用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法。
背景技术
随着高通量测序的发展，基因组测序成为了高通量、高深度鉴定相关位点变异，进而识别潜在疾病的最主要手段，同时在科研上具有广泛的应用。在医学诊断上，高通量测序可直接获得大量相关位点变异信息，对于精准医疗具有重大意义。但是，基于目前的状况，多数研究目标和诊断目标只占总体样本的一小部分，例如绝大多数已知的疾病相关位点变异存在于基因组某一特定区域，如外显子组，约占人基因组全长的1％-2％左右；线粒体DNA，占人全基因组的比例更低，仅有0.03％左右；由乙肝病毒整合所诱发的肝癌患者中，整合于人基因组上的乙肝病毒DNA占全基因组的比例极低，约占全基因组的0.0001％-0.0005％。虽然人全基因组测序可以实现外显子组与线粒体DNA以及整合于人基因组上的乙肝病毒DNA的覆盖，但要达到数据分析所要求的数据量则花费成本较高，个体化选择富集位点困难，导致在临床与科研上开展广泛的应用较为局限。
DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，可将基因组目标区域或感兴趣的目标核酸富集后，提高靶区域所占比例。因此，通过DNA靶向富集技术，富集特定疾病相关目标区域，如人外显子组，或者富集感兴趣的目标区域，如人线粒体DNA、感兴趣的基因区域、整合于人基因组上的乙肝病毒DNA，可大幅降低测序成本，潜力巨大。同时，高通量测序又能对测出的序列进行单碱基的观察，具有获得已知序列、部分已知序列甚至未知的序列，因此对临床诊断和科研具有重大意义。
同时，针对目标核酸靶向捕获后应用到高通量测序，在检测效果上，与以往的酶促反应/免疫检测等不同，可对核酸序列具体到单碱基的观察。同时，高通量测序中，对于检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用的观察，则需要达到一定的测序深度，而若未对具有变异的目标核酸进行富集，则测序结果中会存在大量的非有用信息的结果，造成测序的浪费，或者费用显著升高以至于很多研究和检测工作难以开展。而经目标核酸靶向捕获后再应用到高通量测序，可大幅降低检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用等所需的成本，富集倍数即为测序成本降低的倍数。目前市场化的多区域长片段的富集产品主要是基于液相分子杂交与磁珠分离方法，如针对人外显子组的罗氏SeqCap EZ Exome Library SR试剂盒，安捷伦的SureSelect Human AllExon试剂盒和illumina的
目前已有报导的其他多区域长片段的富集技术，绝大多数均需通过人工合成的方式，合成经修饰的单链核酸探针，同时制备经多次修饰的固相载体。其富集过程也多为先形成核酸探针：靶核酸复合体，再通过核酸复合体：载体富集，获得富集后的靶核酸序列。复合体与载体的结合，则通过核酸探针与固相载体的修饰基团，因此，不可避免的进行探针修饰与固相载体特定基团包被等，故而提高捕获成本，造成步骤的繁琐。
DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，虽然可降低测序目标核酸的成本，但由于靶向富集技术的不同，如探针量、探针来源和探针制备等，会造成对目标核酸多样性造成影响，进而影响未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用。
由于目前所流行及通用的核酸富集技术，需通过人工方式合成单链核酸探针，因此，合成的探针越多越密集，所造成的成本越高，如若想达到针对大片段区域目标序列的单碱基覆盖度，其成本巨大，由此造成在探针合成成本和高丰度位点及高深度测序的选择上，处于两难之地。
目前市场化的基于PCR技术通过目标位点扩增进行捕获的技术，均需针对特殊位点进行引物设计及人工合成引物，其通量较小，位点的数量需根据引物对的数量来确定。相较于大片段序列富集分析，目标核酸的碱基覆盖度更低。同时由于成千上万对引物的存在，会造成较高的背景，位点之间相互影响，不利于后续的分析。同时，合成引物的成本也较高，越多的引物存在，就会越多的提高成本。
用于核酸杂交的固相载体如玻璃，平板，平皿，微球等均需对固相载体进行修饰后，方可特异性结合核酸，如磁珠，需要对磁珠进行修饰后，进而特异性结合核酸。但核酸的结合具有方向性，所能结合的探针量较低，如目前市场化的基于磁珠靶向核酸分子富集产品，其中某一产品的特性为每毫克磁珠可结合20微克双链DNA，而每毫克磁珠价格在240元左右。
固相载体膜类如尼龙膜和醋酸纤维膜等膜纸类固相载体，均具有较强的核酸吸附能力，如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600微克核酸，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100微克核酸，同时核酸与膜的结合不需要方向性，因此不必对核酸探针进行修饰。而市场上评价最高的带正电的尼龙膜，每平方厘米的价格则在0.3元左右。
在目标核酸富集过程中，探针量与目标核酸量之间的比例是一个重要技术参数。探针的量越多，所能富集到高多样性目标核酸的概率就越大，这对未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用具有重要意义。
CN 103602658A公开了一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，该方法中，探针核酸标记丙烯酰胺基团，在与目标核酸结合后，通过制备包含有目标核酸:探针核酸复合物的丙烯酰胺凝胶，再通过电泳去除非特异性片段。该方法中，目标核酸和探针核酸的杂交时间和条件不能具有较好的调控性，造成背景噪音较高。
CN101351564A公开了一种通过靶特异性杂交方法检测核酸，该方法虽然通过固相载体来对目标核酸:探针核酸杂交复合物进行富集，进而获得目标核酸，但所产生的目标核酸:探针核酸复合物为RNA:DNA复合体，目标核酸为RNA而非DNA，这大大缩小了可应用范围。其次，该方法需对固相载体进行一定的特殊修饰，进而富集到靶核酸:探针核酸复合物，增加了成本。同时，该方法只针对特定位点的捕获，并不适用于高通量大规模富集的要求。
目前以尼龙膜或醋酸纤维膜或类似物等固相载体膜类为介质进行目标核酸文库的富集，并最终用于高通量测序服务上，还尚无该方面报道及研究。
发明内容
针对以上技术现状，本发明目的是提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，所述方法包括：
1)将核酸探针文库通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜相结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；
