用于转基因成分富集提取的基因芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于转基因成分富集提取的基因芯片及其制备方法。
背景技术
转基因产品是由细胞DNA中经非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，以获得某种良好性状的动、植物或微生物制成的产品。近年来转基因产品日益成为备受社会关注的热点。因此转基因产品的检测鉴定也愈加重要，以保护消费者的知情权和选择权。然而转基因产品往往从外观感受及理化指标等方面与非转基因产品无明显差异，在这种情形下，如果不经过专业的检测，普通消费者几乎不可能区分转基因产品与非转基因产品。
在转基因成分检测方法中，基于核酸(DNA)的检测方法是最直接的转基因成分检测方法，可以直接从基因层面检测鉴定产品是否为转基因。当前基于核酸的检测方法基本为PCR检测方法。根据特异性的不同又可以分为筛查法、基因特异性检测法、物种特异性检测法、转化事件特异性检测法等。筛查法检测样品中是否含有转基因成分，通过对转基因产品中的通用元件(包括启动子、终止子和标记基因)进行检测以确定产品是否是转基因。最常见的通用元件有CaMV35S启动子、NOS终止子及报告基因NPT-Ⅱ。基因特异性检测法检测样品中含有何种基因，可以知道转入的外源基因是什么。物种特异性检测法通过检测物种特有的内标基因检测样品成分来自何种生物，例如检测出大豆特有的内标基因lectin基因表明含有大豆成分，检测出玉米特有的zein基因则表明含有玉米成分。转化事件特异性检测法检测样品中是否含有特定转基因品种成分。这一方法根据外源基因插入位点的唯一性，通过检测外源基因的侧翼序列鉴定转化体属于何种品系。然而，基于核酸(DNA)的PCR检测方法需要PCR扩增过程、克隆过程、洗脱过程等复杂步骤，需要复杂昂贵的专业技术设备和专业技术人员才能完成。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于转基因成分富集提取的基因芯片，以采用连接臂与电场加速相结合来提高转基因成分杂交的效率和杂交速度，相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间；随后通过DNA变性使杂交结合的转基因成分与捕获探针脱离，在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面，显著地提高了芯片的工作效率。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种用于转基因成分富集提取的基因芯片的制备方法，包括步骤：建立转基因信息数据库；转基因信息数据库的信息包括：目的基因序列信息和通用元件信息；根据目的基因序列信息和通用元件信息制备转基因成分捕获探针；设计连接臂分子，将连接臂分子和探针分子的5’端连接；对固相基片表面进行处理，制成电极基片；通过连接臂末端的连接分子，固定转基因成分捕获探针在固相基片表面上，得到用于转基因成分富集提取的基因芯片。
优选地，若制备的基因芯片是只针对某一种特定转基因产品的特异型转基因成分富集提取的基因芯片，转基因信息数据库的信息包括：特定转基因产品所转的目的基因和/或获得该特定转基因产品所用的通用元件；若制备的基因芯片是针对所有转基因产品的通用型基因成分富集提取的基因芯片，转基因信息数据库的信息包括：当前转基因产品所转的所有的目的基因和/或当前转基因产品所用到的所有通用元件。
优选地，通用元件包括启动子、终止子和标记基因。
优选地，转基因成分捕获探针是寡核苷酸、cDNA序列和其他PCR产物中的一种或多种。
优选地，固相基片是塑料材质或玻璃材质。
优选地，连接臂分子包括15～30个功能基团长度。
优选地，功能基团选自聚胸腺苷酸(Poly T)、聚腺苷酸(Poly A)、聚胞苷酸(Poly C)、聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)、胞嘧啶与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、胞嘧啶与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体、胞嘧啶与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、胞嘧啶与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨和聚硫酸酯中的一种或多种。
优选地，固相基片的表面附着有金属层，金属层表面再覆盖琼脂糖层。
优选地，琼脂糖是以链亲和素标记的琼脂糖。
本发明还保护根据上述方法制备得到的用于转基因成分富集提取的基因芯片。
