用于检测并治疗低毒力感染的方法
优先权
本申请要求2015年7月24日提交的美国临时申请号62/196,508的优先权益，所述临时申请特此以引用的方式整体并入。
背景
人体是数千种微生物物种与人体连续相互作用的超机体。截至2014年3月，基因组在线数据库列出在人体中检测到的2,723个完成并公布的细菌基因组，至少14,867个在进展中。研究揭示数千种先前未知的微生物存在于人类组织和血液中。事实上，聚细菌和慢性病原体甚至在先前认为无菌的环境中被检测到。因此，一系列物理和神经炎性疾病现在被认为与微生物组成的改变相关联。例如，证据表明共生细菌诸如痤疮丙酸杆菌(P.acnes)(人类皮肤的正常居住者)可能负责低毒力感染，包括与慢性腰痛和椎间盘疾病相关联的低毒力感染。
一些病原体(包括共生病原体)可通过培养或分子技术(诸如PCR)在生物组织中检测。然而，绝大部分微生物不可在用于诊断目的的标准条件下培养。此外，如果疑似病原体是在某些宿主病原体中无处不在的共生微生物，则由于样品污染将存在不可接受的高比率的假阳性，当使用分子检测测定时尤其如此。
本发明提供用于包括通过将真实感染与假阳性区分开来识别低毒力感染(例如，由共生病原体引起的感染)的方法，从而支持可靠的且成本有效的医疗护理。本发明还提供用于治疗低毒力感染，包括与椎间盘疾病或慢性腰痛相关联的感染的方法。本发明的其他目标将根据以下详细描述而是显而易见的。
发明概述
在一方面，本发明提供用于通过确定患者样品中的共生病原体的存在和通过将由共生微生物引起的慢性感染的情况与假阳性区别开(例如，将感染与由共生微生物区系引起的样品的污染区分开)来识别低毒力感染的方法。这些实施方案中的本发明可用于诊断低毒力感染，诸如椎间盘的感染。例如，通过微生物学培养、DNA分析、免疫化学、和显微镜检查法中的一种或多种测试共生微生物区系的阳性的样品针对宿主细胞RNA标志进行评估以排除假阳性(从而确认低毒力感染)。外科医生或主治医生然后可针对识别为患有低毒力感染的患者施用适当治疗。
在其他方面，本发明提供(在高敏感性和特异性的情况下)将对于低毒力感染(例如，由痤疮丙酸杆菌引起)是阳性的样品与对于低毒力感染是阴性的样品区分开的miRNA标志。这些测试可与来自分子测定、微生物培养和样品显微镜检查法的分析组合来区别假阳性，或者在一些实施方案中可独立地用于识别阳性样品。痤疮丙酸杆菌感染的示例性miRNA分数可通过对miR-29a-3p和miR-574-3p的相对表达水平进行评分来确定。基于以下式的诊断性miRNA分数(DMS)实现验证研究的95％准确性，其中阳性样品具有小于或等于-0.01的分数：DMS＝18.71–11.24*log10(miR-29a-3p)+10.4*log10(miR-574-3p)。
其他RNA标志可从对于痤疮丙酸杆菌(或其他共生微生物)是阳性的或丰富的样品和测试对于痤疮丙酸杆菌是阴性的(或非丰富的)样品的RNA图谱来训练。例如，样品可基于通过定量PCR和至少另一种技术(诸如微生物培养、免疫化学、或光谱法)进行的共生微生物的检测(或检测水平)来分箱。
在各种实施方案中，诊断性测试使用样品中的宿主细胞的编码RNA和/或非编码RNA的图谱来将低毒力感染与非感染样品(并且在一些实施方案中与假阳性)区别开。宿主组织的RNA图谱(例如，mRNA或miRNA图谱)能够区别慢性低毒力感染，即使这些低级感染仅导致局部水平上的微小炎性应答。
本发明可应用到手术样品以指导手术后医疗护理，或者可应用到生物活检样品以指导手术前治疗，和/或通过治疗低毒力感染来潜在地减少对于更具侵入性的过程的需要。
在另一方面，本发明提供用于治疗低毒力感染的方法。在各种实施方案中，所述方法包括使用全身性地施用的抗生素或使用局部地施用的抗生素或抗菌剂来治疗低毒力感染。低毒力感染可根据本文所述的方法来识别。
本发明的其他方面和实施方案将根据以下详细描述而是显而易见的。
附图描述
图1提供退变性椎间盘疾病的图示。
图2是本发明的实施方案的流程图，其中患者被安排进行椎间盘手术，并且椎间盘样品取自手术部位。在样品上实施诊断性测试(诸如PCR测定)以检测样品中的共生病原体的存在或不存在或对其进行定量。在样品对于共生病原体是阳性的情况下，实施miRNA图谱以将真实感染与假阳性(污染)区别开。在确认低毒力感染的情况下，建议对患者进行另外的治疗，诸如口腔、静脉内、或椎间抗生素、局部抗菌剂治疗、或另外的手术治疗。
图3是人类脊椎和椎间盘(IVD)的示意图。(a)腰椎的横向视图。(b)部分地去除AF骨板层的从前角观察的IVD。(c)在指示典型运动的坐标系中的由两个相邻的脊椎和居中的IVD组成的脊柱节段。
图4示出在痤疮丙酸杆菌阳性和阴性椎间盘组织中不同地表达的微小RNA的归一化表达水平：miR-574-3p、miR-29a-3p、miR-497-5p、miR-29c-3p、以及miR-99b-5p。
图5示出针对参考痤疮丙酸杆菌阳性和阴性病例计算的诊断性miRNA分数(DMS)值。痤疮丙酸杆菌阳性的截留DMS值是-0.01(左图)。DMS值的ROC分析显示DMS区分具有丰富痤疮丙酸杆菌的病例(培养和实时PCR)和阴性病例的强能力(右图)。
图6示出针对参考痤疮丙酸杆菌阳性和阴性病例的独立验证计算的DMS值(左图)。DMS值的ROC分析显示DMS区分具有丰富痤疮丙酸杆菌的病例(培养和实时PCR)和阴性病例的强能力(右图)。
图7示出对于凝固酶阴性葡萄球菌具有阳性培养的椎间盘组织具有痤疮丙酸杆菌阴性样品的DMS值特征(DMS>-0.01)。
图8示出在具有丰富的痤疮丙酸杆菌的椎间盘组织中失调的miRNA的序列。
发明详述
在一方面，本发明提供一种用于例如通过将真实感染与非感染样品(包括与假阳性和假阴性)区分开来检测患者中的低毒力感染的方法。在一些实施方案中，所述方法包括针对患者样品中的共生微生物的存在或量进行测试。因为针对共生微生物进行的测试由于频繁的样品污染将导致大量的假阳性，所以也对样品进行测试来将真实慢性感染与这些假阳性区别开。根据本发明，假阳性通过评估来自样品的RNA图谱(编码RNA或非编码RNA的RNA图谱)诸如mRNA图谱或小RNA(例如，miRNA)图谱来进行区别。如本文所述，宿主组织/细胞的RNA图谱能够区别慢性低毒力感染，即使这些低级感染仅导致局部水平上的微小炎性应答。
如本文所用的术语，低毒力感染是与共生微生物相关联的慢性低级感染。示例性共生微生物包括可在宿主组织样品中分子地检测或通过实验室培养确定的共生生物体中的任一种，并且包括但不限于丙酸杆菌属(P.acnes)、葡萄球菌属(例如，凝固酶阴性葡萄球菌或金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、肠球菌属、链球菌属(例如，肺炎链球菌)、芽孢杆菌属(蜡质芽孢杆菌)、柠檬酸杆菌属、大肠杆菌、莫拉菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、梭状芽孢杆菌属、肠杆菌属、以及克雷伯氏菌属。在一些实施方案中，所述共生微生物是可培养性较差的或不可培养的。在一些实施方案中，所述微生物具有生物膜形成表型。
在一些实施方案中，所述方法包括检测或定量患者样品中的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)。痤疮丙酸杆菌是形成皮肤、口腔和胃肠道和泌尿生殖道的正常驻留微生物丛的部分的革兰氏阳性兼性厌氧菌。它是与广泛范围的感染和病状关联的机会致病菌，所述感染和病状包括植入物感染、关节盘炎、肌骨骼病状(例如，骨炎、骨髓炎、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨炎(SAPHO)综合征)、结节病、慢性前列腺炎、以及前列腺癌。
在一些实施方案中，所述方法包括确定样品的微生物组成，包括确定样品中的共生和/或病原微生物的相对丰度或绝对丰度。样品的微生物组成可例如通过rRNA测序(例如，16S rRNA测序)确定。
低毒力感染可以是致病的或者是多种慢性病状中的任一种的因子。本发明适用于疑似低毒力感染的任何慢性病状。因此，在一些实施方案中，患者患有选自以下的病状：慢性腰痛(CLBP)、关节或软骨炎症、与植入物或假体相关联的炎症、心内膜炎、潜在感染的静脉内端口系统、或胃溃疡。患者可以是人类或动物患者。通常，样品是手术样品或疑似低毒力感染的发炎或受损组织的活组织检查物。在一些实施方案中，样品来自易受厌氧共生细菌的集群或感染影响的部位。
在一些实施方案中，患者患有慢性腰痛，并且其与结构性椎间盘损伤和/或低毒力感染一致。在一些实施方案中，患者可以是椎间盘手术的候选人并且可被安排进行椎间盘手术。患有低毒力感染的患者可具有发展CLBP的增加的风险和/或可成为“失败背部手术”患者，除非正确地诊断并且适当地治疗。例如，经历椎间盘手术的一些患者在使其手术成为必要的急性病状之前还患有CLBP。同样，经历椎间盘手术的某一比例(大约5％至10％)的患者在跟踪中发展CLBP，其有时称为“失败背部手术”患者或“椎间盘切除术后综合征”。这些病状在统计上与低毒力感染相关联。