2)向含有经过预杂交或未经过预杂交的“探针-固相载体膜复合体”的杂交液中，加入变性后的含有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的目标核酸的溶液，或者再加入具有提高富集效率的组分，以进行目标核酸的富集；
3)用清洗液清洗步骤2)中结合目标核酸的“探针-固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后的核酸文库；
4)将步骤3)所富集得到的目标核酸文库经扩增或不扩增、以制成具有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的、能用于高通量测序的目标核酸文库，即得。
本发明方法中，制备所述步骤1)中核酸探针文库的生物材料的核苷酸序列信息是否是全部已知、或部分已知的、即其核苷酸序列是否被全部或部分测序出或未被测序出、这并不影响实施本发明，即不影响制备本发明步骤1)所述的核酸探针以及后续的目标核酸的富集。
因此、本发明步骤1)中的核酸探针文库可以是核苷酸序列信息全部已知的、核苷酸序列信息部分已知的、或核苷酸序列信息全部未知的核酸探针文库，作为示例性说明，如由经过测序的由HBV质粒制备而来的所述核酸探针文库，其序列信息已知，用于富集人基因组内整合的HBV序列；或从某人细胞系中分离得到的线粒体DNA，进而制备成的所述核酸探针文库，该探针文库序列部分已知，可用于富集病人样本中的线粒体DNA；或从某种细胞系中分离得到的mRNA反转录生成的cDNA，进而制备成的所述核酸探针文库，其中含有已知序列信息、部分已知序列信息和未知的序列信息，而该所述核酸探针文库又可用于富集该细胞系的外显子区域的核酸序列。
本发明方法中，所述步骤1)中所述核酸探针文库可以由本领域技术人员采用本领域技术常识进行制备，作为实施方案之一、采用包括但不限于以下方法制备：通过生物合成方式和/或生物酶促反应制备双链核酸文库，并进一步制备成与目标核酸结合的核酸探针文库，或者通过人工合成带修饰或不带修饰的核酸探针文库。
本发明方法中，作为实施方案之一、所述步骤1)中的双链核酸文库的序列具有与目标核酸序列相同、互补、相似或高度同源的序列特征；作为进一步实施方案之一、所述的双链核酸文库可来源于基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒DNA等可于宿主细胞内进行生物合成的核酸分子。
本发明方法中，所述步骤1)中的生物合成方式，是指在生物体内，如细菌、酵母、哺乳细胞等，以DNA为模板，通过生物体内一系列的酶促反应，进行DNA的合成。该方式是最为基础的、常用的生物学手段，如质粒的扩增、文库扩增等，利用生物体的生物学特性，快速方便的获得大量核酸分子。作为实施方案之一，转化与目标核酸序列相同、互补、相似或高度同源的、具有在宿主细胞内合成的核酸分子，到细胞内并培养，提取并纯化在宿主细胞内经生物合成的核酸分子，例如，基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒DNA，本领域技术人员可以根据本领域技术常识，由以上所提示例，但不限于此，获得大量由生物合成方式得来的双链核酸文库；
本发明方法中，所述步骤1)中所述的生物酶促反应是指在体外基于体内合成、加工核酸的原理，利用生物酶在体外以核酸为模板进行核酸的合成，如DNA聚合酶、逆转录酶等，此类方法最经典的代表为聚合酶链式反应(PCR)，和/或利用生物酶对核酸进行加工，如核酸酶。
本发明方法中，作为实施方案之一，例如，聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶切、RNA反转录方式获得所述双链核酸文库。本领域技术人员可以根据本领域技术常识，由以上所提示例，但不限于此种方式，获得生物酶促反应方式得来的双链核酸文库；
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中还可将由通过生物合成方式和/或生物酶促反应所得双链核酸，进一步构建成具有扩增接头的核酸文库，再通过生物酶促反应扩增来简单方便的获得大量双链核酸文库。本领域技术人员可以根据本领域技术常识，在构建核酸文库过程中，可用常规文库构建方法设计不同的核酸接头，或可用生物酶法等不同方式，如转座酶方式，构建具有扩增接头的核酸文库，用于扩增所述双链核酸文库。
本发明方法中，所述核酸接头是指一段已知的、双链核酸或部分互补配对的单链核酸分子，该核酸分子能通过核酸连接反应或转座反应，连接至未知序列的核酸分子(又称插入片段核酸)两端，构成核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的形式。
本发明方法中，所述具有扩增接头的核酸文库是所述的具有核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的形式的核酸文库,两端接头序列可相同或不同。由于接头序列已知，因此，通过设计与接头序列互补配对的引物进行生物酶促反应，如PCR，能快速扩增合成插入片段，形成双链核酸文库，因此成为具有扩增接头的文库。核酸接头在目前构建高通量测序文库的过程中被使用，用于扩增/桥式扩增插入片段文库，如illumina的TruSeq RNA LibraryPreparation Kit v2，TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit，Nextera XT DNALibrary Preparation Kit，NEB的
本发明方法中，所述步骤1)中，由双链核酸文库制备核酸探针文库，所述制备包括但不限于如下：1.若双链核酸片段较长，如超过10kb，则先通过片段化，使双链核酸的片段优选在20bp-10kb之间，后通过物理或化学方式变性核酸，生成用于富集目标核酸的核酸探针文库；2.若双链核酸片段处于20bp-10kb之间，则直接通过物理或化学方式变性核酸，生成用于富集目标核酸的核酸探针文库；3.可通过转录的方式，由双链核酸文库制备用于富集目标核酸的核酸探针文库。
本发明方法中，所述步骤1)中，由双链核酸文库制备核酸探针文库，片段化的方法可为，例如，采用物理、化学、光化学或生物酶法片段化的方法进行片段化，作为实施方案之一，超声波打断、HydroShear、酶切、化学试剂断裂或以上方法的联合使用。
本发明方法中，通过物理或化学手段变性产生核酸探针文库的方法为，作为实施方案之一，碱变性法、高温加热后骤冷或以上方法的联合使用。
本发明方法中，通过转录的方式，由双链核酸文库制备用于富集目标核酸的核酸探针文库，是指所述双链核酸文库的核酸分子一端或两端具有启动子序列的序列特征，RNA转录酶可识别该序列并能在体外进行转录生成核酸，作为示例性说明，如T7启动子可被T7RNA聚合酶结合，并在体外进行RNA的合成。与上述具有接头的核酸文库类似，可将所述双链核酸文库的启动子序列视为核酸接头，具有可被RNA转录酶识别的核酸接头。
