11个核苷酸，或可选地至少12个核苷酸，或可选地至少13个核苷酸，或可选地至少14个核苷酸，或可选地至少15个核苷酸，或可选地至少16个核苷酸，或可选地至少17个核苷酸，或可选地至少18个核苷酸，或可选地至少19个核苷酸，或可选地至少20个核苷酸，或可选地至少21个核苷酸，或可选地至少22个核苷酸，或可选地至少23个核苷酸，或可选地至少24个核苷酸，或可选地至少25个核苷酸，或可选地至少26个核苷酸，或可选地至少27个核苷酸，或可选地至少28个核苷酸，或可选地至少29个核苷酸，或可选地至少30个核苷酸。在一个实施方案中，引物为至多40个核苷酸，或可选地至多50个核苷酸，或可选地至多75个核苷酸，或可选地至多100个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的引物包含一个或更多个功能单元。
如本文使用的，“DNA斑点”为在微阵列板上的不同位置，在这些位置处固定有一种或更多种引物/寡核苷酸，也称为探针。通常，这些探针可以是互补DNA和/或互补RNA样品可以在适当的条件诸如高度严格杂交条件下与其杂交或连接的基因或其他核酸元件的短的部分。在一个实施方案中，每一个DNA斑点的探针被直接或间接附接至阵列的固体表面。
在一些实施方案中，将每一个DNA斑点的寡核苷酸通过光可裂解接头固定至微阵列。光可裂解接头的非限制性实例可以包括具有胺基的光可裂解接头，诸如当用～360nm照射时经历光解的PC 5’-氨基-改性剂-CE-亚磷酰胺。在利用光可裂解接头的实施方案中，本发明的方法还提供通过光裂解释放每一个DNA斑点的寡核苷酸的步骤。
根据本发明的一个实施方案，微阵列为固体表面或基底。在另一个实施方案中，固体表面或基底为玻璃芯片。在另一个实施方案中，固体表面或基底为塑料的。在另一个实施方案中，固体表面或基底为硅芯片。在另一个实施方案中，固体表面或基底为本领域技术人员已知的任何合适的材料。
如本文使用的术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridizes)”指在足够互补以经由沃森-克里克碱基配对形成双链体的核苷酸序列之间的双链体的形成。当这些分子共有碱基对组织同源性(base pair organization homology)时，两个核苷酸序列是彼此“互补的”。“互补的”核苷酸序列将特异性结合，以在适当的杂交条件下形成稳定的双链体。例如，当第一序列的部分可以与呈反向平行有义(anti-parallel sense)的第二序列的部分结合时，两个序列是互补的，其中每一个序列的3’-末端与另一个序列的5’-末端结合，并且一个序列的每一个A、T(U)、G和C分别与另一序列的T(U)、A、C和G对齐。RNA序列还可以包含互补的G＝U或U＝G碱基对。因此，根据本发明，两个序列不需要具有完美的同源性以成为“互补”的。
本发明提供了用于在单细胞水平并行确定大的细胞群体的全部或很大部分的基因的基因表达的方法和系统。在一些实施方案中，在单细胞水平并行进行大的细胞群体的全部或部分转录物组分析。在一些实施方案中，在单细胞水平并行进行大的细胞群体的一个或更多个基因的靶向转录物组分析。在其他实施方案中，在单细胞水平并行进行大的细胞群体的全部或部分基因组DNA分析。
本发明首次示出了利用微孔细胞捕获系统和/或方法和阵列结合的DNA引物的单细胞的大规模并行核酸分析。