关节盘炎可非常快地变为临床上明显的并且通过适当的诊断性措施相当容易地诊断，或者成为“低级”、“蔓延性”感染，它可能及其难以与也可导致脊柱疼痛的某些退变性过程区分开。在第一种情况下，将引起具有明显的局部和全身性症状的所谓的“化脓性感染”。此“高级”感染频繁地引起败血病和甚至败血性休克(如果不加治疗的话)。在第二种情况下，临床特征可以是相对温和且非特异性的，诸如没有全身性反应的局部疼痛。此类现象也已知在肩部、臀部和膝关节的关节形成术之后出现在假体周围感染的情况中。具体地在此类低级感染的情况下，受影响患者的症状和不适往往比典型地与感染相关联的那些症状和不适更像退变性或机械脊柱问题的那些症状和不适。因为具有先前存在的退变性变化(诸如核脱水和环裂隙)的IVD与健康IVD相比更倾向于与低毒力感染剂集群，这种情况尤其如此。
因此，在一些实施方案中，患者患有椎间盘疾病。例如，样品可以是椎间切除物，其在手术期间获得。在又其他实施方案中，患者被安排进行椎间盘手术，并且在手术之前分离细针活组织检查物以用于测试。示例性椎间盘手术包括修复椎间盘突出的手术、原发性腰椎融合手术、或原发性椎间盘关节形成术。在这些实施方案中，本发明涉及针对一种或多种共生病原体(例如，痤疮丙酸杆菌)的存在和/或针对指示低毒力感染的RNA标志的存在分析椎间盘组织。
在一些实施方案中，本发明涉及通过微生物培养或通过遗传、免疫化学、或光谱分析检测或定量椎间盘组织样品中的共生病原体(例如，痤疮丙酸杆菌)。本发明还包括评估RNA(例如，miRNA)以将图谱分类为指示低毒力感染或不指示低毒力感染。在一些实施方案中，独立地评估RNA图谱以确定低毒力感染的存在，即，在不使用其他技术诸如PCR、培养、或显微镜检查法的情况下进行评估。
在一些实施方案中，共生微生物的存在通过培养(包括需氧和/或厌氧培养)和随后对物种的生物化学和光谱(例如，MALDI-TOF MS)识别来评估。例如，组织样品在无菌条件下进行处理，并且可通过均化进行处理(例如，在无菌盐水中)。可使用各种均化技术，包括灭菌海砂以有助于在实验室研钵或兜包(Seward，UK)中进行研磨。将均化样品接种在琼脂表面上以用于需氧和厌氧培养。例如，需氧培养可使用具有7％羊血的Columbia血琼脂(Oxoid)(CBA)，并且厌氧培养可采用具有7％羊血和维生素K的Wilkins Chalgren厌氧琼脂(Hi Media)(WCHA)。将接种的WCHA板在37℃下厌氧地(80％氮、10％CO2和10％H2)孵育最少14天。将CBA板在37℃下需氧地孵育约7天。在一些实施方案中，将均化组织的一部分转移到含有肉汤(例如，10ml VL肉汤(Merck))的测试管中并且随后使用无菌石蜡油覆盖以防止氧气进入并且在37℃下孵育约7天，并且在37℃下在厌氧条件中在WCHA上孵育最少7天。当微生物生长的迹象出现时，将此管的内容物接种在CBA和WCHA上并且如上所述孵育。
获得的分离物可在WCHA板上(孵育7天，厌氧气氛)和在CBA上(孵育1天，需氧气氛)进行亚培养以获得用于进一步分析的不同菌落。分离物可通过生长特征、通过菌落形态、通过革兰氏染色以及通过测试过氧化氢酶来表征。假定的痤疮丙酸杆菌分离物可通过生物化学分析来识别，例如使用RapidID ANA II系统(Remel)或通过MALDI-TOF MS(microflexTMLT MALDI-TOF MS系统+软件+细菌光谱库，Bruker公司)来识别。
对于分子分析，样品可以是新鲜组织样品，或者可保存，诸如FFPE样品或其他保存技术。在一些实施方案中，样品针对分子分析在手术后或活组织检查后保存或处理约24小时、或约48小时、或约72小时、或在手术后或活组织检查后保存或处理约96小时。
对于遗传分析，从样品分离核酸(例如，DNA和/或RNA)用于分析。在一些实施方案中，在样品包括大量软骨(例如，关节或椎间盘组织)的情况下，将样品通过使用胶原酶(例如，胶原酶A)和/或蛋白酶(例如，蛋白酶K)或可用于降解细胞外基质的其他酶消化来进行过处理。
在又其他实施方案中，可使用免疫化学(例如，免疫组织化学或ELISA)来检测共生生物体的蛋白质表位。免疫组织化学可在保存的或新鲜的组织样品上实施。例如但不限于，可使用针对痤疮丙酸杆菌的单克隆抗体，诸如对于细胞膜结合脂磷壁酸的表位特异性的抗体(PAB抗体)和对于核糖体结合触发因子蛋白的表位特异性的抗体(TIG抗体)。
对于组织样品的其他技术(诸如显微镜检查法)可用于识别阳性样品，并且可采用任何适当的染色试剂(例如，革兰氏染色剂或荧光原位杂交(FISH))或对于感兴趣的共生微生物特异性的其他免疫试剂。在一些实施方案中，显微镜检查法用于识别细胞内细菌。针对组织中的痤疮丙酸杆菌的可视化的FISH的应用描述于Alexeyev OA等人Direct visualization of Propionibacterium acnes in prostate tissue by multicolor fluorescent in situ hybridization assay.J Clin Microbiol.2007年11月；45(11):3721-8中。
在一些实施方案中，从椎间盘(IVD)组织分离核酸，其可包括细胞内细菌的核酸。IVD是脊柱的主要活动关节。它们在横向平面中显现为肾形并且由三个不同的结构组成：中心凝胶髓核(NP)、胶原性纤维环(AF)(其周向地围绕NP)和软骨终板(CEP)(其将AF和NP与脊椎体分开)(图3B和图B)。脊椎体的IVD侧边界限称为脊椎终板或骨终板。它们由一层半多孔的厚松质骨构成并且与CEP一起形成终板(EP)。IVD包括广泛的细胞外基质(ECM)，其通过具有组织特异性表型的细胞维持。它们占据小于0.5％的组织体积。
细胞外基质占IVD的99.5％。NP、AF和CEP的基本生物化学组分是相同的，即水、蛋白聚糖(PG)和胶原，但是其相对比例有差别。IVD的主要PG是聚集蛋白聚糖。它由核心蛋白组成，多至100种角蛋白和硫酸软骨素共价地结合到所述核心蛋白。这些是高度带负电荷的糖胺聚糖(GAG)，其吸入水并且向组织、具体地向高度含水的NP赋予粘弹性行为。I型和II型胶原构成总IVD胶原的大约90％。在NP中，胶原纤维不规则地取向；在AF中，它们组织为10-25个单向对齐的骨板层，其包围NP并且在内部区域附接到CEP并且在外部区域附接到脊椎终板(图3B)。IVD中最丰富的非结构性蛋白质是MMP(基质金属蛋白酶)和ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的解联蛋白和金属蛋白酶)的家族。存在锌依赖性蛋白酶，其可使ECM的几乎所有组分裂解。
IVD的细胞合成并维持细胞外基质(“ECM”)。它们控制ECM合成与降解之间的稳态。与其他组织相比，相对少的细胞必须维持广泛的ECM。因此,ECM蛋白的代谢周转耗时数年。三种主要类型的细胞在NP和AF中突出的：脊索细胞(NC)、NP细胞和AF细胞。NC是来自胚胎脊索的剩余部分并且构造主要的NP。在儿童早期，NC被NP细胞替换。AF细胞和NP细胞是间充质来源。根据其基因表达图谱，AF细胞是纤维囊性的并且NP细胞是软骨细胞性的(chondrocytic)。AF细胞合成I型胶原作为主要结构蛋白，NP细胞合成聚集蛋白聚糖和II型胶原。全部三种细胞类型维持细胞周基质，与软骨细胞的软骨相似，其中组成不同于细胞内基质。
根据本发明的实施方案，从NP细胞培养共生病原体，或者分离核酸以用于遗传分析，或者针对细菌抗原评估NP细胞。
在一些实施方案中，共生病原体的存在在来自发炎组织的细胞中被检测到。例如，痤疮丙酸杆菌的细胞内存在支持其在宿主中的长期持久性，其可引起慢性炎性状态。
在一些情况下并且由于各种原因，建立细胞培养的尝试可能不是成功的。这种情况的典型原因是：(1)基于生物膜的矫形相关感染经常是培养阴性的[Achermann Y等人Propionibacterium acnes:from commensal to opportunistic biofilm-associated implant pathogen.Clin Microbiol Rev 2014；27:419-40]；(2)在获取样本之前开始抗微生物疗法；(3)生物活组织检查没有得到足够的组织/菌落形成单位(CFU)；(4)从病灶的外周/非代表性区域进行活组织检查；(5)培养基不适于特定感染剂(经常如结核、其他细胞内病原体和某些厌氧菌或真菌的情况)；(6)不适当的转运条件和延迟，直至样本在实验室中进行处理；(7)实验室条件下的生殖速率非常低(例如：结核)；以及(8)鉴于微生物实验室中无菌出现，培养物被过早舍弃并且在寻求厌氧菌时未孵育足够的时间段。对于建立微生物诊断的失败、尤其是在低级椎间盘感染(其经常由厌氧菌导致)的情况下的失败存在许多其他潜在原因。
在一些实施方案中，共生病原体的存在或水平通过微生物核酸的杂交或扩增(可替代地或除培养之外)来确定。例如，检测测定包括实时或终点聚合酶链反应(PCR)、对微阵列的核酸杂交、或核酸测序。检测测定可涉及检测基因组DNA或RNA，在一些实施方案中包括在逆转录之后进行检测。在一些实施方案中，样品经受“深度测序”来制备存在于样品中的微生物的绝对丰度或相对丰度。各种测序策略是已知的，包括焦磷酸测序(例如，如可购自454Life Sciences)、纳米孔测序、电子测序(Genapsys公司，Redwood City，CA)、以及Sanger测序。
这些分子技术是非常敏感的且特异性的，并且不遭遇与经典的微生物培养相关联的以上提及的问题中的许多种。然而，因为这些技术是非常敏感的并且因为许多共生细菌是无处不在的，潜在的样品污染总是令人担心的问题，并且这可导致不可接受比率的假阳性结果。此外，显示出痤疮丙酸杆菌DNA是商业Taq聚合酶和PCR溶液的常见污染物。参见Lupan I等人The evidence of contaminant bacterial DNA in several commercial Taq polymerases.Rom Biotech Lett2013；18:8007-12。
