使用扩增测定细胞
相关申请
本申请要求由Weitz等于2015年3月13日提交的标题为“Determination of Cells Using Amplification”的美国临时专利申请序列号62/133,140的权益，所述专利申请通过引用整体并入本文。
领域
本发明总体涉及微流体，特别地涉及使用扩增来测定细胞的系统和方法。
背景
样品诸如临床样品中稀有细胞的测定，代表了尚未解决且难以处理的医学问题。这些稀有的细胞通常存在于疾病的早期阶段，如果没有及时发现，可能会导致严重的后果。大多数常规分子生物学技术，诸如实时定量PCR，由于存在大量的背景细胞、抑制剂、噪声等而具有有限的灵敏度。另外，样品中的细胞可以是高度异质的，使得用于在群体水平上检测靶细胞的大量方法通常不能提供单细胞分辨率或检测。因此，以足够高的灵敏度和特异性单个地测定这些重要的稀有细胞仍然是具有挑战性的。
概述
本发明总体涉及微流体，特别地涉及使用扩增来测定细胞的系统和方法。在一些情况下，本发明的主题涉及相关产品、针对特定问题的替代解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。
在一个方面中，本发明总体涉及方法。在一组实施方案中，该方法包括以下动作：将细胞封装在多个微流体液滴内；裂解所述多个液滴内的至少一些细胞以将核酸从细胞释放至液滴的内部；在液滴的内部，施加能够选择性扩增怀疑存在于从细胞释放的核酸内的靶核酸序列的条件；将液滴的内部合并在一起以形成组合流体；以及测定所述组合流体中所含的扩增核酸。
在另一组实施方案中，该方法包括在多个液滴中包封来自多个细胞的核酸，施加能够选择性扩增怀疑存在于核酸内的靶核酸序列的条件；将液滴的内部合并在一起以形成组合流体；以及测定所述组合流体中所含的扩增核酸。
在另一组实施方案中，该方法包括将细胞封装在多个液滴内；裂解所述多个液滴内的至少一些细胞以将核酸从细胞释放至液滴的内部；在液滴的内部，施加能够选择性扩增怀疑存在于从细胞释放的核酸内的靶核酸序列的条件；以及测定包含在液滴内的扩增的核酸。
在另一方面，本发明包括制备本文所述的一个或多个实施方案的方法。在另一方面，本发明包括使用本文描述的一个或多个实施方案的方法。
当结合附图考虑时，根据本发明的各种非限制性实施方案的以下详细描述，本发明的其它优点和新颖特征将变得显而易见。在本说明书和通过引用并入的文献包括冲突和/或不一致的公开内容时，则以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文件包括相互矛盾和/或不一致的公开内容，则以具有较晚生效日期的文献为准。
附图简述
将参考附图通过实例的方式描述本发明的非限制性实施方式，所述附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚起见，在每个附图中并非每个组分都被标记，也不是显示的本发明每个实施方案的每个部件都被标记，其中图示并不是本领域普通技术人员理解本发明所必需的。在图中：
图1图示说明根据本发明的一个实施方案的细胞扩增；
图2图示说明根据本发明的某些实施方案的用于PCR的技术；和
图3A-3B图示说明使用本发明的一个实施方案检测突变体的数据。
详述
本发明一般涉及微流体，特别地涉及使用扩增来测定细胞的系统和方法。在一组实施方案中，将细胞包封在液滴内并在液滴内扩增来自细胞的核酸。然后可将液滴汇集在一起，并且可使用PCR或其它合适的技术来测定扩增的核酸。在一些实施方案中，例如，如果使用能够选择性扩增从所述相对稀有的细胞产生的核酸的条件扩增液滴的话，可将诸如这些的技术用于检测可能存在的相对稀有的细胞。
参考图1，现在讨论本发明的一个方面。然而，在其它实施方案中，也可使用其它系统和方法，例如如下所述的。在图1中，显示了一群细胞10。大多数细胞是第一细胞类型11(或不止一种细胞类型)，同时存在包含在群体内的第二类型12的稀有细胞。这些稀有细胞是主要感兴趣的，例如作为靶细胞。作为非限制性实例，所述第一细胞可以是正常细胞，而第二细胞可以是癌细胞或患病细胞，第一细胞可以是人细胞，而第二细胞可以是非人细胞(例如，致病细胞诸如细菌等)，等等。
在一些情况下，第二(或靶)细胞在整个细胞群体内可能相当稀有。例如，1000个、10,000个、100,000个或1,000,000个细胞中只有1个可能是第二细胞类型，而其它细胞可以是第一细胞类型。这种稀有度在确定第二细胞类型时在某些情况下可能导致问题。作为说明性的非限制性实例，用于测定细胞群体中的细胞或核酸的许多现有技术具有假阳性错误率。作为实例，错误率可以是1％，即，在每100个所研究的细胞中，有一个在其应该被鉴定为阴性(即作为第一细胞类型)时却被错误地鉴定为阳性(即作为第二细胞类型)。然而，与群体内第二细胞类型的稀有度相比，即使相对较低的错误率(诸如1％)也仍然可能相当大。例如，如果群体中每1,000个第一细胞仅存在1个第二细胞，那么即使1％的假阳性错误率仍然会导致约90％的被鉴定为阳性的细胞是被错误地鉴定了。
然而，如本文所讨论的各种实施方案可增强正确测定细胞群体内的稀有细胞的能力。作为一个非限制性说明性实例，如图1所示，细胞群体10包含第一细胞类型11(或不止一种类型)和第二细胞类型12。(如上所述，第二细胞类型12在某些实施方案中与第一细胞类型11相比可能是非常稀有的，尽管为了清楚起见，图1中没有精确描述这种极端比例)。可将细胞群包封在多个液滴20，例如微流体液滴内。包封比率可以为1:1(即，一个细胞对一个液滴)或任何其它合适的包封比率。(为了清楚起见，此处也使用了1:1)。
在液滴内，则可以以某种方式裂解细胞以释放液滴内的核酸，例如来自细胞的DNA和/或RNA可以从液滴内的细胞释放。可使用任何合适的裂解细胞的技术来进行裂解。非限制性实例包括超声或暴露于合适的试剂诸如表面活性剂。在某些情况下，选择的确切技术可取决于被裂解细胞的类型；许多这样的细胞裂解技术将是本领域普通技术人员已知的。
然后，可在液滴内扩增核酸。可使用各种技术来扩增液滴内的核酸，例如PCR(聚合酶链式反应)技术诸如RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)或其它技术，包括本文所讨论的那些技术。在某些实施方案中，可以例如通过注射或与其它液滴合并来将各种PCR试剂(例如，脱氧核糖核苷酸、引物、聚合酶、逆转录酶等)添加至液滴中，和/或可将液滴经受条件(诸如温度变化)以促进通过液滴进行核酸的PCR扩增。
在一些情况下，可以选择扩增条件以相对于其它核酸扩增某些核酸，例如相对于第一细胞类型而从第二细胞类型产生的核酸。例如，如图1中所示，来自细胞12的核酸22相对于来自细胞11的核酸21可被显著扩增。因此，作为一个非限制性实例，可选择PCR扩增的引物，以便相对于来自人细胞的核酸，选择性扩增细菌核酸(或细菌的特定种类)，例如以帮助测定样品中的细菌。在一些情况下，可实现相对大的扩增。例如，可在液滴内使核酸扩增至少约103倍，至少约104倍，至少约105倍，至少约106倍，或至少约107倍。