本发明方法中，所述步骤1)中，由双链核酸文库制备而来的核酸探针文库，其长度可变，范围优选在20bp-10kb之间。本领域技术人员根据本领域技术常识可知，目前所述的由人工合成的用于富集目标序列的单链核酸探针，长度具有局限性，一般为20nt-100nt之间，且分辨率取决于合成的探针量。而在本发明方法中，可通过对双链核酸文库进行物理或化学方式片段化，片段化的长度可控，因此产生的核酸探针文库具有甚至大于500倍的高倍数覆盖、单碱基位移的特点，实现高丰度及高多样性目标文库的富集。
本发明方法中，作为实施方案之一、所述步骤1)中的核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：
1-1)获取并纯化具有与目标核酸序列互补或高度同源序列的基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、酶切产物、PCR产物、DNA转录产物、RNA反转录所得的核酸文库，经片段化或不经片段化，形成20bp～10kb片段范围；优选150bp～800bp的片段；片段化方式为物理、化学、光化学法或生物酶等方式；优选物理法如超声法、HydroShear和/或生物酶法如酶切法；作为示例性的说明、例如超声条件为开30秒/停90秒，6个循环；
1-2)将步骤1-1)取得的片段通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。
作为实施方案之一，所述物理方式变性，作为示例性的说明、如在煮沸下5分钟，后瞬间放置冰中冷却；作为另一实施方案之一，所述化学方式变性包括但不限于可以在室温、碱性条件下变性，得核酸探针文库；作为实施方案之一、在碱性条件pH 10-12下；作为示例性的说明、在0.4M NaOH和1.5M NaCl的碱性溶液的条件下进行变性。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中所述固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、硝酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、或醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜；作为示例性的说明，例如包括但不限于带正电的尼龙膜或其衍生物膜、或带中性的醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或中性的纤维素纸或其衍生物膜。
本发明所述步骤2)中，通常不同固相载体膜其所能结合探针的能力是不同的，例如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600ug DNA序列核酸的探针，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100ug DNA序列核酸的探针，本领域技术人员可以根据本领域技术常识及具体使用的探针种类来确定探针的实际使用量，作为实施方案之一，固相载体膜上结合核酸探针的量为1ng-100ug/cm2。
本发明方法中，所述步骤2)进一步包括将经转移至并吸附在固相载体膜上的核酸探针文库，通过例如物理、化学、光化学方式与固相载体膜牢固结合，本领域技术人员可以根据本领域技术常识，选择不同的固定方式，最终使核酸探针以共价或非共价键与固相载体膜连接；作为实施方案之一，例如，核酸和带正电的尼龙膜形成共价键，在60℃-90℃的真空环境下，通过烘焙使核酸探针与固定相载体膜牢固结合；作为另一实施方案之一，在75℃-85℃下与固定相载体膜结合，作为示例性的说明，例如可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下使固定相与探针相结合；作为进一步实施方案之一，或通过紫外照射直至探针与固定相载体膜结合。
本发明通过物理或光化学手段使核酸探针和固定相非特异性、无方向性的结合，并使核酸位置不可变的固定于固相载体膜上。所述无方向性是指核酸探针与固相载体膜的结合，不需要一定是核酸的5’端或3’端与膜结合，而是核酸分子的任何部分都可以和固相载体膜结合，这与在固定相上合成探针、带修饰的探针和修饰的固相载体结合时是不一样的。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤3)中的预杂交是指在未加入含有目标核酸文库前，将“探针-固相载体膜复合体”放入所述杂交液中进行预杂交。预杂交可以对固相载体膜进行位点阻断，减少富集时的非特异性核酸。预杂交加入的所述杂交液，本领域技术人员根据本领域技术常识，可加入(或不加入)其他具有提高富集效率的组分，作为实施方案之一，如鲑鱼精子DNA、BSA、Denhardt’s solution等，可对固相载体膜进行位点阻断，减少富集时的非特异性核酸。
本发明方法中，作为实施方案之一、所述步骤3)中目标核酸在所述的核酸文库比例没有特别的限定；若核酸探针文库不易获得，则对该核酸序列构建成为含有可扩增接头的文库，通过扩增来简单方便获得大量核酸捕获探针文库。作为进一步实施方案之一，所述方法还可以包括：扩增核酸文库的引物序列，与自制接头中互补配对的序列一致，用所述引物可扩增中间插入的核酸探针文库，接头序列及扩增引物如下的核苷酸序列：
TGGTGTAACATCATACAGAGCATACGACGACT[SEQ ID NO:1]
P-GTCGTCGTATGCTCTGTACCACTACACTGCC[SEQ ID NO:2]
TACAGAGCATACGACGAC[SEQ ID NO:5]
其中，P-GTCGTCGTATGCTCTGTACCACTACACTGCC为磷酸化修饰的核苷酸序列，其中P为磷酸化的修饰基团，