在一些实施方案中，分子检测测定与培养一起实施。分子测定虽然能够识别致病物，但是并不一定提供关于治病物对于不同抗微生物药物的特定易感性或抗性的数据。因此，培养可提供可用于启动最佳疗法的额外信息。
在一些实施方案中，诸如微生物培养、PCR、显微镜检查法和其他技术的技术在样品群组上使用来识别共生病原体(诸如痤疮丙酸杆菌或其他共生病原体)和识别群组中的与痤疮丙酸杆菌(或其他共生病原体)的丰富水平相关的RNA标志。RNA标志可独立地在其他样品上使用作为共生病原体检测的其他方法的替代方法，即在不实施微生物培养、PCR或其他技术的情况下的替代方法。
正在发生的感染的毒力越小，诊断感染越具有挑战性。这些所谓的低级感染导致局部水平上的显著更低的炎性应答并且不导致全身水平上的炎性应答或仅非常微小的炎性应答。这进而不仅负面地影响正确地诊断此感染的成像研究和实验室测试的能力，更重要的是，可能已抑制存在的此感染和患者症状的病因的初步临床怀疑。例如，椎间盘感染在MRI(针对腰痛的优于CR的最常使用的先进诊断性成像研究)上的特征经常是温和的且非特异性的。最常观察到的变化是在与感染的椎间盘相邻的脊椎终板中的或多或少明显的骨髓水肿(相当于1型Modic变化)，其是也可在某些常见的退变性病状(诸如活化的骨软骨病)的情况下看到的变化。
在一些实施方案中，分子检测测定检测微生物核糖体RNA(rRNA)基因，诸如16S和/或23S rRNA基因、以及具体地16S的可变区。例如，16S rRNA测序可用于表征在身体部位处的微生物群落的复杂性。16S rRNA测序有利于识别微生物分类单元，例如种或更高的分类学水平，并且在先前未知的微生物的情况下实现其一般分类(例如，科、门)。元基因组全基因组鸟枪(WGS)提供对于存在于微生物群落中的功能和途径的理解。
16S rRNA序列包含高度保守区和可变区两者。这些可变区(数量为九个(V1至V9))用于根据系统发育对生物体进行分类，从而使得16S rRNA测序尤其可用于元基因组中以帮助识别存在于样品中的分类单元组。这些序列可使用芯片技术、RT-PCR、或深度测序来询问。
在一些实施方案中，共生病原体的存在通过基于杂交的测定(诸如微阵列)来确定。例如，PhyloChip途径具体地是识别并测量多于50,000个个体微生物分类单元的相对丰度的基于微阵列的方法。此途径依赖于分析整个16S核糖体RNA基因序列，其存在于每个细菌基因组中，但是提供特定微生物类型的指纹的方式有差别。基于微阵列的杂交途径确保对于重要低丰度细菌的测量不被普遍的占优势微生物群落成员过度影响。
在一些实施方案中，检测测定实现对关键共生生物体(诸如痤疮丙酸杆菌)的分型，以帮助辨别潜在的污染或识别可能针对感染有效的潜在治疗剂。在一些实施方案中，所述方法包括通过PCR或其他分子技术对组织样品(例如，椎间盘组织)中和衍生的痤疮丙酸杆菌菌落中的共生病原体菌株(例如，痤疮丙酸杆菌)进行分型。在痤疮丙酸杆菌并非由污染引起的情况下，所述菌株在两者中应是相同的。因此，通过培养和PCR两者对于高水平的相同痤疮丙酸杆菌均是阳性的病例将被认为作为对于微小RNA作图是真阳性的良好参考和指示。
表1：痤疮丙酸杆菌检测的示例性探针和引物
在一些实施方案中，分子检测测定使用实时PCR来提供基于校准曲线的痤疮丙酸杆菌(或其他共生病原体)基因拷贝的绝对定量。
在一种或多种共生病原体的检测是阳性的情况下，无论通过培养、PCR、杂交、显微镜检查法、或免疫化学中的一个或多个实施，最可能地由于微生物区系导致的频繁样品污染，通常存在不可接受的高比率的假阳性。为了区别这些假阳性，针对指示低级或低毒力感染的RNA标志(例如，mRNA或miRNA标志)的存在评估样品的RNA图谱。例如，从样品中的宿主细胞分离RNA，并且通过若干可获得的miRNA检测平台中的任一种评估(例如)miRNA的相对丰度。这些平台包括实时PCR(例如，Exiqon；TaqMan低密度阵列(TLDA)Human MicroRNA Panel；Life Technologies；使用miScript PCR系统的基于QIAGEN绿的实时PCR作图)、基于微阵列的平台(例如，Affymetrix基因芯片MiRNA；Agilent SurePrint人类miRNA微阵列；Exiqon miRCURY LNATM微小RNA阵列)、基于下一代测序的平台(例如，Illumina小RNA测序；IonTorrent小RNA测序)、以及FFPE组织中的原位微小RNA杂交。通常，RNA图谱可通过扩增、杂交、和/或测序技术来确定。
RNA(例如，miRNA)标志可与低毒力感染相关，不论细菌物种如何，或者可对于细菌物种或菌株(诸如痤疮丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、或棒状杆菌等)是特异性的。在一些实施方案中，RNA标志通过使用来自感染细胞和未感染细胞的RNA图谱训练分类器算法来确定。所述细胞可在体外感染，或者可以是体内感染细胞(来自临床样品的感染细胞)。在一些实施方案中，细胞使用痤疮丙酸杆菌或其他共生病原体的临床分离物在体外感染。在一些实施方案中，感染的培养物在确定RNA图谱之前维持至少一天、至少一周、或至少两周以紧密地模拟慢性感染。使用一系列共生病原体感染的细胞可用于制备细菌特异性的和细菌非特异性的标志。在一些实施方案中，NP细胞在体外培养并且使用共生病原体(诸如痤疮丙酸杆菌)感染，并且所得的RNA图谱用于训练将痤疮丙酸杆菌感染的细胞与未感染细胞区分开的分类器算法。分类器可使用痤疮丙酸杆菌阳性细胞相对于痤疮丙酸杆菌阴性细胞；凝固酶阴性葡萄球菌阳性细胞相对于凝固酶阴性葡萄球菌阴性细胞；以及痤疮丙酸杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌阳性细胞相对于对于两者均阴性的细胞来确定。
在一些实施方案中，RNA标志使用感染细胞(例如，痤疮丙酸杆菌感染NP细胞)和污染细胞来训练以将真实慢性感染与由于污染引起的急性“感染”区分开。相似地，可训练RNA标志来辨别生物体，诸如细菌、病毒、真菌、以及寄生生物，并且在一些实施方案中辨别革兰氏阳性相对于阴性细菌和/或细菌物种或菌株。
在一些实施方案中，RNA标志使用测试对于共生微生物的水平是阳性的或丰富的相对于是阴性的或非丰富的样品来训练。在一些实施方案中，阳性样品通过至少一种分子技术(例如，定量PCR)并且任选地也通过培养或显微镜检查法对于(例如，群组中的至少前50％、60％、70％、75％、80％、或90％的样品中的)共生微生物是丰富的。在一些实施方案中，阳性样品通过培养产生至少约103个CFU/mL、或多于约104个CFU/mL。阴性样品通过分子技术(诸如定量PCR)通常是阴性的，或者定量地在至少后四分位数、后20％或后10％中。通常，阴性样品通过培养或显微镜检查法是基本上阴性的。例如，在一些实施方案中，阴性样品通过培养产生小于约103个CFU/mL、或小于约102个CFU/mL、或小于约10个CFU/mL。在此上下文中，培养方法可采用实施例3所示的过程。在一些实施方案中，阴性样品关于通过培养建立的CFU/mL在后四分位数、或后20％、或后10％中。
在一些实施方案中，来自感染的临床样品的RNA标志从元基因组分析的结果训练，即，使用通过深度测序或杂交阵列识别的微生物的绝对丰度或相对丰度来训练。
用于区分或分类mRNA或miRNA标志的示例性计算工具包括主成分分析、自然贝叶斯(Naive Bayes)、支持向量机、最近邻、决策树、计算术、人工神经网络、以及基于规则的方案。计算机系统可采用分类算法或“分类预测者(class predictor)”，如在R.Simon，Diagnostic and prognostic prediction using gene expression profiles in high-dimensional microarray data，British Journal of Cancer(2003)89，1599-1604中所描述的，其特此以引用的方式整体并入。可监督、不监督、或半监督分类器算法。
在一些实施方案中，分类器使用1个、2个、3个、4个、或5个特征(例如，mRNA或miRNA)，不包括表达对照。在一些实施方案中，所述算法使用2个至约100个特征(mRNA或miRNA)来包括标志。在一些实施方案中，所述算法使用2个至约50个特征、或2个至约30个特征、或2个至约20个特征、或2个至约10个特征来包括标志。在一些实施方案中，分类器基于5个至50个特征、或10个至50个特征、或20个至50个特征。示例性人类miRNA在表2和表8中示出。
微小RNA(miRNA)是包含一类丰富的内源性的、小的非编码RNA(长度为18-25个核苷酸)的基因表达的重要调节子。它们能够促进mRNA降解或减弱蛋白质翻译。生物信息学研究估计微小RNA可调节全部人类基因中的多于50％，并且每个miRNA可控制数百个基因靶标。一些miRNA以细胞特异性、组织特异性和/或发育阶段特异性方式表达，而其他的无处不在地表达。经鉴定的miRNA的数量仍然在增加-最新版本的基于网络的数据库miRBase已注解了人类基因组中的超过1800种前体序列和2342种成熟序列。基于指示绝大部分miRNA位于基因区间中(距离注解的或预测的基因＞1kb)的miRNA的基因组位置的注解，假定大多数miRNA基因作为独立的转录单元转录。MiRNA可充当许多基本的生物过程(诸如胚胎形成、器官发育、细胞分化、增殖、细胞凋亡等)的主调节子，从而在干性和免疫性方面影响此类主要的生物系统。其他小的非编码RNA(例如，piRNA、核小RNA、核仁小RNA、以及环形RNA)或长的非编码RNA(例如，lncRNA、lincRNA、T-UCR)可用于根据本公开检测低毒力感染。