至少在一些实施方案中，相对于其它核酸(例如来自第一细胞类型的核酸)，在液滴中包含单个细胞可促进所需核酸或靶核酸(例如，从第二细胞类型产生的)的扩增。由于液滴含有相对少的数量的细胞(例如，每个液滴0个或仅1个细胞)，其中不期望的核酸(例如，来自第一细胞类型)相对于靶核酸(例如，来自第二细胞类型)被扩增的竞争反应或其它反应的机会较少。因此，可通过在液滴内进行扩增来增强第二细胞类型的扩增，从而允许核酸群体内的相对稀有的核酸相对于群体内的其它核酸被实质上扩增。相比之下，从不同细胞产生的不同核酸的群体(即，没有液滴)的扩增可能导致通常可阻碍靶核酸的扩增的竞争反应、背景细胞、抑制剂等。
扩增后，液滴的内部可以以某种方式合并或混合在一起。例如，液滴可以例如机械地或通过施加超声波来“爆裂”或破坏以释放其内容物，或者可将液滴结合在一起，例如使用合适的偶极矩或电场。因此，可将核酸混合在一起，例如成为如图1中所示的常见“库”。然后可以例如使用本领域普通技术人员已知的技术，以某种方式定性或定量地分析或测定核酸群体(例如，其可包含从第二细胞类型产生的靶核酸的更大群体)。此类技术的实例包括数字PCR、qPCR或本文所讨论的其它技术。由于从第二细胞类型产生的核酸相对于原始细胞群体可被显著扩增，因此它们更容易被测定。因此，例如可以得出结论，原始细胞群包含(或不包含)癌细胞、细菌细胞或其它目标靶细胞。
上述讨论是本发明的一个实施方案的非限制性实例，其可用于使用扩增例如在液滴内来测定细胞。然而，其它实施方案也是可能的。因此，更一般地，本发明的各个方面涉及用于使用扩增来测定细胞的各种系统和方法。
如上所述，本发明的某些方面通常涉及测定细胞群体内相对稀有的细胞的系统和方法。细胞群体可以包含一种或不止一种类型的细胞。稀有细胞可能例如仅为细胞群体内包含的细胞的约1/1,000、约1/3,000、约1/5,000、约1/10,000、约1/30,000、约1/50,000或约1/100,000、约1/300,000，约1/500,000或约1/1,000,000。作为非限制性实例，细胞群体可取自血液样品、活组织检查样品、组织样品、组织培养物、来自另一生物流体(诸如尿液或汗液)的样品等。作为另外的实例，细胞还可取自某一器官或组织(例如，心脏细胞、免疫细胞、肌肉细胞、癌细胞等)、来自特定个体或物种的细胞(例如，人细胞、小鼠细胞、细菌等)、来自不同生物体的细胞、来自天然存在的样品的细胞(例如，池塘水、土壤等)等。稀有细胞可以是例如癌细胞，或存在于样品中的病原体诸如细菌(例如，其可在受试者中导致疾病)等。因此，作为一个非限制性实例，在一个实施方案中，可从受试者(诸如人受试者)获取血液，并对其进行分析以测定血液中包含的肿瘤细胞(例如，白血病或其它癌细胞)。作为另一个非限制性实例，可以分析取自受试者(诸如人受试者)的血液以测定可能存在的病原体，诸如细菌。
在一些情况下，可将细胞包封在多个液滴诸如微流体液滴内。用于产生或操纵液滴的各种技术是已知的；非限制性实例包括Link等的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2004/091763；Stone等的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公开号WO 2004/002627；Weitz等的标题为“Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请公开号WO 2006/096571；Link等的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2005/021151；Weitz等的标题为“Droplet Creation Techniques,”的国际专利申请公开号WO 2011/056546中描述的那些技术，所述每篇国际专利申请公开号通过引用整体并入本文。
可以以任何合适的平均比率将细胞包封在液滴中。例如，在一组实施方案中，以约1:1的比率(例如平均每个液滴约1个细胞)包封细胞。然而，在一些情况下，可能需要较低的每液滴细胞比率。例如，该比率可小于约1:10，小于约1:30，小于约1:50，小于约1:100，小于约1:300，小于约1:500，少于约1:1,000，小于约1:3,000，小于约1:500，小于约1:10,000，小于约1:30,000，小于约1:50,000，小于约1:100,000，小于约1:300,000，小于约1:500,000，小于约1:000,000，或任何其它合适的细胞对液滴的平均比率。此类比率可用于例如确保大部分液滴包封0或1个细胞，从而限制含有2个或更多个细胞的液滴的数量。然而，在一些实施方案中，也可以使用高于1:1的平均比率，例如至少约2:1，至少约3:1，至少约5:1，至少约10:1，至少约50:1，至少约100:1的细胞对液滴比率等。
封装后，可在液滴内裂解细胞，例如以将核酸释放至液滴的内部。作为非限制性实例，可将液滴内的细胞暴露于裂解化学品(例如，纯水、表面活性剂诸如Triton-X或SDS、酶诸如溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等)或物理条件(例如，超声波、紫外光、机械搅拌等)。可以例如通过将液滴与含有裂解化学品的其它液滴合并、通过注射技术等来添加裂解化学品，例如本文所讨论的。另请参见国际专利申请公开号WO 2010/151776，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可对液滴内的核酸进行标记或“加以条形码”，例如连接至可用于唯一地鉴定核酸的其它核酸。然而，这是可选的，并且在其它实施方案中，不需要加条形码步骤。在一些实施方案中，一个或多个“标签”可以存在于液滴中或被添加至液滴中，可分析或使用所述标签例如以确定液滴的身份和/或历史，以测定液滴内的细胞，测定液滴内的核酸等。在一些情况下，可选择相比于液滴的其它组分而言相对惰性的标签。标签可能最初存在于液滴中，和/或随后添加。例如，当将液滴暴露于一个或多个条件(或在时间上接近暴露)时，可以添加标签。在一些情况下，液滴中可存在不止一种标签。标记或加条形码的非限制性实例论述于Bernstein等于2014年4月17日提交的标题为“Systems and Methods for Droplet Tagging”的美国专利申请序列号61/981,123；Weitz等于2014年4月17日提交的标题为“Methods and Systems for Droplet Tagging and Amplification”的美国专利申请序列号61/981,108；或标题为“Methods and Systems for Barcoding Nucleic Acids using Transposons”的美国专利申请序列号62/072,950中，所述美国专利申请各自通过引用整体并入本文。