在本发明的一些方面，本文描述的方法和/或系统具有利用DNA微阵列技术使单细胞RNA-Seq成为大规模并行的能力。在一个实施方案中，本文描述的方法和/或系统允许仅通过简单和便宜的技术放大至数百万个或更多个细胞。在另一个实施方案中，并行分析细胞通过固态大规模并行性质的微阵列联合加条形码来实现。由于本文描述的方法和/或系统的并行的低体积酶促反应，每个细胞可以使用低量的试剂。在另一个实施方案中，本文描述的方法和/或系统与本领域已知的其他典型测定相比显著降低了基因表达分析的价格。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于并行分析单细胞的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；从通过细胞笼阵列与细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸液体介质，直至分离的细胞进入到细胞笼中，从而分离所述悬浮的细胞，每一个细胞笼中一个细胞以产生分离的细胞；将细胞笼阵列安装在微阵列上，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含探针；向细胞笼提供裂解缓冲液以及适于核酸分析的缓冲液。在一个实施方案中，所述核酸分析包括核酸扩增，从而提供扩增的核酸分子的文库，其中每一个细胞的核酸分子根据核酸条形码确定。在另一个实施方案中，该方法包括将扩增的核酸分子的文库测序，以及确定测序的核酸分子的细胞来源。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于并行分析单细胞的转录物组的方法，所述方法包括以下步骤：将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；从通过细胞笼阵列与细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸液体介质，直至分离的细胞进入到细胞笼中，从而分离所述悬浮的细胞，每一个细胞笼中一个细胞以产生分离的细胞；将细胞笼阵列安装在微阵列上，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含探针；向细胞笼提供裂解缓冲液以及适于逆转录酶(RT)扩增的缓冲液，从而提供扩增的RNA的文库，其中根据核酸条形码确定每一个细胞的RNA。在另一个实施方案中，该方法还包括将扩增的RNA的文库测序，从而确定测序的RNA的细胞来源。
根据另一个实施方案，提供扩增的RNA的文库的步骤包括将包含裂解缓冲液和/或适于逆转录酶(RT)扩增的缓冲液的凝胶垫安装在细胞笼阵列上。
根据一个实施方案，提供或产生扩增的RNA的文库的步骤以相继的方式包括：(i)RT反应；(ii)第二链合成反应，以及(iii)扩增反应，从而提供扩增的RNA的文库。在另一个实施方案中，第二链合成之后是基于PCR的扩增或滚环扩增。在另一个实施方案中，第二链反应包括使用DNA聚合酶-1。在另一个实施方案中，所述DNA聚合酶-1为大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶1大的Klenow片段。在另一个实施方案中，所述步骤还包含核糖核酸酶诸如RNA酶H。在一个实施方案中，RNA酶H产生用作用于DNA聚合酶的引物的切口。
逆转录(RT)反应为本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，逆转录反应混合物包括逆转录酶、dNTP和合适的缓冲液。在另一个实施方案中，反应混合物还包含其他组分，诸如RNA酶抑制剂。在一个实施方案中，期望的逆转录酶活性可以由任何合适的酶提供。在另一个实施方案中，逆转录酶可以选自以下的组：M-MLV、MuLV、A-MLV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM、
技术人员将理解，可以使用具有DNA聚合酶活性的酶来进行等效反应以产生捕获的DNA分子的互补链。该类型的反应为本领域熟知的。
根据一个实施方案，对探针结合的互补DNA进行第二链合成反应。在一个实施方案中，通过任何合适的方法实现第二链合成。在另一个实施方案中，将第一链互补DNA与DNA聚合酶、dNTP和合适的缓冲液一起孵育。在另一个实施方案中，使用RNA:DNA双链体特异性核酸酶诸如内切核酸酶RNA酶H，诸如以使RNA链产生切口，从而形成用于第二链合成反应的引物。在一个实施方案中，所述反应在12℃-20℃、14℃-18℃或约16℃的温度范围内进行。