因此，特定模式的miRNA失调在各种人类癌症以及心血管、泌尿和其他器官系统的病理中被识别到。与病毒感染相比，对于细菌病原体的miRNA应答较少被探究。
在一些实施方案中，2个至约1000个RNA(例如，mRNA或miRNA)的水平在从患者样品分离的RNA中被检测到。例如，约2个至约500个、或2个至约300个、或2个至约200个、或2个至约100个、或2个至10个mRNA或miRNA被检测到。在一些实施方案中，至少50个mRNA或miRNA被检测到。在这些或其他实施方案中，不多于500个、300个、或100个或10个或mRNA或miRNA被检测到。在一些实施方案中，2个至约5个或2个至约10个miRNA被个体地检测到，并且相对丰度关于对照确定。例如，miRNA标志可基于表2、表4、表5中的miRNA或图2或图8中的人类miRNA的miRNA图谱来训练。
在一些实施方案中，以下miRNA中的两个或更多个在患者样品(例如，椎间盘组织)中被检测到：miR-574-3p、miR-29a-3p、miR-497-5p、miR-29c-3p、以及miR-99b-5p。在一些实施方案中，miR-29a-3p和miR-574-3p被检测到(例如，在椎间盘组织中)。表达可相对于一种或多种对照基因(诸如RNU38B和/或RNU48)的表达来定量。对照RNA可被选择来控制起始材料的量、样品采集、RNA制备和质量、以及逆转录(RT)效率的变化。对于内源性对照基因的归一化是校正潜在的RNA输入或RT效率偏差的准确方法。其他潜在对照包括管家基因，诸如ACTB(β-肌动蛋白)和GAPDH4。在一些实施方案中，内源性对照证明跨感兴趣的组织和细胞类型是相对恒定且高度丰富的基因表达。在一些实施方案中，miRNA分数基于群组内的阳性和阴性样品中的miRNA特征的相对表达水平来建立，其中所述分数区分独立的阳性和阴性样品。用于将痤疮丙酸杆菌阳性椎间盘组织样品与痤疮丙酸杆菌阴性椎间盘组织样品区分开的示例性诊断性miRNA分数(DMS)是：DMS＝18.71–11.24*log10(miR-29a-3p)+10.4*log10(miR-574-3p)，其中截留设定在0.0至-0.4或0.0至-0.3或0.0至-0.2的范围内(小于或等于截留是痤疮丙酸杆菌阳性的)。例如，在一些实施方案中，截留设定在-0.01处。在一些实施方案中，此分数可替代微生物培养和/或PCR(或其他分子测定)。在一些实施方案中，所述分数用于识别通过例如PCR或其他分子测定识别的假阳性。
在本文所述的诊断性测试确认低毒力感染的情况下，建议患者进行治疗。在未确认低毒力感染(包括通过分子分析的培养检测的假阳性)的情况下，不建议患者进行慢性感染的治疗。
具体地，在手术之前使用活组织检查确认样品对于低毒力感染是阳性的情况下，可在手术时施加局部抗生素或抗菌剂清洗。可替代地，可在手术之前施用口服、静脉内、或局部抗生素疗法。
当在手术期间分离样品并且测试对于低毒力感染是阳性时，可在手术后数天、数周或数月期间施用口服、静脉内、或椎间抗生素疗法。
在一些实施方案中，基于活组织检查样品确定患者患有低毒力感染。然后患者施用抗生素疗法，并且在腰痛减少或消除的情况下，可避免手术诸如椎间盘切除术或其他侵入性过程，例如以有利于侵入性较小的过程。
在一些实施方案中，在常规椎间盘手术(椎间盘切除术)期间获得的组织样品得出阳性测试的情况下，提供抗生素治疗，任选地通过敏感性测试(当可获得时)和邻近临床以及成像跟踪(MRI)指导。如果患者患有持续性的或增加的腰痛并且在微椎间盘切除术之后可能甚至表现出进行性椎间盘空间炎症的迹象，则治疗专家可指示进行完全椎间盘切除术和椎间关节融合术以便治疗感染和背痛两者。如果患者在抗生素治疗下得以改善，则抗生素可在进一步的临床和成像跟踪的情况下在某一时间段之后中断。
在一些实施方案中，在计划的手术之前通过经皮活组织检查的方式获得的组织样品得出阳性测试，可在计划的手术之前执行靶向抗生素预治疗。根据在此治疗下的潜在临床改善，计划的手术可改变为侵入性较小的过程或改变为保守治疗。在手术期间并且在存在对低级感染的认识的情况下，可使用局部抗菌剂或抗生素以尝试增加使感染消退的机会并且因此增加良好的临床结果的机会。
本发明的实施方案现将通过以下实施例进行描述。
实施例
在美国每年大约800,000个个体经历椎间盘手术来减轻难治的神经根(神经性)疼痛。所述过程涉及去除导致神经炎症的椎间盘的一部分。这些个体中的绝大部分患有不明显的退变性椎间盘疾病(一种使患者易感慢性下腰痛、椎间盘突出、坐骨神经痛的病状)和社会中的导致显著的残疾和发病的其他病状。然而，这些手术中的约25％未能使患者返回到健康状态。
退变性椎间盘疾病的病因经常是特发性的，并且存在越来越多的证据表明经历椎间盘手术的患者的子集患有低毒力感染，这潜在地归因于痤疮丙酸杆菌以及棒状杆菌和葡萄球菌。认为低毒力感染是一些退变性椎间盘病例的致病性或复合因子和/或未能使患者返回健康状态的25％椎间盘手术的因子。低毒力感染是躲避免疫系统的感染并且可促成慢性退变性病状。
实施例1.microRNA(miRNA)体外作图
(1)通过痤疮丙酸杆菌(PA)(ATCC 6919，来源于面部痤疮)或直接来源于感染的椎间盘组织的PA并且使用其他细菌物种(例如，大肠杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌)感染来源于天然椎间盘组织的3个样品的NP细胞。
(2)通过细胞因子应答和在各种时间点处进行的DAPI染色评估细菌细胞内发生。
(3)识别通过细胞内空间中的细菌诱导的微小RNA图谱。第一图谱(图谱1a)是对于所有细菌物种是共同的图谱，并且第二图谱(图谱1b)是对于痤疮丙酸杆菌或大肠杆菌等特异性的图谱以用于检测组织样品中的污染。
(4)识别NP细胞培养物感染之后在不同时间点中的微小RNA图谱(图谱1a和图谱1b)。30-60分钟可用作急性感染的模型，以识别指示在样品固定之前发生的污染的图谱(例如，体外污染信号)。长期孵育(例如，1天、7天和21天)将用于模拟慢性感染并且识别指示慢性感染的图谱。
使用Exiqon microRNA Human panel V3.0执行全局微小RNA表达作图(754个微小RNA)。
实施例2.miRNA新鲜椎间盘组织作图
(1)在捷克共和国招募～500位经历椎间盘手术的患者，在手术时采集临床数据并且在6周、和6月和12月内进行跟踪。
(2)将每个组织样品分为3个部分：
1.对于DNA纯化和细菌DNA事件的qPCR评估。对于元基因组途径，在提取之后立即将DNA在-80℃下储存。
2.对于RNA纯化和微小RNA图谱的qPCR评估。使用固定溶液(RNAlater)采集RNA。
3.对于微生物评估，尽可能快地将组织在室温下转运到微生物学部门。
对于未来研究，还采集血浆和尿液并且在-80℃下保存。
(3)将样品1用于DNA纯化并且在所有样品中通过qPCR针对痤疮丙酸杆菌DNA进行定量。此外，可定量其他细菌物种，诸如葡萄球菌。
(4)在通过培养和qPCR两者均是阳性的样品中，通过多重PCR和/或测序在菌落和椎间盘组织中识别PA菌株。要排除污染，应识别相同菌株。通过培养和qPCR对于相同的菌株是阳性的样品将认为是对于微小RNA作图是阳性的参考。
(5)通过培养是阴性并且通过qPCR是阴性(或在非阴性样品的情况下低水平阳性)(例如，PA，葡萄球菌)的样品将认为是对于微小RNA作图是阴性的参考。
(6)将20个PA阳性、10个葡萄球菌阳性和30个阴性用于微小RNA作图。
(7)通过比较来自20个PA与10个葡萄球菌相对于30个阴性样品的微小RNA图谱，识别与椎间盘组织中的细菌的发生相关联的共同微小RNA图谱。通过单独比较20个PA+和10个葡萄球菌+相对于阴性样品，确定细菌特异性图谱。
(8)在体外微小RNA标志与体内微小RNA标志之间执行比较。
实施例3.整个群组中阳性的交叉验证
在500个样品中，存在：通过培养是阳性的N位患者，和通过qPCR是阳性的N1位患者。发展基于识别的微小RNA标志的诊断性算法。N3位患者通过miRNA标志是阳性的。
在对于共同miRNA标志是阳性的病例中，评估PA特异性标志和葡萄球菌特异性miRNA标志。来自对于共同标志是阳性的N3：N4对于PA特异性miRNA标志是阳性的；N5对于葡萄球菌特异性miRNA标志是阳性的；N6对于两者均是阴性的。将N6经受元基因组分析。
期待以下观察：具有CLBP历史的经历手术的患者中真实阳性的频率较高，并且具有失败的背部手术的患者和尤其是将患有CLBP(在6月和12月处评估临床结果之后)的患者中真实阳性的频率较高。
实施例4.诊断性微小RNA分数(DMS)的建立
参考痤疮丙酸杆菌样品的患者群组和定义