释放后，可以以任何合适的方式在液滴内扩增核酸。合适技术的非限制性实例包括PCR(聚合酶链式反应)或其它扩增技术。通常，在PCR中，加热核酸以使核酸解离为单链，并且使用热稳定的DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)来扩增核酸。通常重复该过程多次以扩增核酸。
因此，在一组实施方案中，可在液滴内进行PCR。例如，液滴可含有聚合酶(诸如Taq聚合酶)和DNA核苷酸，并且可处理(例如，通过重复加热和冷却)液滴以扩增液滴内的核酸。聚合酶和核苷酸可以在任何合适的点加入，例如在从液滴内的细胞释放核酸之前，期间或之后。例如，作为一个非限制性实例，可将含有聚合酶或DNA核苷酸的液滴与含有核酸(例如，从细胞产生的)的液滴融合以允许发生核酸的扩增，和/或注射技术可用于引入聚合酶或DNA核苷酸。本领域普通技术人员将了解合适的PCR技术和变型，诸如组装PCR或聚合酶循环组装，其可在一些实施方案中用于产生扩增的核酸。
核酸可以扩增至任何合适的程度。可以例如通过控制诸如温度、循环时间或包含在液滴内的酶和/或脱氧核糖核苷酸的量等因素来控制扩增程度。例如，在一些实施方案中，液滴群可以每个液滴具有至少约10,000个、至少约30,000个、至少约50,000个、至少约100,000个、至少约150,000个、至少约200,000个、至少约250,000个、至少约300,000个、至少约400,000个、至少约500,000个、至少约750,000个、至少约1,000,000个或更多个分子的扩增核酸。在一些实施方案中，核酸可以在液滴内扩增至少约103倍、至少约104倍、至少约105倍、至少约106倍或至少约107倍。
另外，可以使用合适的引物来引发聚合，例如P5和P7，或本领域普通技术人员已知的其它引物。在一些实施方案中，可将引物添加至液滴中，或者引物可以存在于液滴内的一个或多个核酸上。本领域普通技术人员将了解合适的引物，其中许多可以容易地商购获得。
在一组实施方案中，基于其相对于其它类型的核酸而选择性扩增某些类型的核酸的能力来选择引物。例如，相对于来自可能存在于细胞群中的其它细胞的其它核酸，引物可选择性结合从靶细胞产生的核酸并允许其扩增。可基于其结合可能存在于细胞内的DNA或RNA(例如mRNA)的能力选择引物。引物可以例如来自人细胞或非人细胞，例如细菌细胞，这取决于应用。引物也可特异于一种细胞或一种类型的细胞，或者引物可以是非特异性的，或者特异于一类或类型的细胞。例如，引物可包括通常能够识别来自不止一个细菌物种的核酸的非特异性细菌引物。另外，在某些实施方案中，可使用不止一种类型的引物。例如，在一组实施方案中，可使用能够结合细菌、癌细胞等的多种引物，例如以促进相对于群体中的其它细胞而言扩增从这些细胞产生的核酸。许多这样的引物“试剂盒”可商购获得。
在一些实施方案中，可以例如通过注射或与其它液滴合并(例如，如本文所论述的)，将各种PCR试剂(例如，脱氧核糖核苷酸、引物、聚合酶、逆转录酶等)添加至液滴中。在一些情况下，可使用其它技术添加至少一些PCR试剂，或者至少一些PCR试剂可在液滴形成时(例如，当细胞被包封在液滴内时)存在于液滴内。用于合并或结合液滴或将流体注入液滴中的技术是本领域普通技术人员已知的，并且包括本文论述的那些技术。参见，例如，Weitz等的标题为“Fluid Injection，”的美国专利申请公开号2012-0132288；Link等的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2004/091763；Stone等的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公开号WO 2004/002627；Link等的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2005/021151；Weitz等的标题为“Droplet Creation Techniques”的国际专利申请公开号WO 2011/056546，各自通过引入整体并入本文。
另外，在一些实施方案中，可使液滴经历温度变化和/或其它条件以促进液滴内的核酸的PCR扩增。例如，在PCR反应中，可将核酸加热(例如，在一些情况下达到至少约50℃，至少约70℃，或至少约90℃的温度)，以使核酸解离成单链，并将热稳定的DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)用于扩增核酸。通常重复该过程多次以扩增核酸。本领域普通技术人员将了解可使用的各种不同的PCR技术，例如RT-PCR。
扩增后，可以以某种方式将液滴的内部合并或汇集在一起。例如，在一些实施方案中，可使用诸如机械破裂，化学破裂(例如合适的表面活性剂)和/或超声波等技术来破裂(或“破碎”)液滴，例如释放其内容物。在另一组实施例中，可以例如使用偶极矩或电场将液滴合并或结合在一起。参见，例如，Ahn等于2007年1月24日提交的标题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请序列号11/698,298(于2007年8月23日公开为美国专利申请公开号2007/0195127)，通过引用整体并入本文。例如，两个液滴可以被给予相反的电荷(即，正电荷和负电荷，不一定具有相同的量级)，这可增加两个液滴的电相互作用，使得液滴的融合或结合可因它们相反的电荷而发生。例如，可向液滴施加电场，可将液滴通过电容器，化学反应可导致液滴变得带电荷等。在一些实施方案中，如果液滴带有相反的电荷(其可以是，但不一定是相同的量级)，则液滴可能融合或结合。作为另一个实例，液滴可能没必要被给予相反的电荷(并且在一些情况下可能不会被给予任何电荷)，并且通过使用在液滴中诱导的偶极子(其导致液滴结合)来进行融合。
合并后，可使用本领域普通技术人员已知的任何方法分析或测定收集在一起的核酸。例如，在一些实施方案中，可确定由相对稀有的靶细胞产生的核酸的存在(或不存在)。在一些情况下，可测定浓度，例如以测定初始群体中靶细胞的相对量或百分比。在一些实施方案中，核酸也可以被测序。可使用多种技术，例如测序技术，诸如链终止测序、杂交测序、Maxam-Gilbert测序、染料终止子测序、链终止法、大规模并行签名测序(Lynx Therapeutics)、聚合酶克隆测序、焦磷酸测序、连接测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔测序、微流体Sanger测序、数字RNA测序(“digital RNA-seq”)等。
关于用于在微流体系统中操纵液滴的系统和方法的附加细节根据本发明的某些方面。例如，用于筛选和/或分选液滴的各种系统和方法描述于Link等于2006年2月23日提交的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列号11/360,845(于2007年1月4日公开为美国专利申请公开No.2007/000342)中，其通过引用并入本文。作为一个非限制性实例，在一些方面，通过施加(或去除)第一电场(或其部分)，可将液滴引导到第一区域或通道；通过对设备(或其部分)施加(或去除)第二电场，可将液滴引导到第二区域或通道；通过对设备(或其部分)施加第三电场，可将液滴引导至第三区域或通道；等等，其中电场可以以某种方式不同，例如在强度、方向、频率、持续时间等方面不同。