根据一个实施方案，方法包括扩增步骤，其中产生的DNA，例如，互补DNA分子的拷贝数增加。在另一个实施方案中，扩增可以是线性的或指数的。在另一个实施方案中，感兴趣的扩增方案包括，但不限于：聚合酶链式反应(PCR)或等温扩增或体外转录。
根据方法的一个实施方案，并行分析为多达105个细胞的大规模并行分析。根据方法的一个实施方案，并行分析为多达106个细胞的大规模并行分析。在方法的另一个实施方案中，大规模并行分析为多达106个细胞。在方法的另一个实施方案中，大规模并行分析为约10至106个细胞。在方法的另一个实施方案中，大规模并行分析为约102至106个细胞。在方法的另一个实施方案中，大规模并行分析为多于105个细胞。
根据方法的另一个实施方案，裂解缓冲液为包含去垢剂的低渗缓冲液。可以被使用的典型去垢剂的非限制性实例包括Triton X-100、Nonident-P40或Igepal CA-630和/或不会干扰下游应用的其他非离子性去垢剂。
根据另一个方面，本发明提供了一种系统，所述系统包括：微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；以及设备，所述设备被配置为将细胞从液体介质分离，所述设备包括：细胞储存器；封闭式储存器；细胞笼阵列，所述细胞笼阵列在所述细胞储存器与所述封闭式储存器之间，每一个细胞笼包括与所述第一细胞储存器相邻的大开口、细胞笼和与所述封闭式储存器相邻的至少一个小开口；液体介质泵，所述液体介质泵被连接至所述封闭式储存器，所述泵被配置为通过使所述液体介质从所述细胞储存器流动通过所述细胞笼阵列到达所述封闭式储存器而使得所述悬浮的细胞移动进入到细胞笼中；以及机械元件，所述机械元件当被致动时将所述细胞笼阵列推向所述微阵列，从而所述微阵列形成针对所述大开口的连续屏障，将每一个细胞分离在所述细胞笼的每一个中。
根据系统的另一个实施方案，细胞储存器被配置为用于接收包含细胞悬浮液的液体介质。
根据系统的另一个实施方案，封闭式储存器被配置为用于通过细胞笼阵列从细胞储存器接收液体介质。
根据系统的另一个实施方案，细胞笼的每一个具有内部尺寸，使得仅一个细胞适合于每一个细胞笼，大开口具有足够大的尺寸用于使细胞进入细胞笼，并且小开口具有小于细胞的尺寸，禁止细胞从细胞笼离开进入到封闭式储存器。在另一个实施方案中，所述大开口的每一个独立地为在10微米至150微米之间，或可选地约10微米，或可选地约100微米，或可选地多于10微米，或可选地多于100微米。在另一个实施方案中，所述小开口的每一个独立地为在1微米至8微米之间、在1微米至6微米之间、在1微米至4微米之间或可选地约2微米。在另一个实施方案中，所述小开口的每一个独立地为小于10微米、小于9微米、小于8微米、小于7微米、小于6微米、小于5微米、小于4微米、小于3微米。
根据系统的另一个实施方案，细胞笼的每一个具有待被分离的靶细胞的内部形状。
根据另一个实施方案，捕获的细胞阻塞它们的笼中的小开口，从而减少将另外的细胞抽吸到该笼中的力，确保不多于一个单细胞被捕获在每一个笼中。
根据系统的另一个实施方案，细胞笼的每一个具有选自由圆柱形状、内部圆锥形状和内部半球形状组成的组的内部形状。
根据另一个实施方案，所述细胞笼的每一个具有足够大的内部尺寸以适合不同类型的单细胞。根据另一个实施方案，所述细胞笼的每一个具有足够大的内部尺寸以适合不同尺寸的单细胞。根据另一个实施方案，所述细胞笼的每一个具有足够大的内部尺寸以适合不同类型和尺寸的单细胞。本领域技术人员将理解，根据本文描述的方法和/或使用本文描述的系统分析的细胞悬浮液可以包含多种细胞群体和/或在多种生长阶段诸如细胞周期。根据另一个实施方案，细胞笼的每一个具有足够大的内部尺寸以适合单细胞。
