用于选择具有增强活性的酶的方法
相关申请的交叉引用
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序列表的引用
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技术领域
本发明属于蛋白质工程设计和选择的技术领域。更具体地，本发明涉及借助于定向进化的酶增强。
背景技术
使用人造区室来连接基因型和表型的体外进化是一种强大的系统，该系统允许大范围的具有不同活性的分子的进化(参见，例如，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]，1998,16(7):652-656)。基于体外区室化(IVC)的选择最初是基于将DNA模板直接连接到目标底物(WO 1999/002671 A1)。在表达的活性酶的存在下将基因连接的底物转化成产物，并且对与该基因保持连接的所得产物进行阳性选择。
Blazej等人披露了另一种形式的基于IVC的自体选择，在该自体选择中DNA被直接连接到能够被表达的活性酶降解的固相底物。底物降解导致活性基因被自体释放到溶液中，然后通过阴性选择从无活性的基因中分离(WO 2009/124296 A2)。
然而，仍然需要使用类似于其天然形式的底物来针对催化活性选择基因文库的改进方法。本发明满足了该需求。
发明内容
在此描述的是用于改进酶活性的系统及其组分。因此，在一个方面中，是选择具有酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：
(a)编码多肽的多核苷酸；
(b)与所述多核苷酸连接的固相；
(c)与所述固相连接的酶底物；以及
(d)连接到所述底物的选择性标记；
其中该水相包括用于表达该多肽的组分；
(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；
(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，
其中在水性液滴中具有针对底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且
(iv)分离合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中选择性标记已被释放的合成化合物。
在另一个方面中，是合成化合物，该合成化合物包括：(a)编码多肽的多核苷酸；(b)与所述多核苷酸连接的固相；(c)与所述固相连接的酶底物；以及(d)连接到所述底物的选择性标记；
在另一个方面中，是制备该合成化合物的方法，该方法包括：(i)将该固相与编码多肽的多核苷酸连接；(ii)将该酶底物与该固相连接；(iii)将该选择性标记与该底物连接；并且(iv)回收该合成化合物。
在另一个方面中，是包含复数个合成化合物的多核苷酸文库。
在另一个方面中，是包含该多核苷酸文库的油包水乳剂，其中该文库的合成化合物在乳剂的水性液滴中被区室化。
在另一个方面中，是制备该乳剂的方法，该方法包括：(i)将该复数个合成化合物悬浮在该水相中，并且(ii)将(i)的悬浮液与油混合。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个方面的酶选择涉及的方法步骤的示例性图示。
图2示出了如实例2所述连接到脂质酶底物的金颗粒的示例性图示。
图3示出了如实例3所述的具有或不具有疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(TLL)的生物素化甘油三酸酯金纳米颗粒的差别捕获。用0、5％、10％和20％的LSS1b和分散剂来制备金纳米颗粒。将纳米颗粒用TLL消化(+TLL，黑色)或不进行消化(-TLL，白色)。反应在乳剂(emul.)或游离溶液(F/S)中进行。
图4示出了如实例4所述，洗涤后保留在纳米颗粒上的每个金纳米颗粒(AuNP)的寡核苷酸分子数(DNA)的数目的图。与未修饰的寡核苷酸(SR2)相比，某些偶联条件导致二硫醇修饰的寡核苷酸(SR1)的量增加，表明DNA与纳米颗粒的特异性轭合。
定义
氨基酸：除非另外特别指明，否则术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然存在的L-氨基酸或残基。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”还包括D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸(例如氨基酸类似物)、通常不被掺入蛋白质中的天然存在的氨基酸、和具有氨基酸的特有特性的化学合成的化合物(共同地，“非典型”氨基酸)。例如，允许与天然Phe或Pro相同的肽化合物构象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物被包括在“氨基酸”的定义内。
编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。
控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括从编码序列产生多肽的过程，并且可以包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。如在此使用的表达包括体外转录/翻译。
表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对包括在此描述的多核苷酸(例如，编码多肽或多肽变体的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。
接头：如在此使用的术语“接头”或“连接”是指将一种参考化合物与另一种参考化合物的化学附接。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子包括一个或多个控制序列。该构建体可以从天然存在的基因中分离、或能以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段、或可以是合成的。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。
亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本多肽”意指一种多肽，对该多肽进行改变以产生酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
多核苷酸：术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的核苷酸的方式发挥作用的天然核苷酸的已知类似物。术语“多核苷酸”是指任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其是信使RNA(mRNA)的DNA表示，通常通过mRNA的反转录或扩增获得；合成地或通过扩增产生的DNA分子；以及mRNA。术语“多核苷酸”涵盖双链核酸分子以及单链分子。在双链多核苷酸中，多核苷酸链无需是共延伸的(即，双链多核苷酸无需沿着两条链的整个长度是双链的)。如果多核苷酸在结构(例如核苷酸序列)上不同，就说它们是“不同的”。
多肽：术语“多肽”是指氨基酸聚合物，并且在此不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋白质。多肽也可以是多肽的天然存在的等位基因或工程化的变体。
底物：如在此使用的，术语“底物”或“酶底物”通常是指酶的底物；即酶对其起作用以产生反应产物的材料。如在此使用的，该底物能够在活性酶的存在下释放连接的选择性标记。
固相：如在此使用的，“固相”是指在本发明的选择方法中使用时为固体的任何材料。
合成化合物：如在此使用的，术语“合成化合物”是指不是天然存在的化合物。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个氨基酸。
野生型：术语“野生型”意指由天然存在的微生物(例如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的酶。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的方面包括“由……方面组成”和/或“基本由……方面组成”。
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。
具体实施方式
在此尤其描述的是用于改进酶活性的方法及其使用的组分。为了快速和高通量的酶进化，本发明采用体外区室化(IVC)。IVC不依赖于如在展示技术中所实施的基因型和表型之间的物理连接，而是通过在油包水乳剂的单个水性液滴中的空间限制来连接基因型和表型(参见，例如Tawfik,D.S等人，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]，1998,16(7):652-656；US 6489103；WO 1999/002671；WO 2009/124296)。
然而，现有的IVC筛选系统要求底物必须与DNA直接连接。通过用大的阴离子大分子(对于1,000bp的DNA约660kDa)进行修饰，所得的底物可能被显著改变并损害选择相关性。
如在此描述，本申请人已经开发了改进的IVC选择系统，其中底物和基因被附接到固相、而不是彼此直接连接。该底物还包括能够进行鉴定和分离的选择性标记(例如生物素、叠氮化物部分、炔烃、被保护的马来酰亚胺等)。在基因表达后，然后那些具有酶活性的多肽从底物切割下标记，允许鉴定和分离切割的(活性的)和未切割的(较少活性或无活性的)基因。因为底物不直接附接到聚阴离子DNA，它们更好地接近天然形式并且可能导致更多的商业相关的酶变体的分离。