如所提及的，某些实施方案包括容纳在承载流体内的液滴。例如，可存在形成液滴的第一相包含在第二相内，其中相之间的表面包含一种或多种蛋白质。例如，第二相可包含油或疏水性流体，而第一相可包含水或另一种亲水性流体(或反之亦然)。应当理解，亲水性流体是在水中基本上可混溶并且在环境条件(通常为25℃和1atm)下在平衡时不显示与水的相分离的流体。亲水性流体的实例包括但不限于水和包含水的其它水溶液，例如细胞或生物介质、乙醇、盐溶液、盐水、血液等。在一些情况下，流体是生物相容的。
类似地，疏水性流体是在水中基本上不混溶并且在环境条件下在平衡时将显示与水的相分离的流体。如前所述，疏水性流体有时被本领域普通技术人员称为“油相”或简称为油。疏水性流体的非限制性实例包括油，诸如烃油、硅油、氟碳油、有机溶剂、全氟化油、全氟化碳诸如全氟聚醚等。潜在合适的烃的其它实例包括但不限于轻质矿物油(Sigma)、煤油(Fluka)、十六烷(Sigma)、癸烷(Sigma)、十一烷(Sigma)、十二烷(Sigma)、辛烷(Sigma)、环己烷(Sigma)、己烷(Sigma)等。潜在合适的硅油的非限制性实例包括2cs t聚二甲基硅氧烷油(Sigma)。氟碳油的非限制性实例包括FC3283(3M)、FC40(3M)、Krytox GPL(Dupont)等。另外，在一些实施方案中，其它疏水性实体可包含在疏水性流体中。其它疏水性实体的非限制性实例包括药物、免疫佐剂等。
因此，疏水性流体可以作为与亲水性流体分开的相存在。在一些实施方案中，疏水性流体可作为单独的层存在，尽管在其它实施方案中，疏水性流体可作为包含在连续亲水性流体中的单个流体液滴存在，例如，悬浮或分散在亲水性流体中。这通常被称为油/水乳液。液滴可以是相对单分散的，或以多种不同的尺寸、体积或平均直径存在。在一些情况下，液滴可具有小于约1mm的总体平均直径，或如本文所论述的其它尺寸。在一些情况下，可使用表面活性剂来稳定亲水性液体内的疏水性液滴，例如防止液滴的自发结合。表面活性剂的非限制性实例包括在美国专利申请公开号2010/0105112(通过引用并入本文)中公开的那些表面活性剂。表面活性剂的其它非限制性实例包括Span80(Sigma)、Span80/Tween-20(Sigma)、Span80/Triton X-100(Sigma)、Abil EM90(Degussa)、Abil we09(Degussa)、聚甘油多聚蓖麻醇酸酯“PGPR90”(Danisco)、吐温85、749流体(Dow Corning)、Krytox 157 FSL(Dupont)的羧酸铵盐或Krytox 157 FSM的羧酸铵盐(Dupont)或Krytox 157 FSH的羧酸铵盐(Dupont)。另外，表面活性剂可例如是肽表面活性剂、牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白。
液滴可具有任何合适的形状和/或尺寸。在一些情况下，液滴可以是微流体，和/或具有小于约1mm的平均直径。例如，液滴可以具有小于约1mm、小于约700微米、小于约500微米、小于约300微米、小于约100微米、小于约70微米、小于约50微米、小于约30微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约3微米、小于约1微米等的平均直径。平均直径在一些情况下也可大于约1微米、大于约3微米、大于约5微米、大于约7微米、大于约10微米、大于约30微米、大于约50微米、大于约70微米、大于约100微米、大于约300微米、大于约500微米、大于约700微米或大于约1mm。任何这些的组合也是可能的；例如，液滴的直径可在约1mm与约100微米之间。在非球形液滴中，液滴的直径可以被认为具有与非球形液滴相同体积的完美数学球体的直径。
在一些实施方案中，取决于具体应用，液滴可以具有基本相同的形状和/或尺寸(即，“单分散”)，或者具有不同形状和/或尺寸。在一些情况下，液滴可具有截面直径的均匀分布，即在一些实施方案中，液滴可具有这样的平均直径的分布，使得不超过约20％，不超过约10％，或不超过约5％的液滴可能具有大于约120％或小于约80％，大于约115％或小于约85％，大于约110％或小于约90％，大于约105％或小于约95％，大于约103％或小于约97％，或大于约101％或小于约99％的微流体液滴平均直径。Link等在2004年4月9日提交的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请号PCT/US2004/010903(于2004年10月28日公开为WO 2004/091763，通过引用并入本文)中公开了用于产生液滴横截面直径的均匀分布的一些技术。另外，在一些情况下，液滴的平均直径的变化系数可以小于或等于约20％，小于或等于约15％，小于或等于约10％，小于或等于约5％，小于或等于约3％，或小于或等于约1％。然而，在其它实施方案中，液滴可以不一定基本上是单分散的，反而可能表现出不同直径的范围。
本领域普通技术人员将能够测定液滴群体的平均直径，例如使用激光散射或其它已知技术。在某些情况下，如此形成的液滴可以是球形的或非球形的。在非球形液滴中，液滴的直径可以取具有与非球形液滴相同体积的完美数学球体的直径。
在一些实施例中，可通过在由液体包围的流体上产生电荷而在通道内产生一个或多个液滴，这可导致流体在液体内分离成单个液滴。在一些实施方案中，可将电场施加至流体以引起液滴形成。流体可以作为液体内的一系列单个带电荷和/或可电诱导的液滴存在。可使用任何合适的技术(例如通过将流体置于电场(其可以是AC、DC等)和/或引起导致流体具有电荷的反应发生)在液体内的流体中产生电荷。
在一些实施例中，电场由电场发生器(即能够产生可应用于流体的电场的装置或系统)产生。电场发生器可以产生AC场(即，相对于时间周期性变化(例如正弦曲线状、锯齿波状、正方形状等)的电场)、DC场(即，相对于时间是恒定的电场)、脉冲场等。用于产生合适电场(其可以是AC、DC等)的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，在一个实施方案中，通过在一对电极间施加电压来产生电场，所述电极可位于通道附近，使得至少一部分电场与通道相互作用。电极可由本领域普通技术人员已知的一种或多种任何合适的电极材料制成，包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、氧化铟锡(“ITO”)等，以及其组合。