前瞻性地招募326位患者(186位男性和140位女性)，其中平均年龄为44±13岁。没有患者发展临床上明显的术后关节盘炎。作为黄金标准，执行定量细菌培养来确定痤疮丙酸杆菌计数，并且执行实时PCR来检测椎间盘组织样本中的基因组计数。用于细菌培养和实时PCR的过程详细描述于方法中。一百三十个病例(40％)通过培养是痤疮丙酸杆菌阳性的。痤疮丙酸杆菌计数的范围是100至9000个CFU/ml，中位数为400个CFU/ml。通过实时PCR，痤疮丙酸杆菌基因组在98个病例(30％)中是不可接受的。228个痤疮丙酸杆菌阳性椎间盘组织中痤疮丙酸杆菌基因组的数量的范围是2至4531个，中位数为256个基因组/500ng的总DNA。通过培养(≥103CFU/ml；第75百分位数)和通过实时PCR(500ng的DNA中≥500个基因组；第75百分位数)两者均表征为丰富的痤疮丙酸杆菌的椎间盘组织样品认为是参考痤疮丙酸杆菌阳性病例(N＝45，14％)。在另一方面，通过细菌培养和实时PCR两者均是阴性的样品用作参考痤疮丙酸杆菌阴性病例(N＝72，22％)。这些痤疮丙酸杆菌参考病例用于全局微小RNA表达作图、诊断性微小RNA的识别、以及3期生物标记物研究中的诊断性微小RNA分数(DMS)的验证和发展。
将参考样品(45个阳性，72个阴性)与其痤疮丙酸杆菌状态成比例地进一步分为发现组、训练组和验证组。因为在非丰富痤疮丙酸杆菌阳性病例中存在高风险的基于污染的假阳性，所以在验证群组中，也包括具有非丰富痤疮丙酸杆菌(<103CFU/ml)和/或通过实时PCR获得的各种基因组计数(通过标准方法获得的非决定性结果)的样品(N＝44)以通过实施新发展的DMS来评估。患者在研究群组中的特征汇总在表3中。除这些161位患者之外，包括对于凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)具有阳性椎间盘培养物的另外10个病例作为研究的验证部分中的特异性对照组。
表3.患者特征(N＝161)
*通过培养未在任何病例中观察到共感染。
发现阶段-痤疮丙酸杆菌阳性和阴性样品中miRNA失调
通过使用基于Exiqon实时PCR的技术进行12个参考痤疮丙酸杆菌阳性椎间盘组织和12个痤疮丙酸杆菌阴性样品中的754个微小RNA的表达作图。在统计上仅评估具有低于35的平均Ct(阈值循环)的miRNA。微小RNA表达水平归一化到RNU38B。20个微小RNA在痤疮丙酸杆菌阳性和阴性椎间盘组织样品中差别地表达(汇总在表4中)，如在方法中所述的。
表4.识别到在通过培养和实时PCR具有丰富的痤疮丙酸杆菌的椎间盘组织中差别地表达的微小RNA(p值<0.1和调整的p值<0.15)。
*针对多个假设测试的Benjamimi-Hochberg校正
**由于极低的表达水平(两个组中均Ct>33)未选择用于验证的微小RNA
训练阶段-诊断性微小RNA分数(DMS)的验证和建立
通过使用个体微小RNA表达测定(Life Technologies)和针对2个参考基因的测定，确定来自发现阶段的16个候选miRNA以及RNU38B和RNU48在35个椎间盘组织样品(15个参考痤疮丙酸杆菌阳性病例，和20个参考阴性病例)中的表达，如在方法中所述的。相对于两个参考基因(RNU38B和RNU48)的平均值定量微小RNA表达水平。具有Ct(RNU38B)<34和/或Ct(RNU48)<31的所有样品通过质量控制。确认五个微小RNA在痤疮丙酸杆菌阳性和阴性椎间盘组织样品中具有显著不同的表达水平，其中两个甚至在针对多个假设测试调整P值之后仍保持显著(表5，图4)。
表5.发现阶段中识别的候选微小RNA的独立验证。
*针对多个假设测试的Benjamimi-Hochberg校正
两个微小RNA(miR-29a-3p和miR-547-3p)用于建立诊断性微小RNA分数(DMS)(式1)。当应用ROC分析时，将截留值-0.01识别为参考痤疮丙酸杆菌阳性与阴性病例之间的最佳区别值(图5，AUC＝0.9833)。
miR-29a-3p和miR-547-3p表达水平相对于两个参考基因(RNU38B和RNU48)的平均值表达：
miR-29a-3p＝2-(Ct(miR-29a-3p)-平均(Ct(RNU48)和Ct(RNU38B)))
miR-574-3p＝2-(Ct(miR-574-3p)-平均(Ct(RNU48)和Ct(RNU38B)))
式1：
DMS＝18.71–11.24*log10(miR-29a-3p)+10.4*log10(miR-574-3p)
如图5所示，DMS值的ROC分析显示区分具有丰富痤疮丙酸杆菌的病例(培养和实时PCR)和阴性病例的强能力。
验证阶段-具有非丰富痤疮丙酸杆菌的阳性病例(通过标准方法是非决定性的)中的DMS的独立验证及其应用
通过使用个体微小RNA表达测定(Life Technologies)和针对参考基因的测定，确定miR-29a-3p和miR-574-3p以及RNU38B和RNU48的表达水平，从而构成DMS，与训练阶段相似。58个独立病例(18个参考痤疮丙酸杆菌阳性病例，40个参考阴性病例)中的DMS的应用确认其显示根据样品的痤疮丙酸杆菌状态对样品进行分类的95％准确性的高分析性能(表6和表7，图6)。此外，具有凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)阳性培养的10个椎间盘组织样品是DMS阴性的，其指示DMS对于痤疮丙酸杆菌的特异性或至少示出DMS不受椎间盘组织中的第二最常观察到的微生物(CoNS)的存在的影响(图7)。
将DMS添加到标准诊断性方法(培养和实时PCR)示出具有通过培养获得的非丰富痤疮丙酸杆菌和通过实时PCR获得的各种基因组计数的评估为阳性的椎间盘组织中的几乎60％是假阳性(表6)。
表7.基于2个miRNA的DMS的诊断性能。
#PPV-阳性预测值，##NPV-阴性预测值
DMS计算如以下例示。
样品ID 4-阳性
Ct(miR-29a-3p)＝25.02；Ct(miR-574-3p)＝31.35；Ct(RNU38B)＝31.58；Ct(RNU48)＝28.76
质量控制：Ct(RNU38B)<34和Ct(RNU48)<31＝>RNA样品是有效的！
miR-29a-3p＝2-(25.02-(28.76+31.58)/2)＝35.5062
miR-574-3p＝2-(31.35-(28.76+31.58)/2)＝0.4414
DMS(id 4)＝18.71–11.24*log10(35.5062)+10.4*log10(0.4414)＝-2.41
DMS(id 4)＝-2.41<DMS(阳性截留)＝-0.01＝>样品是痤疮丙酸杆菌阳性的
样品ID 30-阴性
Ct(miR-29a-3p)＝26.49；Ct(miR-574-3p)＝31.73；Ct(RNU38B)＝32.43；Ct(RNU48)＝30.07
质量控制：Ct(RNU38B)<34和Ct(RNU48)<31＝>RNA样品是有效的！
miR-29a-3p＝2-(26.49-(30.07+32.43)/2)＝27.0959
miR-574-3p＝2-(31.73-(30.07+32.43)/2)＝0.7170
DMS(id 30)＝18.71–11.24*log10(27.0959)+10.4*log10(0.7170)＝1.1
DMS(id 30)＝1.1>DMS(阳性截留)＝-0.01＝>样品是痤疮丙酸杆菌阴性的
如表6所示，具有非丰富痤疮丙酸杆菌的通过培养确认为阳性的39个病例中的23个(59％)通过实施DMS评估为痤疮丙酸杆菌阴性。
通过培养确认为阴性但是通过实时PCR确认为强阳性的5个病例中的4个(80％)通过DMS评定为阴性，一个病例(20％)通过DMS评定为阳性。
潜在临床意义
如果椎间盘的痤疮丙酸杆菌感染用于临床决断并且标准方法应用于其诊断(细菌培养和/或实时PCR)，则多于三分之一的患者将在没有被感染的情况下接受潜在有害的抗生素治疗。具有其分析性能的DMS可完全替代标准诊断技术(其是耗时的并且对于污染高度易受影响)，并且所以提供如何在患有脊柱疾病的患者中防止这些不必要的有害治疗的解决方案。
方法
患者：纳入准则包括：腰椎或腰骶神经根病，具有或没有感觉缺陷，但是具有与腰椎或骶神经根分布相关的匹配的、临床上相关的运动缺陷(参见成像准则)或具有通过保守手段难治的神经根疼痛(坐骨神经痛或femoralgia)；匹配的体检发现，包括阳性直腿抬高测试、皮肤感觉缺陷、生肌节运动缺陷和/或深度腱反射减弱；在与临床上受影响的神经根和与体检相关的分布方面显示出游离的髓核游离或椎间盘突出/突出(protrusion)的腰骶脊柱的当前磁共振成像或计算机断层摄影成像。纳入准则包括：共同存在的感染或免疫损害病状；手术之前的一个月使用皮质类固醇或抗生素；创伤；未知的放射照相阴影扩散形状(radiographic mass)；炎性关节炎或其他风湿病的诊断。采集以下流行病学和临床数据：性别、年龄、涉及的椎间节段、突出类型、先前脊柱手术的患病率、早先的硬膜外类固醇注射、以及术后关节盘炎的发展。从每位患者获得书面知情同意书。所述研究由机构审查委员会批准。
手术中样品的采集。手术部位使用三重制备的聚维酮碘洗净并且使用标准无菌技术覆盖消毒盖布。在所有情况下进行皮肤切割之前给予标准手术期抗生素。头孢唑林是在大部分情况下给予的标准抗生素。在青霉素过敏的患者中，施用万古霉素或克林霉素。皮肤切割的精确位置通过手术中荧光镜透视检查指导，并且执行使用锐器解剖法和电烙术的后部中线途径。在放置自固定牵开器(Caspar类型)之后并且在手术显微镜下，通过Penfield解剖器和Kerrison咬骨钳按需要割除黄韧带。通过轻轻回缩横贯的神经根暴露椎间盘突出并且然后与椎间盘空间中环形缺损附近的髓核的剩余松散片段一起去除。所有组织样品以使其污染最小化的方式处理，保持在封闭的无菌样品杯中，并且然后传到用于标记的场并且转运到实验室，在所述实验室中对椎间盘组织样品进行进一步分析。样品大小是大约3x3x5-10x5x5mm并且在尝试从手术样本获得尽可能多的材料时未准确地测量。样品在处理之前不进行冷冻，并且在手术后2至4小时内建立培养。