如图1所例示，选择方法(300)可以采用编码多肽的多核苷酸(303)的集合，例如包括多核苷酸的合成化合物的文库(302)。将文库的多核苷酸(303)连接(304)到固相(305)，并且典型地是编码酶的变体的突变体，该酶针对连接到固相(305)的底物(306)具有脂肪酶活性。编码变体的文库(302)的多核苷酸突变体(303)可以使用包括诱变PCR和DNA文库合成在内的各种技术(如下面更详细地列出)来产生。使用修饰的PCR引物的PCR扩增提供了一种将多核苷酸突变体(303)与固相(305)连接(304)的手段。将底物(306)进一步连接到选择性标记(307)，该选择性标记(307)提供了选择性地去除那些在该过程结束时尚未释放标记的合成化合物的手段。可以使用各种油-表面活性剂(314)和水来乳化(308)多核苷酸文库(302)，以产生包含水性液滴(312)(区室化区)的乳剂(310)，每个具有区室化的合成化合物。将乳剂孵育以使多核苷酸突变体(303)表达(315)为相应的多肽(316)。
然后，针对底物(306)表现出活性的表达的多肽变体(316)从底物(318)释放选择性标记(307)。具有增强活性的酶变体比表现出较低活性的变体概率上更可能释放底物结合的标记(307)。可变孵育温度和时间，以及抑制剂和竞争性底物的使用，使得测定变得严格。孵育后，打破(319)该乳剂(310)。然后使用在此描述的技术(例如，使用亲和捕获)将具有包含选择性标记的底物的合成化合物与其中选择性标记已被释放(324)的合成化合物分离。可以对编码针对底物具有增强的酶活性的多肽变体的多核苷酸突变体进行另外多轮(326)选择以进一步增强酶活性。
因此，在一个方面中，是选择具有酶活性(例如增强的酶活性)的多肽的方法，该方法包括：
(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：
(a)编码多肽的多核苷酸；
(b)与所述多核苷酸连接的固相；
(c)与所述固相连接的酶底物；以及
(d)连接到所述底物的选择性标记；
其中该水相包括用于表达该多肽的组分；
(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；
(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，
其中在水性液滴中具有针对底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且
(iv)分离合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中选择性标记已被释放的合成化合物。
合成化合物
在一个方面中，在此使用的合成化合物包括(a)编码多肽的多核苷酸，(b)与该多核苷酸连接的固相，(c)与该固相连接的酶底物，以及(d)与该底物连接的选择性标记。
在一些实施例中，合成化合物包括一个或多个(例如，两个、三个)拷贝的多核苷酸(具有相同或不同序列)。在一些实施例中，合成化合物包括两个多核苷酸(例如，具有相同或不同序列)。在一些实施例中，合成化合物仅包括一个多核苷酸的一个拷贝。
多核苷酸/多肽
多核苷酸可以包含多肽的编码序列，该多肽是或衍生自具有所希望的酶活性的多肽，该酶活性例如但不限于来自水解酶类(EC 3)或裂解酶类(EC4)的酶活性。
具有酶活性的多肽的非限制性实例包括：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、天冬酰胺酶、甘露聚糖酶、碳水化物酶、羧肽酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半纤维素酶、转化酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、果胶酶、植酸酶、聚酯酶、蛋白酶、核糖核酸酶和木聚糖酶。
在一个实施例中，多核苷酸编码淀粉酶或甘露聚糖酶，具体地淀粉酶的变体(作为可商购的)或甘露聚糖酶的变体(作为可商购的)(和两者都可商购自丹麦诺维信公司(Novozymes A/S))。在另一个实施例中，多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶。在另一个实施例中，多核苷酸编码麦芽淀粉酶。在另一个实施例中，多核苷酸编码支链淀粉酶。
多核苷酸可以包括合适的控制序列，例如基因产物的有效表达所需的那些，例如启动子、增强子、翻译起始序列、多腺苷酸化序列、剪接位点等，如下面详细描述的。
如上文所述，本发明的方法可以包括复数个合成化合物以产生多核苷酸文库(例如，编码酶变体文库的多核苷酸文库)。在具体实施例中，这些文库具有至少约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1014种不同的合成化合物和/或多核苷酸。通常，该文库的尺寸将少于约1015。
可以按本领域的技术人员所熟知的各种不同方式中的任何方式创建多核苷酸文库。具体而言，天然存在的多核苷酸池可以从基因组DNA或cDNA克隆(Sambrook等人，1989)；例如，已经证明通过来自免疫或未免疫的供体的抗体基因的PCR扩增谱系制备的噬菌体抗体文库是功能性抗体片段的非常有效的来源(Winter等人，1994；Hoogenboom，1997)。还可以通过随机或掺杂的寡核苷酸合成来编码基因的全部(参见例如，Smith，1985；Parmley和Smith，1988)或部分(参见例如，Lowman等人，1991)或池(参见例如，Nissim等人，1994)制备基因的文库。
还可以通过各种体内技术向多核苷酸或多核苷酸池中随机引入突变来制备文库，这些体内技术包括：使用细菌的增变菌株，例如大肠杆菌mutD5(Liao等人，1986；Yamagishi等人，1990；Low等人，1996)；使用B-淋巴细胞的抗体超变系统(Yelamos等人，1995)。还可以通过化学诱变剂和离子化或UV照射(参见，Friedberg等人，1995)或掺入诱变的碱基类似物(Freese，1959；Zaccolo等人，1996)体内和体外引入随机突变。还可以例如通过使用易错聚合酶在聚合过程中在体外向基因中引入随机突变(Leung等人，1989)。可以通过使用同源重组在体内(参见Kowalczykowski等人，1994)或在体外(Stemmer，1994a；Stemmer，1994b)引入另外的多样化。还可以从序列数据库或计算预测的序列化学合成全部或部分基因的文库。
还可以使用DNA重组(像例如DNA改组)来制备文库。在两个或更多个同源输入多核苷酸(起始点多核苷酸)之间的改组涉及将多核苷酸片段化并重组这些片段，以获得输出多核苷酸(即已经经受改组循环的多核苷酸)，其中相比于输入多核苷酸，许多核苷酸片段被交换。DNA重组或改组可以是(部分)随机过程，在该过程中从两个或更多个起始基因产生嵌合基因文库。可以使用许多已知的格式来执行这种改组或重组过程。该过程可以涉及亲本DNA的随机片段化，然后通过peR重新装配成新的全长基因，例如，如在US 5,605,793；US 5,811,238；US 5,830,721；US 6,117,679中所述的。可以执行基因的体外重组，例如如在US 6159687、WO 98/41623、US 6159688、US 5965408、US 6153510中所描述的。重组过程可以在活细胞体内发生，例如，如在WO 97/07205和WO 98/28416中所描述的。可以通过DNA酶I处理或通过限制性内切核酸酶消化使亲本DNA片段化，如Kikuchi等人(2000a，Gene[基因]236：159-167)所描述的。可以通过改组两个亲本的单链亲本DNA来完成两个亲本的改组，如Kikuchi等人(2000b，Gene[基因]243：133-137)所描述的。具体的改组方法是遵循在Crameri等人，1998，Nature[自然]，391：288-291和Ness等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]17：893-896中描述的方法。另一种格式是描述于US 6159687：实例1和2中的方法。
固相
与在此描述的合成化合物一起使用的固相可以是本领域已知的任何合适的固相。例如，可用作固相的材料可以包括：天然聚合的碳水化合物及其合成修饰的、交联的或经取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联藻酸、几丁质、经取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯(特别是与硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合的纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白质及衍生物，包括交联的或修饰的明胶，以及角蛋白；天然碳氢化合物聚合物，例如乳胶和橡胶；合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物(例如聚酯、聚酰胺以及其他聚合物例如聚氨酯或聚环氧化物)；多孔无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；以及铝或硅氧化物或水合物，例如粘土、矾土、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可以与上述聚合物材料一起用作过滤器)；以及上述各类的混合物或共聚物，例如通过在预先存在的天然聚合物上起始合成聚合物的聚合而获得的枝接共聚物。
固相通常具有允许其在水性介质中悬浮、然后形成油包水乳剂的尺寸和形状。合适的固相包括微珠或颗粒(为便于讨论，均称为“微粒”)。本领域技术人员可以从任何合适类型的颗粒材料中选择可用于本发明的微粒，并且这些微粒包括但不限于由以下各项构成的那些：纤维素、琼脂糖(Sepharose)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、乳胶、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯、或类似材料。在一些实施例中，该固相是疏水性微珠(例如用C4、C8和C18烷基基团、聚苯乙烯或PS-二乙烯基苯涂覆的二氧化硅珠)。