在另一组实施方案中，可通过以能够引起流体形成单个液滴的方式改变通道尺寸，从由通道内的液体包围的流体产生流体的液滴。通道可以例如是相对于流动方向扩展的通道，例如使得流体不粘附至通道壁、反而形成单独的液滴，或相对于流动方向变窄的通道，例如，使得流体被强制结合成单个液滴。在一些情况下，可以以使单个液滴的形成发生的方式相对于时间而改变(例如，机械地或机电地，气动地等)通道尺寸。例如，可机械地收缩(“挤压”)通道以引起液滴形成，或者可机械地破坏流体流以引起液滴形成，例如通过使用移动挡板、旋转叶片等。
本发明的一些实施方案总体涉及用于将两个或多个液滴融合或结合成一个液滴的系统和方法，例如，当所述两个或更多个液滴通常例如由于组成、表面张力、液滴尺寸、表面活性剂的存在或不存在等而不能融合或结合时。在某些情况下，相对于液滴的尺寸，液滴的表面张力也可防止液滴的熔融或结合发生。
作为一个非限制性实例，可以向两个液滴给予相反的电荷(即，正电荷和负电荷，不一定具有相同的量级)，这可增加这两个液滴的电相互作用，使得液滴的融合或结合由于其相反的电荷而发生。例如，可向液滴施加电场，可将液滴通过电容器，化学反应可导致液滴变成带电等。在某些情况下，液滴可能不能融合，即使施加表面活性剂以降低液滴的表面张力。然而，如果液滴带有相反的电荷(其可以是但并不必是相同的量级)，则液滴可能能够融合或结合。作为另一个实例，液滴可能不必被给予相反的电荷(并且，在一些情况下可能不被给予任何电荷)，而是通过使用在液滴中诱导的导致液滴结合的偶极子而融合。此外，允许结合的所述两个或更多个液滴不一定需要满足“正面”。只要最初发生液滴的至少一些融合，那么任何接触角度都是足够的。另见例如由Ahn等于2007年1月24日提交的标题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请序列号11/698,298(于2007年8月23日公布为美国专利申请公开号2007/0195127)，通过引用整体并入本文。
在一组实施方案中，可将流体注射入液滴中。在某些情况下，可以例如使用微针或其它此类装置，将流体显微注射至液滴中。在其它情况下，当液滴与流体通道接触时，可使用流体性通道将流体直接注射至液滴中。流体注射的其它技术公开于例如Weitz等于2010年6月25日提交的标题为“Fluid Injection”的国际专利申请号PCT/US2010/040006(于2010年12月29日公布为WO 2010/151776)；或Weitz等于2009年12月18日提交的标题为“Particle-Assisted Nucleic Acid Sequencing”的国际专利申请号PCT/US2009/006649(2010年7月15日公布为WO 2010/080134)中，每篇均通过引用整体并入本文。
以下文献出于所有目的通过引用整体并入本文：Weitz等的标题为“Systems,Methods,and Kits for Amplifying or Cloning Within Droplets”的美国专利申请序列号62/106,981；Agresti等的标题为“Assay and Other Reactions Involving Droplets”的美国专利申请公开号2010-0136544；Link等的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2004/091763；Stone等的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公开号WO 2004/002627；Weitz等的标题为“Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请公开号WO 2006/096571；Link等的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2005/021151；Weitz等的标题为“Droplet Creation Techniques”的国际专利申请公开号WO 2011/056546；Weitz等的标题为“Creation of Libraries of Droplets and Related Species”的国际专利申请公开号WO 2010/033200；Weitz等标题为“Fluid Injection”的美国专利申请公开号2012-0132288；Agresti等的标题为“Assay And Other Reactions Involving Droplets”的国际专利申请公开号WO 2008/109176；Weitz等的标题为“Fluid Injection”的国际专利申请公开号WO 2010/151776；Bernstein等的标题为“Systems and Methods for Droplet Tagging”的美国专利申请序列号61/981,123；Weitz等的标题为“Methods and Systems for Droplet Tagging and Amplification”的美国专利申请序列号61/981,108；和Weitz等于2014年5月14日提交的标题为“Rapid Production of Droplets”的国际专利申请公开号PCT/US2014/037962。
通过引用整体并入本文的还有Weitz等于2015年3月13日提交的标题为“Determination of Cells Using Amplification”的美国临时专利申请序列号62/133,140。
以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但不代表本发明的全部范围。
实施例1
本实施例演示了根据本发明的一些实施方案的两步骤基于液滴的扩增策略，以克服通常在其它扩增方法中看到的检测误差。在第一步中，将单个细胞封装在液滴(例如，微流体液滴)中，并且在液滴内进行核酸的扩增。该扩增程序与其它扩增技术相似，但目标是从单个细胞扩增靶而不是实际检测。然后将所得的PCR扩增子或扩增的核酸混合在一起，并用作第二步的模板，其包括测定扩增的核酸，例如通过数字PCR、计数等。高度扩增原始单细胞(例如，每个靶基因约103至107个扩增子)导致几个潜在的有利方面，包括统计学上有效的结果、降噪或将样品分成不同部分的能力(例如，用于不同的后续分析)，同时例如不失去覆盖度。
本实施例演示了这种两步骤基于液滴的扩增策略用于检测和定量来自白血病患者血液的携带PLCG1突变的非常稀有的耐药细胞。如根据数学模型所估计的，突变率约为百万分之一。设计突变特异性引物，并将其用于首先大量扩增突变体和野生型细胞中的PLCG1基因。通过运行琼脂糖凝胶电泳，观察到只有突变体细胞中的PLCG1基因才能被扩增。然后将细胞用裂解缓冲液封装至液滴中，随后注射RT-PCR试剂和进行RT-PCR。在突变细胞的液滴检测结果中，观察到两个群体：具有低荧光强度的群体表示空液滴，具有高荧光强度的另一个群体表示含有PLCG1突变型细胞的液滴。在野生型细胞样品中，观察到0.1％的亮液滴，尽管在理论上不应该会观察到明亮的液滴。因此，在扩增的第一步之后，如果突变率为百万分之一，则不可能准确地定量突变细胞。