根据系统的另一个实施方案，液体介质泵为来自以下列表的任何装置：电动泵、微型泵、带有附加卡尺的手动注射器、自动可编程注射器、计算机化的注射器、注射器驱动器、注射器泵、可编程注射器泵、介质分配器、感应泵、压力注射细胞分配器、蠕动泵和输液泵。
根据系统的另一个实施方案，可以控制细胞温度。在另一个实施方案中，细胞温度的控制通过将系统(例如，细胞笼阵列或微阵列)附接至电控制热源而成为可能。
根据系统的另一个实施方案，在细胞笼阵列与封闭式储存器之间存在玻璃过滤器支撑件，使得玻璃过滤器支撑件将细胞笼阵列维持在平坦的二维平面中。
根据系统的另一个实施方案，设备为计算机化的设备，所述计算机化的设备包含至少一个用户接口、至少一个组件接口以及能够控制至少一个组件的至少一个处理单元。
如本文使用的，“条形码(barcode)”指用于在扩增和测序程序之后鉴定核酸的细胞来源的核酸序列。根据本发明的教导，条形码序列对每一个DNA斑点是独特的。在另一个实施方案中，独特的条形码序列允许每一个细胞的核酸(基因组或转录物组)与原始细胞关联。在另一个实施方案中，条形码序列用于将基因组追溯到每一个细胞。在另一个实施方案中，条形码序列用于将转录物组追溯到每一个细胞。根据一个实施方案，条形码序列包含至少2个核苷酸，或可选地多于2个核苷酸，或可选地至少4个核苷酸，或可选地至少6个核苷酸，或可选地至少8个核苷酸，或可选地至少10个核苷酸，或可选地至少12个核苷酸，或可选地至少14个核苷酸，或可选地至少20个核苷酸，或可选地至多8个核苷酸，或可选地多于8个核苷酸，或可选地至多10个核苷酸，或可选地至多14个核苷酸，或可选地至多20个核苷酸。
在一些实施方案中，每一个DNA斑点的探针还包含独特的分子标识符序列(UMI)。本领域诸如由Kivioja等，2012,Nat Methods 9:72-74已经描述了UMI序列。UMI序列为随机序列，其可以被添加以定量每一个转录物分子的绝对数目并消除扩增偏倚。
根据另一个实施方案，探针还包含能够与核酸杂交的核苷酸序列。在另一个实施方案中，能够与核酸杂交的核苷酸序列直接或间接位于探针的3’末端中的条形码序列的下游。在另一个实施方案中，能够与核酸杂交的核苷酸序列包含能够与RNA杂交的随机核苷酸序列。在另一个实施方案中，能够与核酸杂交的核苷酸序列被设计为与mRNA的多聚-A尾巴杂交。在另一个实施方案中，能够与mRNA的多聚-A尾巴杂交的核苷酸序列为聚T序列。在另一个实施方案中，能够与mRNA的多聚-A尾巴杂交的核苷酸序列为多聚-U寡核苷酸或包含脱氧胸苷类似物的寡核苷酸。在另一个实施方案中，多聚-T序列和/或多聚-U序列和/或其类似物或其组合包含至少6个核苷酸、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个或40个核苷酸。
在另一个实施方案中，探针还包含在5’末端上的启动子。在另一个实施方案中，启动子为可以使RNA聚合酶能够以5’至3’方向转录下游序列的任何启动子。在另一个实施方案中，启动子为T7启动子。在另一个实施方案中，探针还包含在5’末端上的衔接子(adaptor)。在另一个实施方案中，探针还包含直接或间接位于启动子下游的衔接子。在另一个实施方案中，探针还包含直接或间接位于条形码序列和/或杂交序列的上游的衔接子。在另一个实施方案中，衔接子为测序衔接子(也称为连接物(adapter))。
根据本发明的实施方案，探针包含(从5’至3’)启动子、衔接子、条形码序列和核酸杂交序列。在另一个实施方案中，探针还包含在5’末端上的启动子。在另一个实施方案中，探针的不同区域可以彼此直接或间接相邻。在另一个实施方案中，启动子为T7启动子。在另一个实施方案中，衔接子为测序衔接子。在另一个实施方案中，核酸杂交序列为多聚-T序列。在另一个实施方案中，在条形码的直接或间接上游或下游存在4个、5个、6个、7个或8个随机核苷酸。