优选的微粒包括直径平均在约0.01至约35微米之间、更优选直径在约0.5至20微米之间的微粒、半抗原化的微粒(haptenated microparticles)、由一种或优选至少两种荧光染料浸渍的微粒(特别是在流动吸收池中单独分离并通过激光激发后可以鉴定的那些)、铁磁流体(即尺寸小于约0.1微米的磁性颗粒)、磁性微球(例如，尺寸约3微米的超顺磁性颗粒)、以及可通过沉降和/或过滤收集或去除的其他微粒。
在一些实施例中，该固相是纳米颗粒，例如金纳米颗粒。还考虑了固体脂质纳米颗粒，例如，如Ekambaram等人(Sci.Revs.Chem.Commun.[化学通讯科学评论]2012 2(1),80-102)所描述的。纳米颗粒的平均直径通常为约1至400nm(例如，1至100nm)之间，并且纳米颗粒包括例如球形胶体金、金纳米棒和海胆形纳米颗粒。
通过本领域技术人员已知的不干扰表达的任何手段将固相与多核苷酸化合物连接。将固相与多核苷酸连接的实例可以在WO 2009/124296(其内容通过引用特此结合)中找到。可以采用标准的合成技术，例如使用反应性手柄(reactive handle)(例如活化的酯、叠氮化物、马来酰亚胺等)偶联固相和多核苷酸。在一个实例中，将固相与连接到马来酰亚胺的寡核苷酸引物偶联。然后用模板多核苷酸序列通过PCR对所得的轭合的寡核苷酸进行扩增以产生所希望的合成化合物。在另一个实例中，在PCR扩增之前，将5'-硫醇引物偶联至用马来酰亚胺部分修饰的固相，以提供所希望的合成化合物。类似地，在固相或多核苷酸上的氨基基团可以与另一个配偶体的活化酯(例如和NHS-酯)连接以产生所希望的合成化合物。甚至仍进一步，轭合可以采用点击化学，例如，其中叠氮化物修饰的固相被轭合至寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物具有(i)用于铜(I)催化的[3+2]叠氮-炔环加成反应(CuAAC)的末端炔或(ii)环辛炔衍生物，例如二苯并环辛基(DBCO)，用于无Cu点击环加成(Jewett等人，Chem.Soc.Rev.[化学学会评论]2010 39(4):1272)。因此，在一些实施例中，该编码多肽的多核苷酸与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰胺基)或三唑部分的固相连接。
底物和选择性标记
与在此描述的合成化合物一起使用的酶底物可以是由本领域技术人员基于这些方法的所希望的酶活性而确定的任何合适的底物。例如，该底物可以是上文所述的具有酶活性的多肽的任何底物，包括但不限于：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、天冬酰胺酶、甘露聚糖酶、碳水化物酶、羧肽酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半纤维素酶、转化酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、果胶酶、植酸酶、聚酯酶、蛋白酶、核糖核酸酶和木聚糖酶的合适的底物。
选择性标记可以是能够通过活性酶从底物释放以区分那些已被活性酶改变的化合物的任何合适的标记。如在此使用的，选择性标记是能够通过针对底物具有活性的多肽(例如通过酶水解)从合成化合物中释放并且可以在生化测定中检测到的化学部分。
合适的选择性标记包括但不限于亲和标签，其中每个亲和标签是结合对的成员。当用于在此描述的方法时，由于具有亲和标记物的化合物通过亲和捕获被选择性地去除，包含亲和标签的合成化合物可以进一步有助于在步骤(iv)中从缺乏标签的化合物中分离。
可以用于本发明的结合对的实例包括抗原和能够结合该抗原的抗体或其片段、生物素亲和素/链霉亲和素(Savage等人，1994)、钙依赖性结合多肽及其配体(例如钙调蛋白和钙调蛋白结合肽(Stofko等人，1992；Montigiani等人，1996))、装配以形成亮氨酸拉链的多肽对(Tripet等人，1996)、组氨酸(典型地为六组氨酸肽)和螯合的Cu2+、Zn2+和Ni2+(例如Ni-NTA；Hochuli等人，1987)、RNA结合蛋白和DNA结合蛋白(Klug，1995)(包括含有锌指基序的那些(Klug和Schwabe，1995)和DNA甲基转移酶(Anderson，1993)以及其核酸结合位点。例如，合适的亲和标签尤其包括生物素、地高辛、二硝基苯基(DNP)、荧光素、罗丹明(例如Texas )和海藻糖。生物素和海藻糖能够分别结合亲和素和凝集素，然而地高辛、DNP、荧光素和罗丹明能够结合产物特异性抗体。在一个实施例中，合成化合物包括生物素选择性标记。在该实施例中，步骤(iv)的包含选择性标记的一个或多个合成化合物可以用链霉亲和素(例如链霉亲和素涂覆的微球)分离。
可以使用各种可用的轭合技术(例如上文所述和/或本领域已知的那些)以及优选不干扰酶在底物上的活性的轭合技术进行酶底物和选择性标记的轭合。
例如，为了将底物连接到固相，可以将胺修饰的酶底物与甲苯磺酰基或甲酸酯修饰的微球偶联。同样，氨基修饰的微球可以与甲苯磺酰基或甲酸酯修饰的酶底物(或经由戊二醛与氨基修饰的底物化合物)偶联。也可以使用羟基、酰肼或氯甲基修饰的微球，如本领域已知的。用于将酶底物连接到金纳米颗粒的示例性合成方法可以在下面找到(参见实例2)。在一些实施例中，将底物与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰胺基)或三唑部分的固相连接。
另外，为了将底物连接到选择性标记，与淀粉酶或淀粉葡聚糖酶相关的方法可以经由还原氨化使用与氨基-叠氮化物(例如，或被保护的硫醇等，代替叠氮化物)的还原性末端轭合的淀粉底物(例如麦芽七糖)。然后通过酶催化添加定制的葡萄糖1-磷酸酯、X-胺(通过磷酸化酶)或UDP-GlcNac(通过糖原合成酶)来修饰活化的接头。这将伯胺添加到非还原性末端，然后用作手柄(handle)用于附接选择性标记(例如生物素)。例如，可以经由点击化学(参见上文)将还原性末端偶联到固相。
在另一个实例中，与蛋白酶相关的方法可以使用可以与预活化的固相珠粒(例如，环氧化物或甲苯磺酰基活化的磁性聚苯乙烯珠粒，例如Dynal M270或M280)轭合的整个蛋白质底物，然后(例如，使用NHS-PEG3-N3或SATA)重新激活具有反应性手柄(例如叠氮化物或硫醇)的蛋白质，可以使用上述方法将选择性标记轭合到该蛋白质上。
在一些实施例中，选择性标记与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的底物连接。
还考虑了制备在此描述的合成化合物的方法，该方法包括：(i)将固相与编码多肽的多核苷酸连接；(ii)将该酶底物与该固相连接；(iii)将该选择性标记与该底物连接；并且(iv)回收该合成化合物。
包含用于多肽表达的试剂的水相的形成
合成化合物在水相中与用于表达多肽(例如，体外转录/翻译)的组分组合。可以根据特定系统的要求从以下各项选择此类组分：合适的缓冲液、体外转录/复制系统和/或体外翻译系统(包含所有必需成分、酶和辅因子)、RNA聚合酶、核苷酸、转运RNA、核糖体和氨基酸(天然的或合成的)。
合适的缓冲液典型地允许生物系统的希望的组分是有活性的，因此将取决于每个特定反应系统的要求。适用于生物和/或化学反应的缓冲液在本领域和各种实验室文本(例如Sambrook等人，1989)中提供的配方中是已知的。
示例性体外翻译系统可以包括细胞提取物，这些细胞提取物典型地来自细菌(Zubay，1973；Zubay，1980；Lesley等人，1991；Lesley，1995)、兔网织红细胞(rabbit reticulocyte)(Pelham和Jackson，1976)或小麦胚芽(Anderson等人，1983)。许多合适的系统可商购(例如来自普洛麦格公司(Promega))，包括一些允许偶联转录/翻译的系统(来自普洛麦格公司(Promega)的所有细菌系统和网织红细胞和小麦胚芽TNT.TM.提取系统)。如果需要，所使用的氨基酸的混合物可以包括合成氨基酸，以增加文库中产生的蛋白质的可能的数量或种类。这可以通过使tRNA负载人工氨基酸和将这些tRNA用于待选择的蛋白质的体外翻译来实现(Ellman等人，1991；Benner，1994；Mendel等人，1995)。
乳剂的形成
可以从任何合适的不混溶液体的组合产生乳剂，以使得合适的平台能够将在此描述的合成化合物区室化。在一些实施例中，该乳剂适合于表达多肽(例如在水性液滴中)，并且那些具有酶活性的表达的多肽能够在该液滴中从一个或多个合成化合物中释放该选择性标记。
优选地，本发明的乳剂具有水相(上文所述的含生物化学组分)和疏水的不混溶液体(油)，其中水相为以细分液滴形式存在的相(分散相、内相或不连续相)，疏水的不混溶液体为这些液滴悬浮在其中的基质(非分散相、连续相或外相)。此类乳剂被称为油包水(W/O)。
可以通过添加一种或多种表面活性剂(surface-active agent或surfactant)来稳定乳剂。这些表面活性剂被称为乳化剂，并在水/油界面处起作用以防止(或至少延迟)相分离。许多油和许多乳化剂可以用于产生油包水乳剂；最近汇编列出了超过16,000种表面活性剂，其中许多用作乳化剂(Ash和Ash，1993)。合适的油包括浅白色矿物油和非离子表面活性剂(Schick，1966)，例如脱水山梨糖醇单油酸酯(Span.TM.80；ICI)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(TweenTM80；ICI)。