本发明所阐述的转基因成分提取芯片是一种特别的核酸提取芯片(另有专利保护)，专门用以捕获提取样品中转基因成分，以便实现转基因简单鉴定技术(另有专利保护)。对于转基因样品，其中的转基因成分主要可以分为两种：一种是所转的目的基因，另一种是转基因产品中的通用元件(包括启动子、终止子和标记基因)进行检测以确定产品是否是转基因。最常见的通用元件有CaMV35S启动子、NOS终止子及报告基因NPT-II等。通过与本发明所阐述的转基因成分提取芯片上的探针分子互补杂交可以简便、高效地将样品中的转基因成分捕获富集用于后续的处理。
转基因成分提取芯片与传统基因芯片一样可应用玻璃芯片或上述金属、陶瓷、塑料、硅等其他固相载体。由于玻璃芯片易碎且包被的有机薄膜容易脱落，致使探针分子不稳定。而转基因成分提取芯片需要多次重复使用，要求芯片上的探针分子性质稳定，不易脱落。而较传统的玻璃材料核酸芯片，由于塑料与包被层吸附性好，则与包被层紧密结合的探针分子不易脱落，性质稳定。同时塑料芯片不易破碎，可靠耐用，且价格低廉，所以塑料基片比玻璃基片更加适宜用于制备转基因成分提取芯片。由于转基因成分提取芯片不以检测分析为目的，探针在芯片上所在位置并不重要。因此可以不需要采用点样等方式而将探针分子均匀地喷涂在芯片的固相载体上，从而不但提高了芯片上的杂交面积及探针数量而且显著地降低芯片生产成本。
对于转基因成分提取芯片的使用，探针分子与目标转基因成分的杂交的效率高低和杂交时间长短至关重要。为此，首先在探针分子与芯片片基间加入适当长度的连接臂可大大提高杂交效率。连接臂将固相化的探针分子与支持物隔开一定的距离，可以为探针提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行。连接臂越长，杂交效率越髙。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨、聚硫酸酯和其组合物。
此外为进一步缩短杂交时间，转基因成分提取芯片采用在杂交位点引入电场以提高杂交速度。美国Nanogen公司是在芯片上1mm2的杂交位点上制作有微电极阵列引入电场，采用能量传导的荧光信号检测。这一技术虽然极大地缩短了杂交时间，但芯片制备复杂，制作成本高。而转基因成分提取芯片的制备技术不同于美国Nanogen公司的技术，由于转基因成分提取芯片不要求确定探针杂交位点，因此转基因成分提取芯片可以将整个芯片基片做成电极引入电场。方法是先在塑料或玻璃等基片上附着上一层金属做成电极，其上再覆以链亲和素标记的琼脂糖。在电场的作用下生物素标记的探针分子可快速地结合到基片电极上方的琼脂糖上制备成芯片。在使用芯片富集提取核酸时同样引入电场使提取芯片带正电荷，待提取的带负电荷的DNA分子在电场的作用下快速泳动并浓缩结合于芯片上快速完成杂交。在杂交完成后，通过改变电场方向使提取芯片带负电荷、可将未杂交的样品DNA从芯片上“洗”去，选择适当的电场强度就可以使非特异杂交的DNA与未杂交的探针选择性地分开除去，而保留完全杂交的DNA分子。由于电场的这种浓缩和选择特性，使得该方法有很高的灵敏度和特异性，最为显著的是它使原来数小时的杂交反应缩短到二三十秒钟。之后通过DNA变性使杂交结合的目标转基因成分与捕获探针脱离，在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面。
转基因成分提取芯片可以分为2种类型：(1)只针对某一种特定转基因产品的特异型转基因成分提取芯片；芯片上的探针为特定转基因产品所转的目的基因和/或获得该特定转基因产品所用的启动子、终止子和标记基因等。(2)针对所有转基因产品的通用型转基因成分提取芯片；芯片上的探针为当前转基因产品所转的所有的目的基因和/或当前转基因产品所用到的所有的通用元件，包括启动子、终止子和标记基因等。
本发明关键技术点和保护点包括但不限于：转基因成分提取芯片作为一种独特的以转基因成分的捕获提取为目的的新型基因芯片的提出；转基因成分提取芯片采用喷涂的方式将探针分子均匀地固定在芯片载体上的制备方法；转基因成分提取芯片采用连接臂与电场加速相结合，来提高核酸杂交的效率和杂交速度的技术；转基因成分提取芯片通过在基片上附着上一层金属做成电极以引入电场的方法。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明所阐述的转基因成分提取芯片应用于转基因产品中的转基因成分的捕获提取。通过与富集提取芯片上的捕获探针分子互补杂交简便、高效地将样品中的转基因成分捕获富集用于后续的处理。
(2)本发明所阐述的转基因成分提取芯片，采用塑料基片，相比于基因芯片常用的玻璃基片不易破碎，更加可靠耐用，且价格更加低廉，更被市场所接受。
(3)本发明所阐述的转基因成分提取芯片，采用喷涂的方式将探针分子均匀地固定在芯片载体上，比起目前基因芯片常用的制备方法，不但提高了芯片上的杂交面积及探针数量而且显著地降低芯片生产成本。
(4)本发明所阐述的转基因成分提取芯片，采用连接臂与电场加速相结合来提高核酸杂交的效率和杂交速度，相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间。