根据本发明的一个实施方案，探针被锚定至微阵列的表面。在另一个实施方案中，探针通过任何合适的方法被附接至微阵列表面。在另一个实施方案中，探针通过化学固定被固定至阵列的基底。在另一个实施方案中，探针被直接或间接固定至阵列的基底。在另一个实施方案中，将探针直接在基底上合成。
本发明提供了用于分离单细胞并且对每一个细胞单独地进行核酸(例如，mRNA)分析的系统和方法。细胞的分离优选地使用抽吸泵进行以将细胞从液体介质抽吸到穿孔的细胞笼阵列中，其中每一个笼可以具有使得仅一个细胞可以适合的尺寸。本发明部分地基于以下发现结果：如本文描述的通过将细胞悬浮液抽吸到穿孔的过滤器中来捕获单细胞有利地使快速且高度准确的单细胞分离成为可能。如此，通过抽吸的细胞捕获在每一个细胞笼内产生单细胞，由于单细胞进入到细胞笼中导致抽吸到所述细胞笼的阻塞，从而消除另外的细胞进入细胞笼的驱动力。此外，与其他细胞分离方法(例如，使用重力)相反，使用抽吸力可以容易地伴随简单的洗涤以去除过量的细胞或碎片。
每一个细胞笼的穿孔可以包括在具有悬浮的细胞的液体介质的一侧的一个大开口或孔以允许一个细胞进入每一个笼；和在液体介质从其被抽吸的一侧的多个小开口或孔，所述多个小开口或孔可以太小而使得被诱捕的细胞不能离开笼。在笼被细胞占据之后，将笼阵列安装在包含DNA斑点的微阵列上，在一些实施方案中，每一个DNA斑点包含锚探针引物和条形码序列。在一个实施方案中，将包含缓冲液(例如，适于RT扩增的缓冲液)和裂解缓冲液(例如，包含去垢剂)的凝胶垫铺设在膜上。分析可以通过诱导细胞裂解和检查每一个细胞的内容物来进行。细胞笼为其中在细胞被捕获之后裂解进行的地方，并且包括来自顶部的细胞笼阵列和来自底部的微阵列。在其中要求转录物组分析的实施方案中，从裂解的细胞释放的mRNA已知具有重复腺嘌呤(多聚-A)尾巴，允许其被锚定至阵列的多聚-T探针捕获。在一些实施方案中，探针还包含启动子。在一些实施方案中，启动子为T7启动子。在一些实施方案中，探针还包含测序衔接子。在一些实施方案中，探针包含(从5’至3’)T7启动子、测序衔接子、独特的条形码和聚T。接下来，移出笼阵列并可以进行第二链合成，互补的DNA样品被汇集，并且因此包含用于IVT反应的足够的模板物质。进行体外转录(IVT)反应；T7聚合酶结合在微阵列上的双链DNA，产生扩增的RNA。将RNA片段化为适于测序的尺寸分布，通过连接添加3’衔接子，将RNA逆转录为DNA，并选择包含衔接子和条形码二者的片段。
现在参考图1A-H，其为根据本发明的一些实施方案的系统和方法的示意图。附图阐释了本发明的某些实施方案和方面，且不应被解释为限制本发明的范围。本领域技术人员将理解，可以对本文公开的具体实施方案进行许多改变而仍然获得相同或相似的结果。图1A阐释了根据本发明的一些实施方案的包括具有用于诱捕个体细胞的圆柱形孔的细胞笼阵列的膜(106)。细胞笼阵列可以包含穿孔的细胞笼(101)，每一个笼具有大开口102和小开口104。在一些实施方案中，大开口102的每一个可以足够大，以用于使单细胞进入与细胞储存器103相邻的一侧的每一个笼。在一些实施方案中，小开口104足够小以禁止细胞在与封闭式储存器105相邻的一侧离开。在一些实施方案中，大开口和小开口的尺寸取决于靶细胞的尺寸。在一些实施方案中，大开口可以从约10微米至约150微米变化。在一些实施方案中，小开口可以从约1微米至约8微米变化。例如，细胞笼阵列可以包括分别携带2微米孔和10微米孔的两个聚碳酸酯膜过滤器。图1B阐释了根据本发明的实施方案的系统和/或方法的随后步骤，其中每一个笼(101)包含从细胞悬浮液分离的细胞(201)。在一些实施方案中，在封闭式储存器(105)的一侧的小开口(104)被连接至抽吸泵机构；因此可以使用抽吸泵将细胞从液体介质抽吸到穿孔的细胞笼阵列中进行细胞的分离。图1C阐释了作为一个实施方案的随后步骤，其中将具有细胞的膜(106)随后安装到具有多个(例如成千上万个)DNA斑点(302)的DNA微阵列(301)上：每一个斑点可以包含约一百万个DNA分子，其全部具有相同核苷酸序列(探针)。