使用阴离子表面活性剂也可能是有益的。合适的表面活性剂包括胆酸钠和牛磺胆酸钠。特别优选的是脱氧胆酸钠，优选浓度为0.5％w/v或更低。在一些情况下，此类表面活性剂的纳入可以增加多核苷酸的表达、和/或酶/酶变体的活性。向非乳化的反应混合物中添加一些阴离子表面活性剂完全废止翻译。然而，在乳化期间，该表面活性剂可以从水相转移到界面中并使活性恢复。在待乳化的混合物中添加阴离子表面活性剂确保反应仅在区室化后进行。
乳剂的产生通常需要施加机械能来强迫相并在一起。有各种利用各种机械装置进行这点的方法，这些机械装置包括搅拌器(如磁力搅拌棒、螺旋桨和涡轮搅拌器、桨装置和搅打器(whisk))、匀浆器(包括转子-定子匀浆器、高压阀匀浆器和喷射匀浆器)、胶体磨、超声波和“膜乳化”装置(Becher，1957；Dickinson，1994)。因此，在一个方面中，是制备在此描述的乳剂的方法，该方法包括：(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，并且(ii)将(i)的悬浮液与油混合。
在油包水乳剂中形成的水性液滴通常是稳定的，而在液滴之间几乎不交换多核苷酸或酶/酶变体。该技术存在以产生多达数千升工业规模体积的乳剂(Becher，1957；Sherman，1968；Lissant，1974；Lissant，1984)。
优选的液滴尺寸将取决于根据本发明进行的任何单独选择过程的精确要求而变化。在所有情况下，在多核苷酸文库尺寸、所需的富集和单个液滴中所需的组分浓度之间将达到最佳平衡，以实现酶/酶变体的有效表达和反应性。
表达过程优选在本发明提供的各个液滴内发生。体外转录和偶联转录/翻译两者在次纳摩尔DNA浓度下变得不太有效。由于仅需要在每个液滴中存在有限数量的DNA分子，因此这为可能的液滴尺寸设定了实际的上限。在一些实施例中，液滴的平均体积为约1阿升(altoliter)与约1纳升之间，包含(例如，约10阿升与约50飞升(femtoliter)之间、或约0.5飞升与约10飞升之间)。水性液滴的平均直径典型地在约0.05μm与约100μm范围内，包含。在一些实施例中，乳剂中的水性液滴具有约0.1μm与约50μm之间、约0.2μm与约25μm之间、约0.5μm与约10μm之间、约1μm与约5μm之间、约2μm与约4μm之间、或约3μm与约4μm之间(包含)的平均直径。在某些实施例中，液滴的平均体积为小于5.2x 10-16m3(对应于直径小于10μm的球形液滴)、小于6.5x 10-17m3(对应于直径小于5μm的球形液滴)、小于或约4.2x 10-18m3(2μm)、或小于或约9x 10-18m3(2.6μm)。
液滴中的有效多核苷酸浓度可以通过本领域的熟练技术人员熟知的各种方法人为增加。这些包括例如，增加体积，排除化学品(例如聚乙二醇(PEG))，以及各种基因扩增技术，这些基因扩增技术包括使用RNA聚合酶的转录，该RNA聚合酶包括来自细菌(例如大肠杆菌)(Roberts，1969；Blattner和Dahlberg，1972；Roberts等人，1975；Rosenberg等人，1975)、真核生物例如(Weil等人，1979；Manley等人，1983)和噬菌体(例如T7、T3和SP6)(Melton等人，1984)的那些；聚合酶链反应(peR)(Saiki等人，1988)；Q-β复制酶扩增(Miele等人，1983；Cahill等人，1991；Chetverin和Spirin，1995；Katanaev等人，1995)；连接酶链反应(LCR)(Landegren等人，1988；Barany，1991)；自体维持序列复制系统(Fahy等人，1991)和链置换扩增(Walker等人，1992)。如果乳剂和体外转录或偶联的转录/翻译系统是热稳定的(例如，该偶联的转录/翻译系统可以由热稳定的生物体例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)制成)，甚至可以使用需要热循环的基因扩增技术，例如PCR和LCR。
增加有效的局部核酸浓度能够有效地使用更大的液滴。这允许大多数应用的液滴体积的优选实际上限为约2.2x 10-14m3(对应于直径35μm的球形)。
除了合成化合物之外，液滴尺寸应足够大以容纳需要在液滴内发生的生物化学反应的所有必需组分。在体外，转录反应和偶联的转录/翻译反应典型地采用约2mM的总核苷酸浓度。例如，为了将基因转录成长度为500个碱基的单个短RNA分子，这将需要最少500个分子的核苷酸/液滴(8.33×10-22摩尔)。为了构成2mM溶液，该数量的分子必须包括在体积为4.17x 10-19升的液滴中(4.17x 10-22m3，如果是球形的，其具有93nm的直径)。
此外，要发生的翻译所必需的核糖体本身直径约为20nm。因此，在一些实施例中，液滴的下限为约0.1μm(100nm)的直径。
乳剂液滴的尺寸可以简单地随着根据选择系统的要求来定制的用于形成乳剂的乳剂条件而变化。液滴尺寸越大，乳化给定多核苷酸文库所需的体积越大，因为最终的限制因素是液滴的尺寸并且因此是每单位体积可能的液滴数量。在一些实施例中，乳剂包括至少约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1015个液滴/mL乳剂。
取决于要筛选的文库的复杂度和尺寸，可能有益的是，形成乳剂这样使得通常在乳剂的每个液滴中包括1或少于1个合成化合物。每个液滴的合成化合物的数量由泊松分布决定。因此，如果调整条件使得平均有0.1个合成化合物/液滴，则实际上约90％的液滴将不含合成化合物、9％的液滴将包含1个合成化合物、1％的液滴将包含2个或更多个合成化合物。实际上，平均值为约0.1至约0.5、更优选约0.3个合成化合物/液滴向包含足够高百分比的具有1个合成化合物/液滴的液滴的乳剂提供具有足够低百分比的具有2个或更多个合成化合物/液滴的液滴。这种方法通常会提供最强的分辨率。但是，在文库较大和/或较复杂的情况下，这可能不太实际；可能优选的是包括若干个合成化合物一起，并且依赖于重复应用本发明的方法来实现所希望的活性的分类。在一些实施例中，油包水乳剂中不超过70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％的水性液滴包括多于一个合成化合物。
理论研究表明，产生的多核苷酸突变体的数量越多，将产生具有所希望的性质的相应的编码的多肽的可能性越大(关于这如何应用于抗体谱系的描述，参见例如，Perelson和Oster，1979)。最近也已经实际确认，较大的噬菌体-抗体谱系确实比较小的谱系产生更多的具有更好的结合亲和力的抗体(Griffiths等人，1994)。为了确保产生罕见的变体并且因此能够被选择，通常大的文库尺寸是令人希望的。
使用本发明的系统，在水性液滴直径为2.6μm时，可以使用20ml的乳剂中的1ml水相来容易地分选至少1011的谱系尺寸。
表达、分离和进一步处理
在适合于表达多肽的条件下将乳剂保持足够的时间。具有酶活性的表达的多肽可以(例如通过酶水解)从该液滴中的合成化合物(和相应的基因)中释放选择性标记。通过使用在此描述的教导使表达条件减弱，具有增强的酶活性的那些多肽的基因编码序列可以不同于具有较少活性的那些多肽的基因编码序列。
在一些实施例中，通过在约25℃至约60℃(例如约25℃至约50℃、约30℃至约40℃)孵育乳剂约1小时至约24小时(例如约1小时至约12小时、约1小时至约5小时、或约1小时至约2小时)来发生表达。
在一些实施例中，通过任何合适的技术(例如像化学诱导的聚结和/或离心)(例如，在步骤(iv)之前)将水相与油相分离。
可以使用许多常规技术中的任何一种将包含选择性标记的合成化合物从不具有选择性标记的化合物中分离出来。例如，如上文所述，合适的抗体、凝集素或链霉亲和素可以与标记结合并通过亲和捕获去除包含标记的化合物。在一些实施例中，包含选择性标记的和/或那些缺乏选择性标记的回收的合成化合物导致这些化合物是基本上纯的。关于其中选择性标记已经被释放的合成化合物(缺乏选择性标记)，“基本上纯的”意指包含不超过15％的杂质的合成化合物的回收制剂，其中杂质意指包含选择性标记的合成化合物。关于包含选择性标记的合成化合物，“基本上纯的”意指包含不超过15％的杂质的合成化合物的回收制剂，其中杂质意指缺乏选择性标记的合成化合物。在一些变体中，基本上纯的合成化合物可以包含不超过10％杂质、或不超过5％杂质、或不超过3％杂质、或不超过1％杂质、或不超过0.5％杂质。
可以进一步分析分离的合成化合物(包含和/或缺乏选择性标记)的集合。例如，在每一轮选择之后，可以例如通过本领域已知的非区室化的测序反应来分析编码感兴趣的多肽的多核苷酸池的富集。在一个实施例中，该方法进一步包括(例如，经由测序)分析步骤(iv)的一个或多个分离的合成化合物(例如一个或多个包含选择性标记的合成化合物和/或一个或多个缺乏选择性标记的化合物)的多核苷酸序列。
可以使用本领域已知的技术，将所选择的池扩增和/或克隆到用于繁殖和/或表达的合适的表达载体中，如下所述。在一个实施例中，该方法进一步包括扩增步骤(iv)中的包含选择性标记的合成化合物的一个或多个多核苷酸。在另一个实施例中，该方法进一步包括扩增步骤(iv)中的缺乏选择性标记的合成化合物的一个或多个多核苷酸。
分离的合成化合物的多核苷酸还能以迭代重复的步骤进行后续的、可能更严格的多轮分选，重新应用本发明的方法的全部或仅选择的步骤。通过适当定制条件，可以在每轮选择后产生编码具有更优化的活性的酶的合成化合物。因此，在一些实施例中，重复该方法，其中分离的合成化合物的多核苷酸(例如，来自合成化合物的扩增的多核苷酸)用于如步骤(i)所述的新的复数个合成化合物中，并且对所述新的复数个合成化合物重复步骤(i)-(iv)。如果需要，例如，可以使用例如易错聚合酶链反应(PCR)和/或如上文所述的其他技术，在重复该方法之前，在多核苷酸中引入另外的的遗传变异。因此，在一个实施例中，该方法进一步包括(例如经由诱变)向步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸引入改变。