本发明方法，所述步骤3)中的杂交液为本领域常用的各种杂交液，本领域技术人员可以根据本领域技术常识及具体情况调整以达到所需的杂交效果，作为示例性的说明，包括但不限于：通用名称为Church and Gilbert buffer(主成分磷酸钠缓冲溶液、EDTA和SDS)、Modified Church and Gilbert buffer(主成分磷酸钠缓冲溶液、EDTA、SDS和BSA)、Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液(SSC)、Denhardt’s solution和SDS)、含有甲酰胺的Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液和Denhardt’s solution、SDS和甲酰胺)；或可将Denhardt’s buffer和含有甲酰胺的Denhardt’s buffer中的柠檬酸钠缓冲液更换为SSPE(磷酸钠缓冲溶液)；作为示例性的说明，如Modified Church and Gilbertbuffer(主成分为磷酸钠缓冲溶液、EDTA、SDS和BSA)的杂交溶液、或Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液、Denhardt’s solution和SDS)，即含有SSPE、Denhardt solution和SDS的溶液，或含有SSPE、Denhardt solution、SDS和甲酰胺的溶液；作为进一步实施方案之一，所述杂交溶液中含有0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS；作为进一步实施方案之一，所述杂交溶液含有5x柠檬酸钠缓冲液(5x SSC),5×Denhardtsolution和1％(w/v)SDS的溶液。
本发明方法，所述步骤3)中含有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列的目标核酸与上述所述核酸接头一致，即目标核酸分子具有核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的形式的序列特征。标签核酸序列是一段已知序列的核酸，用于区分不同的核酸文库，其真正意义上属于核酸接头的一部分，用于区分不同的核酸文库。作为示例性说明，如高通量测序对多个文库同时进行测序时，插入片段序列来源样本的识别，则是通过标签核酸序列。所述具有不同标签核酸序列的目标核酸是指，在富集过程中，可一次性对混合有多个不同样本的核酸文库进行富集，因此通过不同的标签核酸序列区分出目标核酸所源于的样本。
本发明方法，所述步骤2)中具体提高富集效率的组分，作为示例性的说明，包括但不限于如BSA、Denhardt’s solution、与核酸文库中的接头和/或重复序列互补的核酸分子、阻断固相载体膜位点的组分等，作为进一步实施方案之一，所述组分如结合核酸文库中的接头的核酸、Cot-I DNA、Homopolymer DNA等核酸组分，作为进一步实施方案之一，所述组分如BSA、BLOTTO、肝素等。
本发明方法，所述步骤3)中，清洗固相载体膜时，所用的清洗液为本领域常用的各种清洗液，本领域技术人员根据本领域技术常识可进行调整清洗液种类及清洗次数，达到降低由同源性较低导致的非特异性杂交的效果，作为示例性的说明，包括但不限于：主成分为磷酸钠缓冲液和SDS的清洗液、主成分为柠檬酸钠缓冲液(SSC)和SDS的清洗液与主成分为SSPE和SDS的清洗液，作为示例性的说明，如用0.02M-0.5M磷酸钠缓冲液/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；如用0.1x-2x SSC/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；或含有0.1x-2x SSPE/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；作为实施方案之一，优选清洗液含有0.04M磷酸钠缓冲溶液/1.6％(w/v)SDS的清洗溶，清洗三次；作为另一实施方案之一，先用含有2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液(温和型洗脱液)清洗，再用含有0.2x SSC/0.1％(w/v)SDS的溶液(中等型洗脱液)清洗，和/或用含有0.1x SSC/0.1％(w/v)SDS的溶液(剧烈型洗脱液)清洗。
本发明方法中，所述步骤3)中将目标核酸从固相载体膜上的洗脱，是指将经富集后的含有目标核酸的核酸文库，从“探针-固相载体膜复合体”上分离，其本质是核酸的变性，即破坏探针核酸和目标核酸之间的杂交，变性成为独立的单链，目标核酸即被洗脱。本领域技术人员根据本领域技术常识可用不同方法及洗脱液对目标核酸进行洗脱，作为示例性的说明，包括但不限于物理方法如在洗脱液中加热至80℃～100℃加热对经富集的核酸文库进行洗脱，化学方法如用pH值10-12的碱性洗脱液对经富集的核酸文库进行洗脱，或物理化学方法的联合使用，如在45摄氏度的0.4M NaOH溶液中洗脱，在100摄氏度0.1％(w/v)SDS溶液中洗脱，作为实施方案之一，进一步用加热至98摄氏度的水或TE缓冲液洗脱，作为另一实施方案之一，进一步用加热至45摄氏度的0.4M NaOH洗脱半小时。本发方法中、所述清洗液的目的主要在于除去与探针核酸杂交不紧密的一些背景噪音，如降低由同源性较低导致的非特异性杂交；而洗脱液目标核酸从探针上洗掉。
本发明方法中，所述步骤3)中所述目标核酸经洗脱后的纯化，通过本领域常规方式纯化，例如Beads、纯化柱，作为实施方案之一，使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)、Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter Company)进行纯化。
本发明方法中，所述步骤4)中，如果富集得到的核酸序列满足于下游测序分析，则可不进行文库的扩增，如果目标核酸的量较少或目标核酸序列不满足测序所要求的序列形式，则需进行PCR扩增或桥式PCR扩增含有目标核酸的核酸文库，进而用于下游测序分析。
本发明方法中，所述步骤4)中所述核酸文库具有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列的特征与上述一致，所述可进行高通量测序是指所述文库可的序列特征符合高通量测序平台所要求的序列特征，本领域技术人员根据本领域技术常识针对不同的测序平台，通过，例如前期设计接头、扩增等方式，实现该平台所要求的序列特征。作为实施方案之一，例如illumina Hiseq2500平台，要求待测序的核酸序列具有核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的序列特征，更进一步来说，核酸接头的序列特征为：P5序列-(标签序列)-测序引物序列-未知序列的插入片段-测序引物序列-标签序列-P7序列。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤4)中的高通量测序平台为illuminaHiseq2500，实现经过富集的含有目标核酸的核酸文库的高通量测序，进行科研和/或临床分析。
本发明方法中，作为实施方案之一，本发明用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，所述方法进一步包括如下：