(5)本发明所阐述的转基因成分提取芯片，通过控制电场方向与强度来实现杂交时转基因成分与捕获探针的加速结合，以及随后转基因成分与捕获探针解脱时的加速释放，显著地提高了芯片的工作效率。
(6)本发明所阐述的转基因成分提取芯片，通过在塑料或玻璃等基片上附着上一层金属做成电极以引入电场；与已有的在芯片上1mm2的杂交位点上制作有微电极阵列引入电场的技术相比，制备工艺简单，制作成本低廉。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的用于转基因成分富集提取的基因芯片的结构示意图；
图2为本发明实施例中的用于转基因成分富集提取的基因芯片在富集转基因成分的过程示意图。
附图标记：
1-探针；2-固相基片；3-连接臂；4-转基因成分；5-其他核酸。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种用于转基因成分富集提取的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1：建立转基因信息数据库；转基因信息数据库的信息包括：目的基因序列信息和通用元件信息；通用元件包括启动子、终止子和标记基因。
其中，若制备的基因芯片是只针对某一种特定转基因产品的特异型转基因成分富集提取的基因芯片，转基因信息数据库的信息包括：特定转基因产品所转的目的基因和/或获得该特定转基因产品所用的通用元件；
若制备的基因芯片是针对所有转基因产品的通用型基因成分富集提取的基因芯片，转基因信息数据库的信息包括：当前转基因产品所转的所有的目的基因和/或当前转基因产品所用到的所有通用元件。
S2：根据目的基因序列信息和通用元件信息制备转基因成分捕获探针，转基因成分捕获探针是寡核苷酸、cDNA序列和其他PCR产物中的一种或多种。
S3：设计包括15～30个功能基团长度的连接臂分子，将连接臂分子和探针分子的5’端连接；其中，功能基团选自聚胸腺苷酸(Poly T)、聚腺苷酸(Poly A)、聚胞苷酸(Poly C)、聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)、胞嘧啶与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、胞嘧啶与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体、胞嘧啶与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、胞嘧啶与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨和聚硫酸酯中的一种或多种。
S4：对塑料材质或玻璃材质固相基片表面进行处理，在固相基片的表面附着有金属层，然后在金属层表面覆盖以链亲和素标记的琼脂糖层，制成电极基片。
S5：通过连接臂末端的连接分子，固定转基因成分捕获探针在固相基片表面上，得到用于转基因成分富集提取的基因芯片。
下面结合具体实施例对本发明提供的用于转基因成分富集提取的基因芯片作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种用于只针对某一种特定转基因产品的特异型转基因成分富集提取的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1：建立转基因信息数据库；转基因信息数据库的信息包括：特定转基因产品所转的目的基因和获得该特定转基因产品所用的通用元件；通用元件包括启动子、终止子和标记基因。
S2：根据目的基因序列信息和通用元件信息制备转基因成分捕获探针，转基因成分捕获探针是cDNA序列。
S3：设计包括25个功能基团长度的连接臂分子，将连接臂分子和探针分子的5’端连接；其中，功能基团含有胞嘧啶与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、胞嘧啶与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体、胞嘧啶与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、胞嘧啶与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胸腺苷酸(Poly T)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚腺苷酸(Poly A)的嵌合体。
S4：对塑料材质或玻璃材质固相基片表面进行处理，在固相基片的表面附着有金属层，然后在金属层表面覆盖以链亲和素标记的琼脂糖层，制成电极基片。
S5：通过连接臂末端的连接分子，固定转基因成分捕获探针在固相基片表面上，得到用于只针对某一种特定转基因产品的特异型转基因成分富集提取的基因芯片。