核酸构建体和表达载体
在一些实施例中，在此描述的方法进一步包括将来自步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸克隆到核酸构建体或表达载体中。RNA和/或重组蛋白可以从单独的克隆中产生，用于进一步纯化和测定(如下所述)。使用本发明的方法选择的重组体可以用于采用天然酶的任何应用。因此，在一些实施例中，这些方法进一步包括表达步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸(例如，表达合成化合物的多核苷酸，其中选择性标记已被释放，从而产生具有酶活性的多肽)。
这些核酸构建体包括一种编码在此描述的多肽或变体、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导该编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)，天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白]”，Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94；以及在上文的Sambrook等人，1989中。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇3-羟基丙酸脱氢酶/甘油醛-3磷酸3-羟基丙酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下各项的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选终止子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3磷酸3-羟基丙酸脱氢酶。上文的Romanos等人，1992描述了酵母宿主细胞其他有用的终止子。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例获得自以下各项：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列也可以是前导子，该前导子是对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子获得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。
酵母宿主细胞的合适的前导子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、以及酿酒酵母醇3-羟基丙酸脱氢酶/甘油醛-3磷酸3-羟基丙酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加到转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列获得自以下各项的基因中：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物学评论]57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。上文的罗马诺斯等人，1992描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加调节序列，该调节序列相对于宿主细胞的生长调节该变体的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
重组表达载体包括编码在此描述的多肽或变体的多核苷酸，启动子、以及转录终止信号和翻译终止信号。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包括用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标志物是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”意指使得质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。
可用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的(参见，例如上文的Sambrook等人，1989)。
宿主细胞
在一些实施例中，在此描述的方法进一步包括将来自步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸(例如，包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体)转化到重组宿主细胞中。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体而被维持。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属(Streptococcus)细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohe，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或者接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见，例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[微生物学大观(布拉格)]49:399-405)、接合(参见，例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，[Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人，在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fung[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，CAB International[国际应用生物科学中心]，University Press[大学出版社]，Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如Biology and Activities of Yeast[酵母生物学和活动性](Skinner、Passmore、以及Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium[应用细菌学学会讨论会]系列第9期，1980)中所述地定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁费酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌亚门和卵菌亚门(如由上文的Hawksworth等人，1995所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞菌属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)的细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢菌(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023；Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474，和Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中。用于转化镰孢菌属(Fusarium)物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编著，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology[酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法]，第194卷，第182-187页，Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司]，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
在一些实施例中，在此描述的方法进一步包括在适合于多肽表达的条件下培养上文所述的重组宿主细胞，以及任选地回收多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包括碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收多肽，该常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面中，回收包含多肽的整个发酵液。
可以通过本领域中已知的各种程序来纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden，编辑，VCH Publishers[VCH出版社]，纽约，1989)。
在替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
可通过以下编号的段落进一步描述本发明：
[1]一种选择具有酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：
(a)编码多肽的多核苷酸；
(b)与所述多核苷酸连接的固相；
(c)与所述固相连接的酶底物；以及