(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获得含有与目标核酸序列互补或同源的双链核酸文库；
(2)由双链核酸文库制备生成核酸探针文库；
(3)经物理和/或化学方式处理，使转移至并附着在固相载体膜上的核酸探针，与固相载体膜牢固结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；
(4)将预杂交(或未经预杂交的)“探针-固相载体膜复合体”放入杂交液中；
(5)将含有目标核酸的核酸文库变性；
(6)将变性后的含有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列的核酸文库的溶液，加入到含有“探针固相载体膜复合体”的杂交液中，同时加入对富集效率有影响的组分，进行目标核酸的富集；
(7)用清洗液清洗经杂交后的固相载体膜；
(8)从固相载体膜上洗脱并纯化经富集的目标核酸，得到经过富集的含有目标核酸的核酸文库；
(9)扩增(或不经过扩增)所得的目标核酸文库，最终形成具有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列的、能进行高通量测序的核酸文库，将其应用到高通量测序。
本发明方法中，作为实施方案之一，本发明基于固相载体膜富集目标核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取并纯化具有与目标核酸序列互补或高度同源双链核酸文库，该文库可为基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、酶切产物、PCR产物、DNA转录、RNA反转录所得的双链核酸文库；
(2)将所述双链核酸文库制备生成核酸探针文库，若双链核酸片段较长，如超过10kb，则先通过片段化；或若双链核酸片段处于20bp-10kb之间，或通过转录的方式，由双链核酸文库转录生成用于富集目标核酸的核酸探针文库，则可直接进行步骤(9)；
(3)将步骤(2)较长的双链核酸文库通过酶切、超声波等技术手段进行片段化，片段化范围为20bp-10kp；优选150bp-800bp；
(4)若步骤(3)片段化的核酸文库，容易大量获得或不具有危险因素，如从大肠杆菌提取的质粒等，则直接进行步骤(9)；或如分离得到的是病毒DNA，可对步骤(3)中将片段化的核酸文库构建成具有特定可扩增接头核酸序列的核酸文库，以期在后期可大量简单安全地制备；
(5)使用常规构建文库方式对步骤(4)中需要构文库的片段进行片段末端修复补齐，3’端加A尾，5’端加磷酸化基团修饰；
(6)将合成的可形成接头的两条引物退火(作为实施例之一，采用
TGGTGTAACATCATACAGAGCATACGACGACT[SEQ ID NO:1]和
P-GTCGTCGTATGCTCTGTACCACTACACTGCC[SEQ ID NO:2])形成接头，该接头可与步骤(5)中末端修复与修饰的片段连接；
(7)在连接酶的作用下，连接步骤(5)与步骤(6)的产物；
(8)PCR扩增步骤(7)的产物，引物序列(作为实施方案之一，TACAGAGCATACGACGAC[SEQ ID NO:5])与接头序列中互补配对的序列相同，产生双链核酸文库，进行后续核酸探针的制备；
(9)将步骤(8)的双链核酸文库通过加热/骤冷变性或碱变性法变性15分钟，使双链核酸文库成为核酸探针文库；
(10)将包含探针核酸的溶液直接转移到所述固相载体膜上；
(11)将步骤(10)的固相载体膜，放入真空箱中，真空下室温使其自然干燥约40分钟或至干燥，使探针核酸固定至固相载体膜；
(12)将步骤(11)的固相载体膜，在真空箱中，真空状态下80℃烘焙1-2小时，优选1小时，使单链核酸探针与固相载体膜牢固结合；
(13)将步骤(12)的固相载体膜，转移至含有杂交液的杂交瓶中，置于65摄氏度杂交箱中，缓慢旋转进行预杂交，时间取决于所使用的固相载体膜，作为示例性说明，如尼龙膜可以为30分钟，醋酸纤维膜可以为6小时；
(14)在98摄氏度变性含有目标核酸的核酸文库与阻断剂探针，所述核酸文库含有接头序列和或标签核酸序列、具备进行高通量测序的序列特征，所述阻断剂探针是与所述含有目标核酸的核酸文库中的接头序列互补的单链核酸，取出后立即置于冰上，保持核酸变性状态；
(15)将步骤(14)变性后特定核酸文库，转移至步骤(13)的杂交瓶中，在杂交箱中65摄氏度旋转过夜；
(16)将步骤(15)杂交后的固相载体膜，转移至含有10倍于固相载体膜体积的清洗液密封管中，置于63摄氏度杂交箱中，清洗15分钟，共清洗三次；
(17)将步骤(16)清洗三次的固相载体膜，转移至含有500ul 1xTE缓冲液的1.5ml离心管中，置于100摄氏度水浴中，煮沸5分钟，使富集后的DNA洗脱；
(18)将步骤(17)的固相载体膜取出，后将离心管液体置于室温冷却，所得溶液含有所述的经过富集的含有目标核酸的核酸文库；
(19)将步骤(18)的目标核酸纯化，扩增后用于高通量测序的分析。
本发明的有益效果包括如下：
(1)本发明采用通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取大量具有与目标核酸序列互补或高度同源双链核酸文库，所述双链核酸文库通过制备过程，成为本发明中所述的核酸探针文库。与目前市场化的本领域同产品相对比，仅通过已知数据库，分析并选取合适理化性质及固定长度的探针序列后，再通过成本高的矩阵人工合成探针，并加以修饰的方式不同，本发明中，本发明方法中的所述核酸探针可以是核苷酸序列信息全部已知、部分已知或核苷酸序列信息全部未知的核酸探针，并且核酸探针的长度可根据片段化的条件可变，从20bp-10kb均可，因此可产生甚至大于500倍高倍数覆盖、单碱基位移的探针文库，实现对目标核酸的单碱基分辨率。在此单碱基分辨率的基础上，可实现高丰度及高多样性目标文库的富集。最重要的，探针的获得方式是由生物合成方式和/或生物酶促反应获得而来的，可从已有的生物体或核酸分离得到，进而直接制备成核酸探针文库，因此并不需要对探针序列全部已知，这与目前需从已知数据库的已知序列，进而设计探针并合成的制备过程不同。如生物合成方式，通过提取在特定宿主细胞中经生物合成的，具有与目标核酸序列互补或高度同源的双链核酸文库，如基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体及以上各种DNA文库等获得双链核酸文库，后经片段化及变性后成为核酸探针文库，所述核酸探针文库又可以用于富集原宿主细胞内的目标核酸。生物酶促反应通过聚合酶链式反应(PCR)产物、酶切产物、DNA转录、RNA反转录等，利用生物酶如DNA聚合酶、限制性内切酶、反转录酶等模拟细胞内的方式，在体外进行核酸的合成或加工，产生具有与目标核酸序列互补或高度同源的双链核酸文库，如细胞内mRNA反转录生成cDNA后经变性或片段化后变性成为核酸探针文库，该文库又可用于富集原宿主细胞内的外显子区域。或将由生物合成方式得到的双链核酸文库，经构建成为具有特定可扩增核酸接头的文库，再经生物酶促反应制备生成核酸探针文库。