将所有扩增子混合在一起，并进行第二步基因特异性数字PCR。其中发生扩增的液滴含有约107个扩增子，而“噪声”液滴含有非特异性扩增子或没有扩增子，因此突变型与野生型细胞之间的差异已从1:0扩大至107:0。因此，这些结果更具统计学显著性，而不是随机性。为了能够准确地定量突变型细胞的数量，通过将突变型和野生型细胞以低至1:106的不同比率混合来制备连续稀释物。两步扩增后，建立标准曲线，将其用于观察稀释倍数与细胞数量之间的线性关系。使用该标准曲线，可定量真实临床样品中的突变型细胞。
实施例2
本实施例评估抗微生物药在感染性疾病患者中的功效。用于研究其功效的最重要标志之一是基因上调或下调。通过在药物存在或不存在的情况下比较某些基因的表达水平(mRNA)，可测定药物对微生物的有效性。
然而，在某些基因表达的检测中，感染病原体浓度的早期基因表达通常非常低，细菌中的mRNA也很低，每个基因约10个mRNA。另外，应该用于扩增的引物通常是未知的，因为不知道在许多可能的病原体候选物中哪种病原体存在于样品中。然而，在本实施例中，所有病原体候选引物首先被用于扩增样品中的所有候选细菌mRNA片段，然后将样品分开，并为单个候选物准备数字PCR混合物以进行检测。在一些情况下，每个数字PCR混合物可以被加以条形码(例如用荧光染料)，以用于同时检测。
实施例3
以下是可用于本发明的某些实施方案的示例性材料和方法。
在宿主细胞存在下检测稀有的突变型细胞。表达突变型和野生型靶基因的细胞的制备。将表达野生型和突变型磷脂酶C(PLCG-1)基因的稳定的小鼠白血病细胞系30019保持在补充有10％低内毒素胎牛血清、100U青霉素/ml、100μg/ml链霉素、15微克/ml庆大霉素、1％谷氨酰胺、50×10-6M 2-巯基乙醇和1000ng/ml G418的RPMI-1640中。收获这些细胞并计数，然后将它们共同流入微流体装置用于单细胞分析。将30019细胞分别以1:1000、1:100,000、1:100,000和1:1000000比率与白细胞混合。
微流体装置的制备。使用标准软光刻法制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体装置。通过用Aquapel(PPG，Pittsburgh，PA)处理使微流体通道壁变得疏水。
制备2x细胞裂解缓冲液和2xRT-PCR混合物。细胞裂解缓冲液含有1M Tris-HCl pH 8.0、10％Tween 20、100mg/ml蛋白酶K和2,000U/ml DNA酶I。从IDT购买用于扩增磷脂酶C(PLCG-1)基因的引物，其为F-5'-GGGTAAGTGGCATGAGCAAGAAAGAACC-3'和R-5'-TTTCTGCGCTTTGTGG TTTATGAA-3'。Taqman探针购自Life Tech，其序列为5'-FAM-ACACAGGAGAAGGTGACATTTGAA-3'-MGB。50微升2xRT-PCR混合物含有与Qiagen的2xOneStep RT-PCR缓冲液混合的4微升OneStep RT-PCR酶、800微摩尔浓度dNTP、0.6微摩尔浓度正向和反向引物、0.5微摩尔浓度Taqman探针、0.4微克/微升BSA和0.4％吐温20。
含有细胞的单分散水滴的产生和细胞的裂解。使用微流体芯片，其包含横截面为35微米2的共流滴制备器，以在含有2％(w/w)Krytox-PEG二嵌段共聚物表面活性剂(RAN Biotech,Beverly,MA)的氟化油HFE-7500(3M,Saint Paul,MN,U.S.A)中产生50微米(直径)的单分散水滴。将细胞裂解缓冲液和不同的细胞混合物以1:1的比率通过在不同通道中共流动包封在液滴中。将液滴收集在PCR管中并用矿物油覆盖。为了裂解这些液滴中的细胞，使用以下方案：37℃持续10分钟，50℃持续20分钟，70℃持续10分钟，然后将含有裂解细胞的液滴保持在冰上。
2×RT-PCR试剂的皮量注射和RT-PCR。将含有裂解细胞的液滴流入微流体皮量注射装置，并通过电结合将2×RT-PCR混合物注入滴液中。参见例如美国专利公开号2012/0132288，通过引用整体并入本文。通过具有2％w/w表面活性剂的油在芯片上间隔液滴。将装置电极连接到高压TREK 2210放大器(TREK,Lockport,NY)，该放大器以25kHz的频率提供100V正弦波。选择PCR混合物的流速以确保在结合时以～1:1的比率加入缓冲液。满足这些要求的典型流速对于油而言为300微升/小时、对于条形码引物-液滴而言为60微升/小时、对于PCR混合物而言为30微升/小时。将滴液收集在PCR管中并用矿物油覆盖以防止蒸发。使用以下RT-PCR方案：50℃进行30分钟，95℃进行10分钟，2个循环(94℃进行15秒，64℃进行8分钟)和38个循环(95℃进行15秒，62℃进行1分钟)。
第二轮数字PCR。为了获得用于第二轮数字PCR的模板，将25微升的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(PFO；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加至乳液中，并轻轻离心以分离相。来自第一轮RT-PCR的PCR产物均处于液相中。将PCR产物稀释1,000倍，用于第二轮数字PCR。25微升PCR混合物含有1微升与Qiagen的1xOneStep RT-PCR缓冲液混合的OneStep RT-PCR酶混合物、400微摩尔浓度dNTP、0.25微摩尔浓度正向和反向引物、0.24微摩尔浓度Taqman探针、0.2微克/微升BSA、0.2％Tween 20和1微升稀释的PCR产物。使用含有横截面为15微米×25微米的流聚焦液滴制造器的微流体装置在含有2％(w/w)表面活性剂的HFE-7500中产生25微米单分散水滴。通过在出口施加-0.4ps i(1ps i＝6895Pa)真空来驱动流动。将液滴收集在PCR管中并用矿物油覆盖以防止蒸发。使用以下RT-PCR方案：95℃进行10分钟，40个循环：2个循环的94℃进行15秒、64℃进行8分钟，和38个循环的95℃进行15秒、62℃进行1分钟。
第二轮数字PCR后液滴的荧光检测。扩增后，将液滴重新注入微流体读取和分选装置。为了获得均匀间隔的液滴以进行检测，将来自液滴和具有1％表面活性剂的HFE-7500油的流在“T”接口处组合，其中液滴的流速为15微升/小时，油的流速为是180微升/小时。该流流过25微米×25微米的通道，当液滴通过激发激光(488nm)的焦点时，通过显微镜物镜收集它们的荧光并聚焦到来自Hammamatsu的光电倍增管(PMT)上。通过National Instruments的实时现场可编程门阵列卡获取脉冲，并由LabView程序记录，用MATLAB代码进行分析。脉冲高度用作液滴荧光的量度。将由液滴通过激光器的持续时间表示的脉冲宽度用作液滴尺寸的量度。由于Taqman探针的固有荧光，PMT的灵敏度足够高而可以检测不含目标模板的液滴。