(d)连接到所述底物的选择性标记；
其中该水相包括用于表达该多肽的组分；
(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；
(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，
其中在水性液滴中具有针对底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且
(iv)分离合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中选择性标记已被释放的合成化合物。
[2]如段落[1]所述的方法，其中这些复数个合成化合物包括至少约106个不同的合成化合物(例如，至少约1010、1012或1014个不同的合成化合物)。
[3]如段落[1]或[2]所述的方法，其中该油包水乳剂中不超过20％的水性液滴包括多于一个合成化合物。
[4]如前述段落中任一段所述的方法，其中每个合成化合物仅包括一个多核苷酸的一个拷贝。
[5]如前述段落中任一段所述的方法，其中该乳剂包括至少约106个水性液滴/mL乳剂(例如，至少约109、1012或1015个水性液滴/mL乳剂)。
[6]如前述段落中任一段所述的方法，其中该乳剂中的水性液滴的平均直径为约0.05μm与约100μm之间(包含)(例如约0.1μm与约50μm之间、约0.2μm与约25μm之间、约0.5μm与约10μm之间、或约1μm与约5μm之间(包含))。
[7]如前述段落中任一段所述的方法，其中该乳剂中的水性液滴的平均体积为约1阿升与约1纳升之间，包含(例如，约10阿升与约50飞升之间，或约0.5飞升与约10飞升之间)。
[8]如前述段落中任一段所述的方法，其中该固相与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的多核苷酸连接。
[9]如前述段落中任一段所述的方法，其中该选择性标记与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的底物连接。
[10]如前述段落中任一段所述的方法，其中该底物与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的固相连接。
[11]如前述段落中任一段所述的方法，其中该选择性标记是亲和标签。
[12]如段落[11]所述的方法，其中该亲和标签包括生物素。
[13]如段落[12]所述的方法，其中步骤(iv)的包含选择性标记的这些合成化合物用链霉亲和素(例如链霉亲和素涂覆的微球)分离。
[14]如前述段落中任一段所述的方法，其中该固相是微珠或颗粒。
[15]如段落[14]所述的方法，其中该固相是疏水性微珠。
[16]如段落[1]-[13]中任一段所述的方法，其中该固相是金纳米颗粒。
[17]如前述段落中任一段所述的方法，该方法包括在步骤(iv)之前(例如经由化学诱导的聚结和/或离心)将水相与油相分离。
[18]如前述段落中任一段所述的方法，其中包含该选择性标记的回收的合成化合物和/或其中选择性标记已被释放的合成化合物是基本上纯的。
[19]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括(例如经由测序)分析步骤(iv)的分离的合成化合物的多核苷酸序列。
[20]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括扩增步骤(iv)的其中选择性标记已经被释放的合成化合物的一个或多个多核苷酸。
[21]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括扩增步骤(iv)的包含选择性标记的合成化合物的一个或多个多核苷酸。
[22]如段落[20]或[21]所述的方法，其中该扩增的一个或多个多核苷酸用于如步骤(i)所述的新的复数个合成化合物中，并且对所述新的复数个合成化合物重复步骤(i)-(iv)。
[23]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括将改变(例如诱变处理)引入步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸。
[24]如段落[23]所述的方法，其中该一个或多个改变的多核苷酸用于如步骤(i)所述的新的复数个合成化合物中，并且对所述新的复数个合成化合物重复步骤(i)-(iv)。
[25]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括表达步骤(iv)的分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸(例如，表达合成化合物的多核苷酸，其中该选择性标记已被释放，从而产生具有酶活性的多肽)。
[26]如前述段落中任一段所述的方法，该方法进一步包括将从步骤(iv)分离的合成化合物的一个或多个多核苷酸克隆到表达载体。
[27]如段落[26]所述的方法，该方法进一步包括将所述表达载体转化为重组宿主细胞。
[28]如段落[27]所述的方法，该方法进一步包括在适合于多肽表达的条件下培养该重组宿主细胞，以及任选地回收该多肽。
[29]一种合成化合物，该合成化合物包括：
(a)编码多肽的多核苷酸；
(b)与所述多核苷酸连接的固相；
(c)与所述固相连接的酶底物；以及
(d)连接到所述底物的选择性标记。
[30]如段落[29]所述的合成化合物，该合成化合物仅包括一个多核苷酸的一个拷贝。
[31]如段落[29]或[30]所述的合成化合物，其中该固相与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的多核苷酸连接。
[32]如段落[29]-[31]所述的合成化合物，其中该选择性标记与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的底物连接。
[33]如段落[29]-[32]所述的合成化合物，其中该选择性标记与具有经取代的硫醇(例如硫醚)、经取代的氨基(例如酰氨基)或三唑部分的底物连接。
[34]如段落[29]-[33]中任一段所述的合成化合物，其中该选择性标记是亲和标签。
[35]如段落[34]所述的合成化合物，其中该亲和标签包括生物素。
[36]如段落[29]-[35]中任一段所述的合成化合物，其中该固相是微珠或颗粒。
[37]如段落[36]所述的合成化合物，其中该固相是疏水性微珠。
[38]如段落[29]-[35]中任一段所述的合成化合物，其中该固相是金纳米颗粒。
[39]一种制备如段落[29]-[38]中任一段所述的合成化合物的方法，该方法包括：
(i)将该固相与编码多肽的多核苷酸连接；
(ii)将该酶底物与该固相连接；
(iii)将该选择性标记与该底物连接；并且
(iv)回收该合成化合物。
[40]一种多核苷酸文库，该多核苷酸文库包括如段落[29]-[38]中任一段所述的复数个不同的合成化合物。
[41]如段落[40]所述的多核苷酸文库，其中该复数个合成化合物包括至少约106个不同的合成化合物(例如，至少约1010、1012或1014个不同的合成化合物)。
[42]一种包括如段落[40]或[41]所述的多核苷酸文库的油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化。
[43]如段落[42]所述的乳剂，其中该油包水乳剂中不超过20％的水性液滴包括多于一个合成化合物。
[44]如段落[42]或[43]所述的乳剂，该乳剂进一步包括用于在这些水性液滴中表达该多肽的组分。
[45]如段落[42]-[44]中任一段所述的乳剂，该乳剂进一步包括乳化剂。
[46]如段落[42]-[45]中任一段所述的乳剂，其中该乳剂包括至少约106个水性液滴/mL乳剂(例如，至少约109、1012或1015个水性液滴/mL乳剂)。
[47]如段落[42]-[46]中任一段所述的乳剂，其中这些水性液滴的平均直径为约0.05μm与约100μm之间，包含(例如，约0.1μm与约50μm之间、约0.2μm与约25μm之间、约0.5μm与约10μm之间、或约1μm与约5μm之间，包含)。
[48]如段落[42]-[47]中任一段所述的乳剂，其中这些水性液滴的平均体积为约1阿升与约1纳升之间，包含(例如，约10阿升与约50飞升之间、或约0.5飞升与约10飞升之间)。
[49]如段落[42]-[48]中任一段所述的乳剂，其中该乳剂适合于在这些水性液滴内表达多肽。
[50]如段落[42]-[49]中任一段所述的乳剂，其中针对底物具有酶活性的表达的这些多肽能够在该液滴中从一个或多个合成化合物释放一个或多个选择性标记。
[51]一种制备如段落[42]-[50]中任一段所述的乳剂的方法，该方法包括：
(i)将该复数个合成化合物悬浮在该水相中；并且
(ii)将(i)的悬浮液与油混合。
通过说明提供了以下实例，并且并不旨在使限制本发明。
实例
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
实例1：LSS1b的合成
对于LSS1b的合成，类似于FA-SH(见上文)，对12-氨基十二烷酸(FA-NH2)进行Mmt-保护。按照用于氨基酸的三苯甲基保护的程序，在该程序中羧酸被暂时保护为TMS-酯，以良好的产率产生所希望的FA-NHMmt(Barlos等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]1982,47,1324-1326)。现在使用与用于合成LSS1相同的方案进行偶联反应。由于模型研究指明生物素-NHS与氨基亲核试剂快速且化学选择性地进行反应，在同时除去两个保护基团之前，将DG-NHMmt与FA-SMmt偶联。最后，偶联到生物素-NHS产生所希望的LSS1b(2)。
生物素-NHS