(2)本发明采用固相载体膜富集目标核酸，所述固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、硝酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜和其它以固相载体膜为基础的、通过物理手段或化学处理即可非特异性的牢固结合核酸的膜纸类固相载体。该类固相载体膜不需要进行过度的修饰使其特异性结合特定的核酸修饰基团，因此成本较低。相较于市场主要的试剂盒，通过在单链核酸探针上修饰的生物素，将目标-探针核酸复合物结合于磁珠载体上修饰的链霉素后，后进行富集目标核酸来说，固相载体成本极其低廉。
(3)本发明采用固相载体膜富集目标核酸，由于所述固相载体膜可通过物理手段，如高温加热，非特异性且无方向性的结合并固定核酸探针，因此核酸探针可不必进行基团修饰，相对于目前市场上主要的试剂盒，对核酸探针修饰生物素Biotin来说，进一步降低探针修饰的成本，适于各实验室独立开展，操作过程简单。同时，因为富集过程中，探针量与目标核酸量之间的比例是一个重要技术参数。探针量相较于目标核酸文库的量要高，探针的量越多，所能富集到高多样性目标核酸的概率就越大，这对未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用具有重要意义。而固相载体膜类如尼龙膜和醋酸纤维膜等膜纸类固相载体，均具有较强的核酸吸附能力，如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600微克核酸，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100微克核酸，而市场上评价最高的带正电的尼龙膜，每平方厘米的价格则在0.3元左右，相较于每毫克240元且能结合20微克核酸的beads来说，具有天然载体优势。
(4)本发明采用固相载体膜富集目标核酸并应用到高通量测序，技术过程中，通过物理手段或化学处理使核酸探针非特异性的牢固结合在固相载体膜上，因此在探针结合在载体膜后，不必考虑探针与探针之间互补结合造成的富集效率降低。由于本发明此优点的特殊效果，因此才可通过生物合成方式和/或生物酶促反应来简洁化制备探针，除去不必要的修饰，大幅降低成本。同时还可针对特殊的生物合成方式产生的双链核酸文库，如病毒DNA等，先构建两端具有特定接头片段的核酸文库，在此后的探针制备时，直接通过接头序列作引物，使用生物酶促反应的方法，可安全、快速、大量、便捷和高效的产生大量核酸探针。相较于通过芯片合成探针的方法，成本可降低1000倍左右。
(5)本发明采用固相载体膜富集目标核酸并应用到高通量测序，可降低样本测序成本。基于目前的状况，多数研究与诊断目标只占总体样本的一小部分，例如人外显子组测序，绝大多数已知的疾病相关位点变异存在于外显子上，约占人基因组全长的1％-2％左右。目前测序手段，如果要达到可以分析的水平，对人全基因组测序成本仍然较高，且绝大部分信息对于目前的诊断及研究并无显著意义。因此，通过富集具有绝大多数已知的疾病相关位点变异的外显子组，进而进行测序，可大大降低测序成本。其它类似情况也是如此，如人线粒体基因组信息，感兴趣的宏基因组特定片段信息等。综上，本发明通过所述固相载体膜如尼龙膜或醋酸纤维膜或纤维素纸可对核酸探针进行非特异性结合，使探针固定在固相载体膜上，形成探针：固相载体膜复合物，该步可不需要对核酸探针进行任何修饰。后再通过该复合物，与目标核酸进行杂交，从而将目标核酸从样品中富集。由于可不需要对核酸探针进行修饰，就能使核酸探针固定在固相载体膜上，因此可大幅降低探针的制备成本。
(6)本发明采用固相载体膜富集目标核酸并应用到高通量测序的方法，由于一些临床样本或科研实验的特殊性，比如未知序列的富集测序、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用等，具体如含有突变位点的癌症细胞占总癌症组织细胞的比例较少，如果需要检测到突变位点且达到可分析的程度，则需要在富集过程中，探针具有高覆盖度，以增加富集目标核酸的多样性和测序过程中的高测序深度。而本发明方法中，由于对双链核酸文库的片段化是随机产生，片段化长度可控，因此可产生甚至大于500倍高倍数覆盖、单碱基位移的探针文库，不仅实现对目标核酸的单碱基分辨率，而且在此优势的基础上，可实现高丰度及高多样性目标文库的富集，既可以实现对目标区域核酸的富集，又不丢失极少的突变位点信息，降低高通量测序所需的深度。同时，由于探针制备的独特性，探针序列可以是已知，部分已知或未知序列，因此，提高了在科研及临床分析上的应用范围，如从未知生物提取未知基因组，构建成核酸文库后又可作为探针文库进行样本的直接富集。
(7)在富集过程中，与现有一些富集技术相比，本发明由于固相载体膜的理化性质，可在杂交液中进行16h以上，并且可根据序列同源性调整清洗液的浓度，具有较好的可控性，大幅降低了背景噪音。
(8)本发明所富集的目标核酸，最终将应用于高通量测序服务，通过高通量测序，获得所富集核酸序列的具体信息，具备单碱基观察的能力、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用等，为临床和科研提供更为精准及强有力的服务，与以往的基于固相载体膜杂交并检测所不同。
附图说明
图1：为本发明核酸探针制备和基于固相载体膜富集并的流程图；
图2：实施例1中小鼠7号染色体特定核酸探针文库Track图和富集目标文库前后的Track图；
图3：实施例2中富集后的HBV基因Track图及富集实验结果对比分析；
图4：实施例3中人EGFR基因区域核酸探针文库Track图和富集目标文库前后的Track图。
具体实施方式
以下实施例和/或实验例仅用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
实施例1富集小鼠基因组7号染色体147,029,000-147,172,901序列
一、双链核酸文库的制备：
1.专利申请者拥有RP24-292M18细菌人工染色体(BAC)，所述BAC含有小鼠基因组7号染色体147,029,000-147,172,901序列；
2.过夜摇取10ml转化有RP24-292M18的DH5a的含有氯霉素的LB培养基，通过碱裂解法提取BAC质粒；
3.取5μg BAC溶于100ul 1xTE缓冲液，用超声仪(Bioruptor)使BAC片段化，条件为开30s/关90s,6个循环，所产生片段范围为150bp-800bp；
4.对超声后溶液用QIAquick PCR Purification Kit纯化(Qiagen)，用70μl TE缓冲液进行洗脱；