微生物培养。使用无菌的个体包装的γ辐照的手术刀和无菌的γ辐照的培养皿将新鲜的椎间盘组织样品切成较小片段。将这些片段中的一个放置到2mL微量离心不含DNA的管中并且在-80℃下保存，直至进行处理以用于痤疮丙酸杆菌DNA分析为止。在2级生物学安全工作橱中在具有无菌石英砂(大小颗粒0.1-0.5mm；Penta，Czech Republic)和处于无菌状态中的盐水溶液的无菌研杵中进行组织处理和均化。将均化的组织样品接种到具有7％羊血和维生素K的Wilkins Chalgren厌氧琼脂(Hi Media实验室，India)上。将接种板在37℃下在厌氧工作站(Ruskinn Technology，UK)中厌氧地(80％氮、10％CO2和10％H2)孵育14天并且针对细菌生长进行评定。样品中的细菌的量表达为1ml均浆中的菌落形成单位(CFU)。使用Rapid ANA II系统(Remel，USA)并且通过MALDI-TOF(microflexTM LT MALDI-TOF系统+软件+细菌光谱库，Bruker公司)生物地进行细菌的识别。
DNA分离。将冷冻的组织样品解冻(中位数湿重为130mg，范围20-180mg)，通过使用新打开的无菌针、手术刀和镊子组件切成小片段并且转移到无菌的2mL微量离心管。将组织样品的小片段进一步悬浮在具有50μl的蛋白酶K(20mg/ml)(Qiagen)的500μl的ATL缓冲液(Qiagen，Germany)中，并且在56℃和650rpm下在热混合器中消化过夜。对于并行处理的每个样品集，使用具有无菌水的管作为实验室污染对照来遵循从组织消化和DNA分离到实时PCR分析的整个实验室过程。如制造商的说明书所述通过使用QIAamp UCP病原体迷你试剂盒(Qiagen)提取DNA。针对具有小于5ng/μl的DNA浓度的样品，使用Nanodrop 2000(Thermofischer，USA)或使用荧光染料和Qubit 3.0荧光计(Life Technologies，USA)测量DNA的浓度。
通过实时PCR进行的痤疮丙酸杆菌定量。使用引物扩增痤疮丙酸杆菌的16S rRNA基因的131-bp区来执行先前所述的实时PCR：正向引物5’-GCGTGAGTGACGGTAATGGGTA-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物5’-TTCCGACGCGATCAACCA-3’(SEQ ID NO:2)和TaqMan探针5’-AGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCG-3’(SEQ ID NO:20)。15-μl PCR反应混合物含有6,75μl的DNA样品、5pmol的每个引物和2pmol的TaqMan探针、以及1X TaqMan基因表达主混合物(Life Technologies，USA)。在50℃持续2min、95℃持续10min和50个循环的95℃持续15s和60℃持续1min的热循环分布的情况下使用QuantStudio 12K Flex系统(Life Technologies，USA)。使用由五份重复的六个浓度(10–106个拷贝)的合成痤疮丙酸杆菌扩增子(131bp)(Integrated DNA Technologies，USA)制备的内部标准曲线估计样品中的痤疮丙酸杆菌基因组当量。将以上所述的实验室污染和PCR阴性对照包括在每个PCR反应中。针对每个样品一式两份地进行测定，并且计算16S rRNA基因拷贝的平均数量。为了消除实验室污染，从组织样品中的拷贝数量减去实验室污染对照中检测到的16S rRNA计数。最后使用痤疮丙酸杆菌中的16S rRNA操纵子的已知数量的拷贝(3个拷贝/细胞)计算每个样品中的细菌基因组的数量，并且表示为从椎间盘组织样品提取的500ng的总DNA中的细菌基因组的数量。包括人类β-珠蛋白作为内部对照以实现对样本质量和核酸提取以及抑制扩增过程的评定。
RNA分离。将冷冻的组织样品解冻(中位数湿重为100mg，范围20-145mg)，通过使用无菌针、手术刀和镊子组件切成小片段并且转移到无菌的2mL微量离心管。将组织样品的小片段进一步悬浮在具有50μl的蛋白酶K(20mg/ml)(Qiagen)的500μl的ATL缓冲液(Qiagen，Germany)中，并且在56℃和650rpm下在热混合器中消化过夜。如制造商的说明书所述通过使用miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen)提取总RNA，包括微小RNA和其他小RNA。针对具有小于5ng/μl的RNA浓度的样品，使用Nanodrop 2000(Thermofischer，USA)或使用荧光染料和Qubit 3.0荧光计(Life Technologies，USA)测量RNA的浓度。
微小RNA表达作图。使用微小RNA即用型PCR板(Exiqon，Vedbaek，Denmark)执行miRNA的表达作图。使用实现752个人类miRNA和6个内源性对照的定量以用于数据归一化的两组卡(Human Panel I+II，V4.M)。使用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon，Vedbaek，Denmark)和100ng的总RNA根据标准协议执行第一链cDNA合成。随后，使用ExiLENT SYBR绿主混合物和微小RNA特异性的且使用LNATM(Exiqon，Vedbaek，Denmark)优化的PCR扩增引物进行实时PCR扩增。使用QuantStudio 12K Flex系统(Life Technologies，USA)执行最终测量。
个体微小RNA表达分析。根据TaqMan微小RNA测定协议(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)使用基因特异性引物从总RNA合成互补DNA。对于逆转录酶反应，使用10ng的RNA样品、50nM的茎-环RT引物、1×RT缓冲液、每个0.25mM的dNTP、3.33U·μl-1MultiScribe逆转录酶和0.25U·μl-1RNA酶抑制剂(均来自TaqMan微小RNA逆转录试剂盒，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。将反应混合物(10μl)在16℃下孵育30min，在42℃下孵育30min，在85℃下孵育5min并且然后保持在4℃下(T100TM热循环仪；Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)执行实时PCR。20-μl PCR反应混合物包括1.33μl的RT产物、1×TaqMan(NoUmpErase UNG)通用PCR主混合物和1μl的引物以及TaqMan微小RNA测定试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的探针混合物。将反应在95℃下在96孔光学板中孵育10min，接着进行在95℃下持续15s和在60℃下持续1min的40个循环。使用以下微小RNA测定：miR-574-3p(ID:002349)、miR-29a-3p(ID:002112)、miR-497-5p(ID:001043)、miR-29c-3p(ID:000587)、miR-99b-5p(ID:000436)、miR-195-5p(ID:000494)、miR-28-5p(ID:000411)、miR-30a-3p(ID:000416)、miR-146b-5p(ID:001097)、miR-34a-3p(ID:002316)、miR-140-3p(ID:002234)、miR-125a-5p(ID:002198)、miR-423-5p(ID:002340)、miR-125b-5p(ID:000449)、miR-28-3p(ID:002446)、miR-125b-2-3p(ID:002158)。使用两个测定用于定量参考基因：RNU38B(ID:001004)和RNU48(ID:001006)。
数据分析：通过SDS 2.0.1软件(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)计算阈值循环数据。一式三份地运行所有个体微小RNA实时PCR反应。使用全部微小RNA表达作图中的RNU38B和个体微小RNA测量中的RNU38B和RNU48的平均值对所有测量的miRNA的平均表达水平进行归一化。随后通过2-ΔCt方法分析表达水平。通过组合标准geneNorm和NormFinder算法从Exiqon微小RNA即用型PCR板上包括的6个可能的基因选择RNU38B(SNORD38B)作为内源性对照。在统计上仅评估具有低于35的平均Ct(阈值循环)的miRNA。通过具有针对多个假设测试的Benjamimi-Hochberg校正的非参数Mann-Whitney测试评估痤疮丙酸杆菌阳性和痤疮丙酸杆菌阴性病例中分析的miRNA的水平之间的统计差异。相对于两个参考基因(RNU38B和RNU48)的平均值定量个体微小RNA表达水平。从研究排除具有Ct(RNU38B)>34和/或Ct(RNU48)>31的样品。基于miR-29a-3p和miR-574-3p表达水平的线性组合发展诊断性微小RNA分数(DMS)式。通过ROC分析获得区别痤疮丙酸杆菌阳性和痤疮丙酸杆菌阴性病例的最佳截留值。使用GraphPad Prism版本7.00(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)执行计算。小于0.05的P值被认为是统计上显著的。