将生物素(325mg，1.33mmol)在温和加热下溶解于DMF(10mL)中。冷却至室温后，添加N,N-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI，250μL，1eq)、吡啶(105μL，1eq)和N-羟基琥珀酰亚胺(HNS，200mg，1.3eq)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后过滤并在真空中浓缩。将所得固体在iPrOH(50mL)中重结晶，首先在温和加热下将其溶解，然后将该溶液置于4℃下进行沉淀。将沉淀的产物过滤、用冷的iPrOH洗涤并在真空中干燥以产生280mg(62％)白色晶体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,所选择的信号(ppm)):6.42(s,1H,NH),6.36(s,1H,NH),4.33-4.29(m,1H,-CHNH-),4.18-4.13(m,1H,-CHNH-),3.15-3.08(m,1H,-CH-S-),2.82(s,4H,-CH2-NHS),2.68(t,2H,-CH2COO-)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6,所选择的信号(ppm)):170.7(CO NHS),169.4(CO酯),163.2(CO碳酰二胺),61.5(-CHNH-),59.6(-CHNH-),55.7(-CH-S-),30.5(-CH2COO-),25.9(-CH2-NHS)。
FA-NHMmt
将12-氨基十二烷酸(1.08g，5mmol)悬浮于CHCl3-MeCN(5:1，18mL)中，并添加氯三甲基硅烷(TMS-Cl，0.63mL，1eq)。将混合物在N2下加热至回流(65℃)持续2h，并且保持为悬浮液。冷却至室温后，添加三乙胺(1.39mL，2eq)。然后添加溶解在CHCl3(10mL)中的Mmt-Cl(1.54g，1eq)。将混浊的橙色溶液在室温下搅拌过夜。然后添加MeOH(25mmol，1.0mL)。该橙色溶液慢慢变成黄色。TLC(EtOAc-庚烷，1:3)证实Mmt-Cl(Rf 0.40)完全转化成产物(Rf 0.15)。蒸发至油，其中1.7g通过急骤层析纯化。将其溶解于CHCl3(10mL)中，并使用EtOAc-庚烷(1:3、600mL，然后2:3、750mL)通过120g二氧化硅急骤柱体进行洗脱。通过TLC鉴定包含产物的级分，并将其合并和蒸发以产生1.4g、57％的黄色稠油。
1H NMR(400MHz,CDCl3,所选择的信号(ppm)):6.83(d,2H,Mmt CH紧邻–OMe),3.81(s,3H,-OMe),2.36(t,2H,-CH2COOH),2.16(t,2H,-NHCH2-),1.68-1.61(m,2H,-CH2CH2COOH),1.53-1.46(m,2H,-NHCH2CH2-)。
13C NMR(100MHz,CDCl3,所选择的信号(ppm)):55.2(-OMe),43.7(-NHCH2-),34.1(-CH2COOH)。
DG-NHMmt
将FA-NHMmt(585mg，1.2mmol)溶解于THF-DCM(1:1，12mL)中，并且将该溶液在冰上冷却至0℃。添加1-硬脂酰基-rac-甘油(430mg，1eq)、EDAC(570mg，2.5eq)和DMAP(26mg，0.2eq)。将混合物在N2下在0℃下搅拌2h，然后在室温下搅拌2h。有一些沉淀。TLC(EtOAc-己烷1:3)显示完全转化。Rf(产物)＝0.47。将反应混合物蒸发并重新溶解于CHCl3(2mL)中。通过急骤层析进行纯化，用己烷-EtOAc从纯的己烷至20％EtOAc的梯度进行洗脱。将产物用20％EtOAc进行洗脱。将包含产物的级分蒸发以产生405mg，41％。
1H NMR(400MHz,CDCl3,所选择的信号(ppm)):6.83(d,2H,Mmt CH紧邻–OMe),4.23-4.09(m,5H,甘油主链),3.80(s,3H,-OMe),2.37(t,4H,-CH2CO-),2.13(t,2H,-CH2NH-),1.67-1.61(m,4H,-CH2CH2COOH),1.55-1.45(m,2H,-NHCH2CH2-),0.91(t,3H,-CH3)。
13C NMR(100MHz,CDCl3,所选择的信号(ppm)):173.9(-CO-),113.0(Mmt CH紧邻–OMe),70.3(Mmt季C),68.4(C-2),65.06(C-1/3),55.2(-OMe),43.6(-CH2NH-),34.1(-CH2CO-),24.9(-CH2CH2CO-),22.7(-CH2CH3),14.1(-CH3)。
实例2：将酶底物与固相连接
本实例描述了与(1)金纳米颗粒和(2)生物素选择性标记连接的脂质底物的合成，如图2所示。
可以使用配体来修饰金纳米颗粒的表面，以便起三种作用：i)提供附接酶底物的手段和使用选择性标记选择的手段；ii)提供分散纳米颗粒使得它们不聚集的手段；以及iii)附接编码多肽的DNA。硫醇化的配体M4(Quanta Biodesign公司#10799)和A12(Quanta BioDesign公司#10808)在纳米颗粒之间提供空间和/或静电排斥。首先使用标准程序(例如Kim,E.Y，Nucleic Acids Research[核酸研究]，第34卷，第7期，2006)经由配体交换将这些配体附接到金纳米颗粒的外部，下面进一步详细描述。
M4配体(m-dPEG4-硫辛酰胺)
A12配体(硫辛酰胺-dPEG12-酸)
在1打兰玻璃小瓶中，在100摩尔当量总数(摩尔配体：摩尔表面金原子)、2mL总体积、65％v/v THF中，以750rpm在25℃下搅拌16h来进行配体交换。简言之，将干净的干燥搅拌棒添加到新的20mL玻璃小瓶(Chemglass公司)中。将A12配体(硫辛酰胺-dPEG12-酸)在100％THF(Acros公司)中从5μmol等分试样重悬浮至10mM，并在水浴式超声波仪(bath sonicator)(VWR 1.9L)中超声处理2分钟以加速再溶解。M4配体(m-dPEG4-硫辛酰胺)在THF中同样重悬浮至10mM。通过添加THF将LSS1b(实例1)重悬浮至10mM。
在恒定搅拌下，向20-mL小瓶中依次添加以下反应物：NaOH(50μL，2M)、THF(6mL)、M4配体(200μL)、A12配体(250μL)、LSS1b(50μL)、纳米颗粒(1mL，5OD-mL)和去离子水(2.95mL)。纳米颗粒是直径为40nm的金纳米颗粒(纳米克斯公司(Nanopartz)A11-40)。配体交换在25℃下进行16h。
交换反应后，通过在真空下蒸发去除THF。通过以下方式来洗涤交换的纳米颗粒：将每个体积转移到已经添加10mL去离子水的100kDa的自旋浓缩器(密理博公司(Millipore)Amicon 15)中并在吊桶式离心机(埃彭道夫公司(Eppendorf)5702)中以2,000rcf旋转1分钟，倒出滤液，并将滞留物重悬浮于4mL去离子水中。重复洗涤，总共进行3次，最后重悬浮至总体积为1mL去离子水中。
通过测量528nm处的光吸收和由制造商提供的消光系数来定量纳米颗粒，并且根据需要通过稀释来调节其浓度。
通过附接具有链霉亲和素分子的DNA探针并且使用定量PCR定量该DNA探针来确定LSS1b配体与纳米颗粒的附接。简言之，该探针DNA(是具有5’生物素的合成寡核苷酸(5’生物素-CAAAG TATAT GCCTC TCCCC AGAGT GTTGC ACCTG TCTCC GTAGC GTCAC CTCCC GGATG GGAGA AAGTA GACTG-3’；SEQ ID NO:1)在10mM Tris-HCl和50mM NaCl中在室温下与链霉亲和素(赛默飞世尔公司(Thermofisher)Pierce#21122P)以等摩尔量结合30分钟。然后将结合的链霉亲和素-DNA-探针以>10x摩尔过量添加到相同缓冲液中的一小部分交换的纳米颗粒中，并允许结合30分钟。然后如上所述，通过100kDa的自旋浓缩器将纳米颗粒洗涤5次，去除未结合的链霉亲和素-探针-DNA。洗涤后，根据制造商的方案，使用SsoAdvancedTMUniversal Green Supermix(伯乐公司(Bio-Rad))、探针特异性引物(5’-CAAAG TATAT GCCTC TCCCC AG-3’；SEQ ID NO:2，和5’-CAGTC TACTT TCTCC CATCC G-3’；SEQ ID NO:3)以及480Instrument II(罗氏生命科技公司(Roche Life Science))，通过定量PCR(qPCR)来确定每体积的探针-DNA的数量。由于所有生物素(存在于每个LSS1b上)将具有结合的链霉亲和素-探针-DNA，所以该定量提供了对附接到每个纳米颗粒上的LSS1b配体的数量的测量。
实例3：乳剂形成、酶消化和化合物分离
以在2015年4月7日与本申请共同提交的标题为“用于选择具有脂肪酶活性的酶的方法(Methods For Selection Enzymes Having Lipase Activity)”的美国临时申请中所述的相同的方式(参见实例6)来产生和提取来自实例2的具有0、5％、10％和20％LSS1b的纳米颗粒的乳剂，但是这些交换的纳米颗粒(109个/乳剂)在50mM HEPES、2mg/mL牛血清白蛋白(西格玛公司(Sigma))和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)(SEQ ID NO:4)的溶液中为0或10μM的终浓度。
将乳剂在30℃下孵育15分钟，以允许留出时间进行LSS1b的脂肪酶介导的消化，然后进行提取。产生相同的游离溶液反应，并且该反应省略了乳剂形成和提取步骤。然后使用链霉亲和素涂覆的磁珠(生命技术公司(Life Technologies)，MyOne C1链霉亲和素)对纳米颗粒进行捕获。去除磁珠，并通过测量528nm处的光吸收来定量剩余的纳米颗粒。如图3所示，由于甘油三酸酯水解和生物素释放，消化的纳米颗粒(+TLL)表现出较低的捕获率。