5.取5μl超声后溶液，加1μl 6x loading Buffer，通过琼脂糖凝胶电泳检验超声后片段大小，大小在150bp-800bp范围内；
6.用
NEBNext End Prep：
3μl NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix
7μl NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer
50μl片段化DNA(750 ng)
混匀，共60μl，20摄氏度水浴，30分钟，65摄氏度水浴，30分钟；
配制接头I：
3.3μl 100μm Adaptor 1-F[SEQ ID NO:1]
3.3μl 100μm Adaptor 1-R
(P-GTCGTCGTATGCTCTGTACCACTACACTGCC[SEQ ID NO:2])
3.4μl无核酶水
混匀后，98摄氏度加热4分钟，取出后置于室温冷却；
接头连接：
混匀后，20摄氏度15分钟；
7.使用AMPure XP Beads对连接产物进行纯化，用30μl无核酶水洗脱，双链核酸文库制备完成；
二、双链核酸文库质量控制：
1.PCR扩增连有接头的DNA，构建illumina Hiseq2500高通量测序文库，进行文库质量验证：
2.配制PCR体系：
混匀，总体积50μl；
3.PCR条件如下：
4.使用AMPure XP Beads对连接产物进行纯化，用30μl无核酶水洗脱；
5.对产物进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；
6.进行高通量测序并分析，其Track见附图2。
三、扩增双链核酸文库用于目标核酸文库的富集：
1.配制PCR体系：
混匀，总体积50μl；
2.PCR条件如下：
3.使用QIAquick PCR Purification Kit纯化(Qiagen)对连接产物进行纯化，用100μl无核酶水洗脱，双链核酸文库扩增完成。
四、单链核酸探针文库的制备：
1.目前步骤三中扩增后的双链核酸文库为双链DNA；
2.使用碱变性法对上述DNA文库进行变性,在室温配制：
24μl 500ng/μl DNA文库
12μl 3M NaCl
1.44μl 10N NaOH
3.室温放置15分钟，所得即为单链核酸探针文库。
五、转移单链核酸探针至固相载体膜，使探针与带正的电尼龙膜牢固结合：
1.用剪刀裁剪约0.3cm2带正电荷的尼龙膜(NG0312，RPN3038，GE)；
2.用移液枪转移步骤四中，经变性后含有单链核酸探针的溶液至尼龙膜上；
3.将尼龙膜转移至真空箱内，在真空环境下室温干燥40分钟或至尼龙膜干燥；
4.取出尼龙膜，用两张滤纸(Whatman 3 MM paper)上下包夹尼龙膜；
5.将尼龙膜转移至真空箱内，温度调至80摄氏度，在真空环境下对尼龙膜烘焙1小时，使单链核酸探针与尼龙膜牢固结合。
六、变性含有目标核酸的特定核酸文库：
1.所述含有目标核酸的特定核酸文库为专利申请人所在实验室，用小鼠胚胎干细胞所构建的可直接用于illumina Hiseq 2500高通量测序的小鼠全基因组文库，其中包含小鼠基因组7号染色体147,029,377-147,172,487序列；
2.配制含有Blocker的特定核酸文库：
3.混匀后置于98摄氏度加热5分钟，使文库双链核酸变性成单链；
4.取出后立即置于冰上，使核酸保持单链状态。
七、目标核酸的富集：
1.配制杂交液：
混匀至澄清；
2.将步骤五中，单链核酸探针牢固结合的带正电尼龙膜置于含有1毫升杂交液的密封小瓶中，将小瓶置于65摄氏度杂交箱内，预杂交半小时，后更换新鲜杂交液并预热至65摄氏度；
3.将步骤六中，变性后的含有Blocker的特定核酸文库，转移至含有尼龙膜与杂交液的密封小瓶中，65摄氏度杂交24小时；
4.配制清洗液：
磷酸钠缓冲液0.04M
SDS 1.6％
混匀至澄清，预热至63摄氏度；
5.将尼龙膜转移至含有20毫升预热的清洗液的50毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟，共清洗三次；
7.将清洗三次后的尼龙膜，转移至含有500微升TE缓冲液的1.5毫升离心管中；
8.加热1.5毫升离心管至98摄氏度，对富集后的核酸进行洗脱，5分钟后将尼龙膜取出，剩余溶液冷却至温室。
八、对富集后的目标核酸扩增建库并测序验证富集效率：
1.将步骤七中含有目标核酸的剩余液体进行纯化(QIAquick PCR PurificationKit)，用30μl TE缓冲液进行洗脱；
2.配制PCR体系：
混匀，总体积50μl；
3.PCR条件如下：
4.对PCR产物进行纯化(QIAquick PCR Purification Kit)，用30μl无核酶水进行洗脱；
5.对产物进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；
6.进行高通量测序并分析，其Track见附图2；
7.富集后的区域测序reads数占总测序reads比例相较于未富集的测序reads数占总测序reads比例，提高了120倍，且富集后的区域测序所得的91,992条reads中，有35,275条reads为序列不同的reads，表明其高复杂度。实施例2：富集肝细胞癌患者组织切片中的HBV基因组
一、双链核酸文库的制备：
1.专利申请者拥有含有Hepatitis B virus isolate FEN94序列的质粒，该质粒包含HBV基因组序列。
2.过夜摇取10ml转化有Hepatitis B virus isolate FEN94质粒的DH5a的含有氨苄的LB培养基，通过质粒小提试剂盒(QIAGEN Plasmid Mini Kit，Cat.no.12125)提取质粒；
3.用超声仪(Bioruptor)使含有HBV基因组的质粒(40μg/100μl TE溶液)片段化，条件为On 30s/Off 90s,6cycles，所产生片段范围为150bp-800bp；
4.取2μl超声后溶液，加3μl水和1μl 6x loading Buffer，通过琼脂糖凝胶电泳检验超声后片段大小，大小在150bp-800bp范围内；
二、单链核酸探针的制备：
1.目前步骤一中片段化的双链核酸文库为双链DNA；
2.使用加热瞬冷变性法对上述DNA文库进行变性,在室温取：
15μl 400ng/μl DNA文库，共6μg
3.煮沸5分钟，后瞬间放入冰中，所得即为单链核酸探针。
三、转移单链核酸探针至固相载体膜，使探针与醋酸纤维薄膜牢固结合：
1.用剪刀裁剪约0.5cm2醋酸纤维薄膜(NG0312，RPN3038，GE)；
2.用移液枪转移步骤二中，经变性后含有单链核酸探针的溶液至醋酸纤维薄膜上；
3.将醋酸纤维薄膜转移至真空箱内，在真空环境下室温干燥40分钟或至醋酸纤维薄膜干燥；
4.取出醋酸纤维薄膜，用两张滤纸(Whatman 3MM paper)上下包夹醋酸纤维薄膜；