表2：miRNA
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表6：通过培养具有非丰富痤疮丙酸杆菌并且通过PCR具有各种水平的痤疮丙酸杆菌基因组(通过标准方法是非决定性的)的病例中的DMS的应用
*++意指CFU/ml>103；**++意指痤疮丙酸杆菌的数量高于500。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于检测患者中的低毒力感染的方法，其包括：
测试患者样品中的共生微生物的存在或水平，所述共生微生物导致低毒力感染，
确定来自所述样品的宿主细胞RNA图谱；
针对指示低毒力感染的RNA标志评估所述RNA图谱以将假阳性和/或假阴性与真实低毒力感染区别开。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有炎性病状的症状。
3.如权利要求2所述的方法，其中炎性病状的所述症状选自退变性椎间盘疾病(DDD)、慢性下腰痛(CLBP)、关节或软骨炎症、与植入物或假体相关联的炎症、心内膜炎、疑似感染的静脉内端口系统、或胃溃疡、前列腺炎、前列腺癌。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述样品包括软骨、或来自厌氧环境的组织或细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品是椎间盘组织。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述患者被安排进行椎间盘手术。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述椎间盘手术是修复椎间盘突出、原发性腰椎融合手术、或原发性椎间盘关节形成术。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述患者具有慢性腰痛(CLBP)和/或失败背部手术的历史。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述患者具有假关节的历史。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述样品在手术时取得。
11.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述样品在手术之前通过活组织检查取得。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述样品的一部分针对痤疮丙酸杆菌的存在或水平进行测试。
13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述样品针对以下中的一种或多种的存在或水平进行测试：葡萄球菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞菌属、肠球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、大肠杆菌、莫拉菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、梭状芽孢杆菌属、肠杆菌属、以及克雷伯氏菌属。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中消化所述样品的至少一部分，并且分离DNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中扩增所述共生微生物的DNA。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述共生微生物通过PCR、培养、免疫化学、光谱法、原位杂交、或元基因组分析在所述样品中进行检测或定量。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述RNA标志使用来自感染的临床样品的RNA图谱和来自未感染的临床样品的RNA图谱来训练。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述RNA标志使用来自测试对于所述共生微生物的存在或丰度是阳性的临床样品和测试对于所述共生微生物的存在是阴性或非丰富的临床样品的RNA图谱来训练。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述共生微生物的存在通过至少两种检测方法确定，所述至少两种检测方法任选地选自定量或测序与培养、免疫化学、光谱法、或原位杂交中的至少一种。
20.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述RNA标志采用使用来自感染有共生微生物的细胞培养物和未感染细胞的RNA图谱训练的分类器算法。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞培养物是NP细胞。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述RNA标志是微小RNA标志。
23.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述RNA标志是长的非编码RNA标志，其任选地包括lncRNA、lincRNA、T-UCR中的一个或多个。
24.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述RNA标志包括小的非编码RNA，任选地包括piRNA、核小RNA、核仁小RNA、以及环形RNA中的一个或多个。
25.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述RNA标志是mRNA标志。
26.如权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞使用共生病原体在体外感染。
27.如权利要求26所示的方法，其中所述细胞在体外感染至少一周以模拟慢性感染。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述RNA标志采用监督、不监督、或半监督分类器算法。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述RNA标志包括不多于100个RNA、或不多于75个RNA、或不多于50个RNA、或不多于25个RNA、或不多于10个RNA、或不多于5个RNA、或不多于4个RNA的相对表达。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述RNA标志包括两个或三个RNA的相对表达。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述RNA是选自表2的miRNA。
32.如权利要求29或30所述的方法，其中所述RNA是选自表4、表5、或图8的miRNA。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述RNA标志包括miR-29a-3p和miR-574-3p中的一个或两个的相对表达水平。
34.如权利要求11所述的方法，其中对于阳性样品，在手术时施加局部抗生素或抗菌剂清洗。
35.如权利要求11所述的方法，其中对于阳性样品，在手术之前施用口服或局部抗生素疗法。
36.如权利要求10所述的方法，其中对于阳性样品，在手术后施用口服、IV、或椎间抗生素疗法。
37.一种用于检测临床组织样品中的共生微生物的低毒力感染的方法，所述方法包括：
检测所述宿主组织中的miRNA图谱，并且针对指示低毒力感染的miRNA标志评估所述miRNA图谱，
所述miRNA标志使用来自通过至少两种检测方法对于所述共生微生物的存在或丰度是阳性的组织样品和来自通过所述至少两种方法对于所述共生微生物的存在或丰度是阴性的组织样品的miRNA图谱来训练。
38.如权利要求37所示的方法，其中所述检测方法选自核酸扩增、DNA测序、微生物培养、免疫化学、光谱法、以及原位杂交。
39.如权利要求38所示的方法，其中所述检测方法是定量PCR和微生物培养。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述RNA标志采用监督、不监督、或半监督分类器算法。