实例4：将DNA与固相连接
本实例描述了使用如以下文献描述的程序来对多核苷酸与金纳米颗粒进行生物轭合：例如，Nathaniel L.Rosi等人，Science[科学]，第312卷，第1027期，2006；Sung Yong Park等人，Nature[自然]，第451卷，第31期，2008。
在THF中如下进行配体交换反应：将干净的、干燥搅拌棒添加到新的4mL(1打兰)玻璃小瓶(Chemglass公司)中。从10μmol等分试样(储存于-20℃下)通过添加612μL将甲基-PEG2000-硫醇配体(#PJK-602，Creative PEGWorks；m-PEG2000-SH)重悬浮于100％MeOH(Acros公司)中以制备2000x溶液(16.7mM)。使用来自在-20℃下储存的100x冻存储备液(0.8mM)的一个具有用于与纳米颗粒特异性轭合的5’二硫醇的合成寡核苷酸(5’二硫醇-CAAAG TATAT GCCTC TCCCC AGAGT GTTGC ACCTG TCTCC GTAGC GTCAC CTCCC GGATG GGAGA AAGTA GACTG-3’；SEQ ID NO:5；SR1)和一个用于探测与纳米颗粒非特异性轭合的可能性的未修饰的寡核苷酸(5’-GCTCC CAAAA GACCT ATCCT GACCG CAAAA TCATA ACGCC CCGAC AGCGG TGTCT TCTCC TTCCC AGTTC TTACG-3’；SEQ ID NO:6；SR2)。通过添加下表1中所示的THF、SR1、SR2和NaOH的量来建立配体交换反应。将小瓶置于搅拌板(IKA公司RET基础型)上的Pie Block(IKA公司)中，并以750rpm搅拌。通过向每个小瓶中添加1000μL的50nm金纳米颗粒(Accurate A11-50，纳米克斯公司(Nanopartz))启动配体交换，并将其在25℃或50℃下孵育16h。指定量(表1)的m-PEG2000-SH在添加纳米颗粒(0m)时，或在添加纳米颗粒5m后提供。
表1.
将基于THF的交换转移至2×2mL玻璃自动进样器小瓶(赛默公司(Thermo))中，并按照高BP溶剂方法(Genevac公司EZ2Elite、20m直到最后阶段、5m最后阶段、100mbar减少气味)在没有加热的情况下在真空中进行浓缩。在大部分THF蒸发后，将0.5mL去离子水添加到每个小瓶中，然后超声处理5s。通过首先向每个浓缩器中添加2mL去离子水，然后添加纳米颗粒，在吊桶式离心机(埃彭道夫公司(Eppendorf)5702)中以2,000rcf持续1m在100kDa自旋浓缩器(密理博公司(Millipore)Amicon 4，UFC810024)上对样品洗涤2次。通过添加4mL去离子水进行两次洗涤，并在每次自旋浓缩后通过移液进行重悬浮。然后将纳米颗粒重悬浮至总体积为1mL去离子水中。
对于交换后测试，将200μL纳米颗粒转移到一次性比色皿(品牌Ultra-Micro，759220)中、加盖，并测量吸收光谱(Nanodrop 2000c)。在3种条件下测定纳米颗粒稳定性：去离子水、50mM NaCl和50mM NaCl+0.1M DTT。简言之，将42.5μL/孔的水、0.2M NaCl或0.2M NaCl+0.4M DTT添加到葛莱娜公司(Greiner)半区域板中。然后，添加127.5μL的每个NP样品，并通过移液进行混合。将样品在室温下孵育30分钟，然后测量在530nm和615nm处的吸光度。用于稳定性测定的所有液体转移均用Biomek NXP进行。然后使用标准金参数(n＝0.200，A＝0.1)，通过DLS(Malvern Zetasizer Nano ZS公司)以反向散射模式对每个样品进行尺寸调整。然后通过添加600μL的50mM HEPES(pH 7.6)将样品稀释，将该样品加载到折叠的毛细管样品池(Malvern DTS1070)中用于ζ电位测量。
为了测量与未修饰的寡核苷酸(SR2)的非特异性结合相比的二硫醇修饰的寡核苷酸(SR1)的特异性生物轭合，对洗涤的纳米颗粒进行取样用于DNA定量。将10μL纳米颗粒(从1mL的终体积)以1:1000稀释到去离子水中。根据制造商的方案，使用SsoAdvancedTMUniversal Green Supermix(伯乐公司(Bio-Rad))、探针特异性引物5’-CAAAG TATAT GCCTC TCCCC AG-3’(SEQ ID NO:7)和5’-CAGTC TACTT TCTCC CATCC G-3’(SEQ ID NO:8)以及480Instrument II(罗氏生命科技公司(Roche Life Science))，通过qPCR来定量5μL的该稀释样品。结果呈现于图4中。
虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细描述了上文，本领域普通技术人员将清楚的是，可以实施任何等效方面或修饰。因此，该说明和实例不应当解释为限制本发明的范围。
序列表
<110> 诺维信公司
Blazej, Robert
Toriello, Nicholas
Emrich, Charles
Svendsen, Allan
<120> 用于选择具有增强活性的酶的方法
<130> 12945-WO-PCT
<150> US 62/143,967
<151> 2015-04-07
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 1
caaagtatat gcctctcccc agagtgttgc acctgtctcc gtagcgtcac ctcccggatg 60
ggagaaagta gactg 75
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 2
caaagtatat gcctctcccc ag 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 3
cagtctactt tctcccatcc g 21
<210> 4
<211> 270
<212> PRT
<213> 疏棉状嗜热丝孢菌
<400> 4
Met Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln
1 5 1015
Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly
202530
Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala
354045
Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val
505560
Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser
65707580
Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe
859095
Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp
100 105 110
Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys
115 120 125
Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr
130 135 140
Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu
145 150 155 160
Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg
165 170 175
Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly
180 185 190
Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro
195 200 205
Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys
210 215 220
Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu
225 230 235 240
Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile
245 250 255
Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265 270
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 5
caaagtatat gcctctcccc agagtgttgc acctgtctcc gtagcgtcac ctcccggatg 60
ggagaaagta gactg 75
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 6
gctcccaaaa gacctatcct gaccgcaaaa tcataacgcc ccgacagcgg tgtcttctcc 60
ttcccagttc ttacg 75
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 7
caaagtatat gcctctcccc ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 8
cagtctactt tctcccatcc g 21