样品中突变型细胞的定量。为了定量原始样品中的突变型细胞，将这些细胞混合物样品的荧光检测结果用于建立标准曲线。X轴是细胞混合物中突变型细胞的数目，Y轴是第二轮数字PCR后的亮滴的数量。当定量未知样品中的突变型细胞时，进行第一轮RT-PCR和第二轮PCR以获得亮滴数量，从而获得突变型细胞的相应数量。
抗微生物药在传染病患者中的疗效评价。纯化来自血液的细菌RNA。使用Qiagen blood RNA试剂盒(进行了一定的修改)从具有和不具有抗生素处理的血液中纯化细菌RNA。简言之，添加保护缓冲液以防止在纯化过程中细菌表达谱变化。然后，将红细胞裂解并离心收集细菌和白细胞。为了裂解细菌和白细胞，将蛋白酶K添加至细胞沉淀中并在室温下温育10分钟，然后添加试剂盒中的RLT裂解缓冲液。蛋白酶K的添加也阻止细菌RNA被细胞核糖核酸酶消化。将细胞裂解物加载到Qiagen柱上，使得RNA可结合到硅膜上。在2个洗涤步骤后，将RNA洗脱至DEPC水中，并在-80℃下冷冻。
第一轮数字RT-PCR。将含有1微升OneStep RT-PCR酶的25微升PCR混合物与来自Qiagen的1xOneStep RT-PCR缓冲液、400微摩尔浓度dNTP、各自0.01微摩尔浓度的用于扩增总共48种不同细菌的正向和反向引物、0.24微摩尔浓度Taqman探针、0.2微克/微升BSA、0.2％吐温20和5微升纯化的细菌RNA混合。使用含有横截面为25微米×25微米的流聚焦液滴制造器的微流体装置在含有2％(w/w)表面活性剂的HFE-7500中产生35微米单分散水滴。通过在出口处施加-0.4psi真空来驱动流。将液滴收集在PCR管中并用矿物油覆盖以防止蒸发。使用以下RT-PCR方案：50℃进行20分钟，95℃进行10分钟，40个循环(95℃进行30秒，60℃进行5分钟和72℃进行1分钟)。
定量细菌mRNA的第二轮多重数字PCR。为了获得第二轮数字PCR的模板，将25微升的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(PFO；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加至乳液中，并轻轻离心至分离相。来自第一轮RT-PCR的PCR产物都处于液相中。总共存在属于48种不同细菌的48种不同基因的48种PCR混合物。每个25微升PCR混合物含有与来自Qiagen的1xOneStep RT-PCR缓冲液混合的1微升OneStep RT-PCR酶、400微摩尔浓度dNTP、0.25微摩尔浓度的每种正向和反向引物、0.24微摩尔浓度Taqman探针、0.2微克/微升BSA、0.2％Tween 20和1微升纯化的细菌RNA。为了能够区分每个反应，将两种荧光染料德克萨斯红和Alexa 680的组合以不同浓度添加至每种混合物中作为其独特的条形码。然后使用48平行滴制备器在压力驱动室中同时从所有PCR混合物中产生液滴。参见，例如，公布于2014年11月20日的国际专利申请公开号WO 2014/186440，通过引用整体并入本文。将所得液滴收集在PCR管中并用矿物油覆盖以防止蒸发。使用以下RT-PCR方案：50℃进行20分钟，95℃进行10分钟，40个循环(95℃进行30秒，60℃进行5分钟和72℃进行1分钟)。
第二轮数字PCR后的荧光检测。扩增后，将液滴重新注入微流体读取和分选装置。为了获得均匀间隔的液滴流用于检测，将来自液滴和具有1％表面活性剂的HFE-7500油的流在“T”接口处混合，其中液滴的流速为15微升/小时，油的流速为180微升/小时。该流流过25微米×25微米的通道，并且液滴通过激发激光器(488nm)的焦点。通过显微镜物镜收集每个液滴的荧光，并将其聚焦至来自Hammamatsu的光电倍增管(PMT)上。脉冲由来自National Instruments的实时场可编程门阵列卡获取，并由LabView程序记录，使用MATLAB代码进行分析。从每一滴中检出三种颜色：绿色，Taqman探针信号；红色，得克萨斯红；远红色，Alexa 680，其中红色和远红色对应于某个基因特异性引物对。参见例如表1。
抗微生物药效力的评价。为了评价抗微生物药的效力，检测了有无抗生素治疗的样品的基因特异性mRNA的数量，并比较了这两种样品之间的数量。
表1.用于扩增细菌RNA的引物
实施例4
为了检测稀有的细胞群体，例如百万个细胞中一个细胞，本实施例使用两轮基于液滴的数字PCR进行检测。在第一轮基于液滴的数字PCR之后，使用泊松分布重新包封合并的突变扩增子，以确保<30％的液滴含有模板，对其进行数字PCR，并通过荧光检测来计数亮液滴(图2)。
使用两轮基于液滴的数字PCR，从掺有已知数量的30019细胞系的细胞的PBMC产生标准曲线，所述30019细胞系经工程化而稳定表达突变的PLCG2-M1141R，并相较于无突变的106个细胞或阴性水对照，观察到104个、105个和106个细胞中具有PLCG2突变的1个细胞的可靠检测(图3A)。
以这种方式，患者1的500,000个预处理细胞中有1个被检测到具有突变的PLCG2-M1141R，具有与数学计算类似的数量级(图3B)。总之，这些结果证实了预处理样品在开始靶向抑制BTK之前具有含有抗性亚克隆的能力，尽管在极低的频率上。
如下生成图3A中的数据：
1.将携带野生型PLCG2-M1141R的细胞和携带突变型PLCG2-M1141R的细胞分别以10,000:1、100,000:1和1,000,000:1的比率混合。
2.将细胞混合物用RT-PCR混合物包封至滴液中，并进行RT-PCR。用于RT-PCR的引物是突变特异性引物。包封入液滴中的细胞的数目是每个样品总共3,000,000个，这意味着每个样品中有300个、30个和3个细胞。
3.破碎乳液，例如用表面活性剂。收集扩增子并用PCR混合物将扩增子再乳化成液滴。用于PCR的引物也是突变特异性引物。扩增后，计数液滴。
4.从计数结果计算来自最初添加的细胞的扩增子数。
5.制备标准曲线并用于显示产生的扩增子数(Y轴)与加入的细胞数(X轴)之间存在线性相关性。这可以用于测定从单个突变型细胞产生多少个扩增子。
关于图3B，对于实际样品和CLL预处理，使用步骤1-4。这可用于测定总共产生了多少扩增子。最后，将该总数除以一个突变体细胞可以产生的扩增子的数目，用于测定样品中有多少个突变体细胞。例如，如果3,000,000个细胞中存在6个突变型细胞，则突变型对野生型的比率为1:500,000，图3中显示为数字(0.0002％)，在图3A中显示为标准曲线上的数据点。相反地，PBMC对照不显示突变型扩增子。