5.将醋酸纤维薄膜转移至真空箱内，温度调至80摄氏度，在真空环境下对醋酸纤维薄膜烘焙2小时，使单链核酸探针与醋酸纤维薄膜牢固结合。
四、变性含有目标核酸的特定核酸文库：
1.所述含有目标核酸的特定核酸文库为专利申请人所在实验室所构建的基于Hiseq2500测序平台的文库。样本DNA来源于肝细胞癌患者(血液中HBV-DNA阳性)，通过从该患者肝细胞癌组织切片中提取DNA后，构建成文库。
2.配制含有Blocker的特定核酸文库：
3.混匀后置于98摄氏度加热5分钟，使文库双链DNA变性成单链；
4.取出后立即置于冰上，使DNA保持单链状态。
五、目标DNA的富集：
1.配制杂交液：
混匀至澄清；
2.将步骤三中，单链核酸探针牢固结合的醋酸纤维薄膜置于含有1毫升杂交液的杂交瓶中，将杂交瓶置于65摄氏度杂交箱内，预杂交三小时，后更换新鲜杂交液并预热至65摄氏度；
3.将步骤四中，变性后的含有Blocker的特定核酸文库，转移至含有醋酸纤维薄膜与杂交液的杂交瓶中，65摄氏度杂交24小时；
4.配制清洗液：
磷酸钠缓冲液0.04M
SDS 1.6％
混匀至澄清，预热至63摄氏度；
5.将醋酸纤维薄膜转移至含有20毫升预热的清洗液的50毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟，共清洗三次；
6.将清洗三次后的醋酸纤维薄膜，转移至含有500微升TE缓冲液的1.5毫升离心管中；
7.加热1.5毫升离心管至98摄氏度，对富集后的核酸进行洗脱，5分钟后将醋酸纤维薄膜取出，剩余溶液冷却至温室。
六、对富集后的目标DNA扩增建库并测序分析整合于人基因组的HBV基因组：
1.将步骤五中含有目标DNA的剩余液体进行纯化(QIAquick PCR PurificationKit)，用30μl TE缓冲液进行洗脱；
2.配制PCR体系：
混匀，总体积50μl；
3.PCR条件如下：
4.对PCR产物进行纯化(QIAquick PCR Purification Kit)，用30μl无核酶水进行洗脱；
5.对产物进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；
6.进行高通量测序并分析，其Track及对比分析结果见附图3；
实施例3：富集并测序人EGFR基因
一、双链核酸文库的制备：
1.专利申请者拥有RP11-116H11和RP11-65D21细菌人工染色体(BAC)，所述BAC覆盖人基因组(hg19)7号染色体55,034,601-55,343,001序列，该区域包含EGFR基因(chr7:55,086,725-55,275,031)；
2.分别过夜摇取200ml转化有RP11-116H11和RP11-65D21的DH5a的含有氯霉素的LB培养基，通过碱裂解法提取BAC质粒；
2.取20μg RP11-116H11BAC和20μg RP11-65D21BAC分别溶于100ul1xTE缓冲液，用超声仪(Bioruptor)使BAC片段化，条件为On 30s/Off 90s,6cycles，所产生片段范围为150bp-800bp；
3.对超声后溶液用QIAquick PCR Purification Kit纯化(Qiagen)，分别用70μlTE缓冲液进行洗脱；
4.分别取5μl超声后溶液，加1μl 6x loading Buffer，通过琼脂糖凝胶电泳检验超声后片段大小，大小在150bp-800bp范围内；
二、单链核酸探针的制备：
1.目前步骤一中双链核酸文库为双链DNA；
2.使用碱变性法对上述DNA文库进行变性,在室温配制：
3.室温放置15分钟，所得即为单链核酸探针。
三、转移单链核酸探针至固相载体膜，使探针与中性尼龙膜牢固结合：
1.用剪刀裁剪约0.5cm2中性尼龙膜；
2.用移液枪转移步骤二中，经变性后含有单链核酸探针的溶液至尼龙膜上；
3.将尼龙膜转移至真空箱内，在真空环境下室温干燥40分钟或至尼龙膜干燥；
4.将尼龙膜转移至紫外辐照仪，在254-nm的波长下照射5分钟，使单链核酸探针与尼龙膜牢固结合。
四、变性含有目标核酸的核酸文库：
1.所述含有目标核酸的特定核酸文库为专利申请人所在实验室所构建的基于Hiseq2500测序平台的文库。样本DNA来源于肺癌患者，通过从患者的肺癌组织提取DNA后，构建成文库。
2.通过PCR扩增样本文库，通过AMPure XP Beads纯化并使用NanoDrop检测浓度后，调整浓度至50ng/μl；
3.配制含有Blocker的特定核酸文库：
3.混匀后置于98摄氏度加热5分钟，使文库双链DNA变性成单链；
4.取出后立即置于冰上，使DNA保持单链状态。
五、目标核酸的富集：
1.配制杂交液：
5x柠檬酸钠缓冲液(SSC)，5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS，混匀至澄清；
2.将步骤三中，单链核酸探针牢固结合的尼龙膜，置于含有1毫升预热至65摄氏度的杂交液的杂交瓶中，预杂交半小时，后更换新鲜杂交液并预热至65摄氏度；
3.将步骤四中，变性后的含有Blocker的特定核酸文库，转移至含有尼龙膜与杂交液的杂交瓶中，65摄氏度杂交24小时；
4.配制清洗液I和清洗液II：
清洗液I：2％SSC/0.1％(w/v)SDS
清洗液II：0.2％SSC/0.1％(w/v)SDS混匀至澄清，预热至63摄氏度；
5.将尼龙膜转移至含有20毫升预热的清洗液I的50毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟；
6.将清洗第一次后的尼龙膜，转移至新的含有20毫升预热的清洗液I的50毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟；
7.将清洗第二次后的尼龙膜，转移至新的含有20毫升预热的清洗液II的50毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟；
8.将清洗三次后的尼龙膜，转移至含有500微升TE缓冲液的1.5毫升离心管中；
9.加热1.5毫升离心管至98摄氏度，对富集后的核酸进行洗脱，5分钟后将尼龙膜取出，剩余溶液冷却至温室。
六、对富集后的目标核酸文库扩增建库并测序：
1.将步骤五中含有目标核酸的剩余液体进行纯化(QIAquick PCR PurificationKit)，用30μl TE缓冲液进行洗脱；
2.配制PCR体系：
混匀，总体积50μl；
3.PCR条件如下：
4.对PCR产物进行纯化(QIAquick PCR Purification Kit)，用30μl无核酶水进行洗脱；
5.对产物进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；
6.进行高通量测序并分析，其Track见附图4。