每一个DNA斑点(302)包含该序列的独特变体，从而充当分子条形码。多聚-T DNA序列可以用作探针，以捕获本领域已知包含多聚-A序列的mRNA。图1D阐释了作为一个实施方案的随后步骤，将凝胶(401)添加(即，安装)在与封闭式储存器105相邻的一侧的膜(106)上。在一些实施方案中，凝胶(401)包含裂解溶液。在另一个实施方案中，将裂解溶液添加至包含细胞的孔中。图1E阐释了细胞裂解以及随后核酸分子(501)诸如RNA的释放。在另一个实施方案中，凝胶(401)起作用以防止核酸分子从笼中漏出。图1F示出了根据本发明的另一个实施方案的随后步骤，其中单细胞逆转录反应在每一个DNA斑点中发生，产生与探针结合的互补DNA。在一些实施方案中，锚定的探针包含用于允许与mRNA的多聚A序列杂交的多聚T序列和独特的条形码。在一些实施方案中，探针充当逆转录引物，且mRNA为模板。在一些实施方案中，引物还包含启动子。在一些实施方案中，启动子为T7启动子。在一些实施方案中，引物还包含测序衔接子。在一些实施方案中，衔接子为5’Illumina测序衔接子。在一些实施方案中，引物包含锚定的多聚T、独特的条形码、5’Illumina衔接子和T7启动子。图1G阐释了作为另一个随后的实施方案，在移出膜之后进行第二链合成。此类第二链合成可以通过技术人员已知的合适方法来实现。互补的DNA样品然后可以被汇集，并且因此包含用于IVT反应的足够的模板物质。图1H阐释了作为根据本发明的实施方案的另一个随后步骤，进行体外转录(IVT)反应。在此类实施方案中，聚合酶(801)，例如，T7聚合酶，结合微阵列上的双链DNA，产生扩增的RNA，其随后可以被收获。
在示例性的实施方案中，根据标准方案在Illumina HiSeq2000上对RNA文库进行测序。在利用Illumina HiSeq2000的一些实施方案中，条形码具有8个核苷酸的长度并被设计为4个一组，使得前5个核苷酸将具有所有4种核苷酸的等同表示，以允许模板产生和基于前4个核苷酸的串扰校正(crosstalk corrections)在Illumina平台上读取。在一些实施方案中，条形码被设计为使得每一对相差至少两个核苷酸。根据所述实施方案，单个测序误差将不会产生错误的条形码。本领域技术人员可以认识到，通过条形码和引物的微调，可以使用不同的技术对文库进行测序。
可以理解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多个特征，也可以单独地或以任何合适的亚组合或合适地在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在多种实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的必需特征，除非没有那些要素实施方案不可实施。
尽管已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是明显的是，许多替代形式、修改形式和变化形式对于本领域技术人员来说将是明显的。因此，预期涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围内的所有这些替代形式、修改形式和变化形式。
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请在此通过引用以其整体并入本说明书，其程度与当每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指示通过引用并入本文时相同。另外，在本申请中的任何参考文献引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的方面来说，不应该将其解释为必然的限制。