虽然本文已经描述和说明了本发明的几个实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想出用于执行功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个有利方面的各种其它手段，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导所用于的一种或多种具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅作为实例来呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的各个特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围。
所有定义，如本文中定义和使用的，应理解为优先于词典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或定义的术语的普通含义。
如在本说明书和权利要求中所用，不定冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”除非明确指出相反，否则应理解为“至少一个/种”。
如在本说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应当理解为是指所连接的元素中的“任一者或两者”，即在某些情况下结合存在以及其它情况下分开存在的元素。通过“和/或”列出的多个元素应以相同的方式来解释，即所连接的“一个或多个”元素。除由“和/或”从句明确指定的元素之外的其它元素，无论与明确指定的元素是否相关，可任选地存在。因此，作为非限制性示例，当结合诸如“包含”的开放式语言使用时，对“A和/或B”的引用可在一个实施例中仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，指A和B(任选地包括其它元素)；等等。
如本说明书和权利要求中所使用，“或”应理解为具有与上述定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”将被解释为包容性的，即，包括许多元素或元素列表中的至少一个，但也可包括不止一个，并且任选地，还可包括另外的未列表的项。只有明确指出相反的项，否则诸如“其中只有一个”或“其中正好一个”，或在权利要求中使用时，“由...组成”，将指许多元素或元素列表中正好一个元素的包信。一般地，如本文中所用，当前置排他性术语诸如“任一”、“其中之一”、“其中只有一个”或“其中正好一个”时，术语“或”应当仅被解释为指示排他性供选方案(即“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由...组成”具有在专利法领域中使用的普通含义。
如本说明书和权利要求书中所用，短语“至少一个”对于一个或多个元素的列表应当被理解为意指从元素列表中的任一个或多个元素选择的至少一个元素，但不一定包括在元素列表中具体列出的每个和每一个元素中的至少一个元素，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体指定的元素以外的元素可任选地存在，而无论与明确指定的那些元素是否相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个，任选地包括不止一个A，但不存在B(和任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个B，但不存在A(和任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个A，任选地包括不止一个B(和任选地包括其它元素)；等等
当单词“约”在本文中用于指数量时，应当理解，本发明的另外实施方案包括不被“约”这个词的存在修饰的那个数字。
还应当理解，除非明确地指出相反，否则在本文所要求保护的包括不止一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于其中引述该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语如“包含”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“包括”等应理解为是开放式的，即意味着包括但不限于此。只有“由...组成”和“基本上由...组成”的过渡性短语分别是“美国专利局专利审查程序手册”第2111.03节中规定的封闭或半封闭的过渡词。
序列表
<110> President and Fellows of Harvard College
<120> 使用扩增测定细胞
<130> H0498.70540WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> 2016-03-11
<150> US 62/133,140
<151> 2015-03-13
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
gggtaagtgg catgagcaag aaagaacc 28
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
tttctgcgct ttgtggttta tgaa 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
acacaggaga aggtgacatt tgaa 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
gcctctgttc gtctcgacat c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
accacgtttt cgccctcttt 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
caccgcgccg atacg 15
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
gacgcgtttt aataactggg atgag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
gcagaagcgt aacaggtcat taaag 25
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
ctggagcgcg acttaa 16
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
gcactgccca ctttgaatat gtc 23
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
gctgtcctgg gcaacatg 18
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
ccaggccgtt gcttg 15