实施例二
本实施例提供一种针对所有转基因产品的通用型基因成分富集提取的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1：建立转基因信息数据库；转基因信息数据库的信息包括：当前转基因产品所转的所有的目的基因和当前转基因产品所用到的所有通用元件；通用元件包括启动子、终止子和标记基因。
S2：根据目的基因序列信息和通用元件信息制备转基因成分捕获探针，转基因成分捕获探针是寡核苷酸。
S3：设计包括15个功能基团长度的连接臂分子，将连接臂分子和探针分子的5’端连接；其中，功能基团含有聚胸腺苷酸(Poly T)、聚腺苷酸(Poly A)、聚胞苷酸(Poly C)、聚乙烯乙二醇与聚胞苷酸(Poly C)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚鸟嘌呤苷酸(Poly G)的嵌合体。
S4：对塑料材质或玻璃材质固相基片表面进行处理，在固相基片的表面附着有金属层，然后在金属层表面覆盖以链亲和素标记的琼脂糖层，制成电极基片。
S5：通过连接臂末端的连接分子，固定转基因成分捕获探针在固相基片表面上，得到针对所有转基因产品的通用型基因成分富集提取的基因芯片。
本发明实施例一和实施例二制备得到的用于转基因成分富集提取的基因芯片，通过控制电场方向与强度，来实现杂交时目标转基因成分与捕获探针的加速结合，相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间；随后通过DNA变性使杂交结合的转基因成分与捕获探针脱离，在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面，显著地提高了芯片的工作效率。
需要说明的是，转基因简单鉴定技术(另有专利保护)为基于核酸的转基因检测鉴定提供了一种简便、实时、快速、不需要PCR扩增的转基因产品检测技术，可以以“傻瓜模式”使非专业人员也可实现。转基因简单鉴定技术基于简单基因测序技术(另有专利保护)的原理，通过利用一种独特的基因芯片即核酸富集提取芯片(另有专利保护)来实现目的基因的捕获提取，以便用于后续的处理。
需要说明的术语如下。基因：是携带生物个体所有遗传信息的DNA片段，是控制生物个体可能不同于其他生物个体的形态、生理、生化和行为等性状的基本遗传单位。
基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)：是指固着在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将已知序列的靶基因或寡核苷酸片段作为核酸探针有序地、高密度排列在玻璃、硅等载体上，称为基因芯片。基因芯片现主要用于基因检测目的，将标记的样品DNA分子与芯片上的核酸探针进行杂交并通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。本发明中所阐述的转基因提取检测芯片所采用的样品-探针杂交匹配原理与常规应用的基因检测芯片的原理相同但用于目的基因的捕获富集。
启动子(Promoter)：是基因的一个组成部分，是一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(DNA)序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸(RNA)合成中，启动子可以和决定转录开始的转录因子相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度，从而决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
终止子(Terminator)：在转录过程中，提供转录终止信号的DNA序列，在RNA水平上通过转录出来的终止子序列形成茎—环结构而起作用。
标记基因：是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否。在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。
DNA分子杂交：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。
DNA变性：是指DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变(如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)。加热、改变DNA溶液的pH值、或受有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影响，均可使DNA变性。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