41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述RNA标志包括不多于10个RNA、或不多于5个RNA、或不多于4个RNA的相对表达。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述RNA标志包括两个或三个RNA的相对表达。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述RNA是选自表2的miRNA。
44.如权利要求41或42所述的方法，其中所述RNA是选自表4或表5的miRNA。
45.如权利要求37所述的方法，其中所述RNA标志包括miR-29a-3p和miR-574-3p中的一个或两个的相对表达水平。
46.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述患者患有选自以下的炎性病状：慢性下腰痛(CLBP)、关节或软骨炎症、与植入物或假体相关联的炎症、心内膜炎、疑似感染的静脉内端口系统、或胃溃疡。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述样品包括软骨、或来自厌氧环境的组织或细胞。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述样品是椎间盘组织。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述患者被安排进行椎间盘手术。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述椎间盘手术是修复椎间盘突出、原发性腰椎融合手术、或原发性椎间盘关节形成术。
51.如权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述患者具有慢性腰痛(CLBP)和/或失败背部手术的历史。
52.如权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述患者具有假关节的历史。
53.如权利要求37至52中任一项所述的方法，其中所述样品在手术时取得。
54.如权利要求37至52中任一项所述的方法，其中所述样品在手术之前通过活组织检查取得。
55.如权利要求37至54中任一项所述的方法，其中所述样品针对痤疮丙酸杆菌的存在或水平进一步进行测试。
56.如权利要求37至54中任一项所述的方法，其中所述样品针对以下中的一种或多种的存在或水平进行测试：葡萄球菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞菌属、肠球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、大肠杆菌、莫拉菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、梭状芽孢杆菌属、肠杆菌属、以及克雷伯氏菌属。
57.如权利要求47或48所述的方法，其中消化所述样品的一部分，并且分离DNA。
58.如权利要求57所述的方法，其中扩增DNA。
59.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述共生微生物通过PCR、培养、免疫化学、光谱法、原位杂交、微阵列、以及元基因组分析中的一种或多种在所述样品中进行检测或定量。
60.如权利要求37所述的方法，其中所述样品不通过其他技术针对所述共生病原体的存在进行测试。
61.如权利要求37所述的方法，其中所述样品不通过PCR和/或培养针对所述共生病原体的存在进行测试。
62.如权利要求37所述的方法，其中对于阳性样品，在手术时施加局部抗生素或抗菌剂清洗。
63.如权利要求37所述的方法，其中对于阳性样品，在手术之前施用口服或局部抗生素疗法。
64.如权利要求37所述的方法，其中对于阳性样品，在手术后施用口服、IV、或椎间抗生素疗法。
65.一种用于治疗低毒力感染的方法，其包括：
向确定患有低毒力感染的患者施用抗生素，所述低毒力感染通过来自表现出低毒力感染的症状的位置的细胞中的宿主细胞RNA标志的存在来检测，所述RNA标志指示低毒力感染。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述患者中的所述共生微生物的存在任选地通过PCR、培养、或显微镜检查法中的一种或多种在来自表现出低毒力感染的症状的位置的细胞中检测。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述抗生素局部地施用到所述位置。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述抗生素全身地施用。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述RNA标志使用来自通过所述至少两种方法对于所述共生微生物是阳性的组织样品和来自通过所述至少两种方法对于所述共生微生物是阴性的组织样品的RNA图谱来训练。
70.如权利要求69所示的方法，其中所述检测方法选自核酸扩增、DNA测序、微生物培养、免疫化学、光谱法、以及原位杂交。
71.如权利要求70所示的方法，其中所述检测方法是定量PCR和微生物培养。
72.如权利要求65至71中任一项所述的方法，其中所述RNA标志采用监督、不监督、或半监督分类器算法。
73.如权利要求65至71中任一项所述的方法，其中所述RNA标志包括不多于10个RNA、或不多于5个RNA、或不多于4个RNA的相对表达。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述RNA标志包括两个或三个RNA的相对表达。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述RNA是选自表2的miRNA。
76.如权利要求73或74所述的方法，其中所述RNA是选自表4或表5的miRNA。
77.如权利要求65所述的方法，其中所述核酸标志包括miR-29a-3p和miR-574-3p中的一个或两个的相对表达水平。
78.如权利要求65至77中任一项所述的方法，其中所述患者具有选自以下的炎性病状的症状：慢性下腰痛(CLBP)、关节或软骨炎症、与植入物或假体相关联的炎症、心内膜炎、疑似感染的静脉内端口系统、或胃溃疡。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述样品包括软骨、或来自厌氧环境的组织或细胞。
80.如权利要求65所述的方法，其中所述样品是椎间盘组织。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述患者被安排进行椎间盘手术。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述椎间盘手术是修复椎间盘突出、原发性腰椎融合手术、或原发性椎间盘关节形成术。
83.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述患者具有慢性腰痛(CLBP)和/或失败背部手术的历史。
84.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中所述患者具有假关节的历史。
85.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中所述样品在手术时取得。
86.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中所述样品在手术之前通过活组织检查取得。
87.如权利要求65至86中任一项所述的方法，其中所述样品针对痤疮丙酸杆菌的存在或水平进一步进行测试。
88.如权利要求65至87中任一项所述的方法，其中所述样品针对以下中的一种或多种的存在或水平进行测试：葡萄球菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞菌属、肠球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、大肠杆菌、莫拉菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、梭状芽孢杆菌属、肠杆菌属、以及克雷伯氏菌属。
89.如权利要求87或88所述的方法，其中消化所述样品的一部分，并且分离DNA。
90.如权利要求89所述的方法，其中扩增所述共生微生物的DNA。
91.如权利要求87至90中任一项所述的方法，其中所述共生微生物通过PCR、培养、免疫化学、光谱法、原位杂交、微阵列、以及元基因组分析中的一种或多种在所述样品中进行检测或定量。
92.如权利要求65所述的方法，其中对于阳性样品，在手术时施加局部抗生素。
93.如权利要求65所述的方法，其中对于阳性样品，在手术之前施用口服或局部抗生素疗法。
94.如权利要求65所述的方法，其中对于阳性样品，在手术后施用口服、IV、或椎间抗生素疗法。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
响应于关于以上参考的PCT专利申请于2016年10月24日邮寄的国际检索单位的书面意见；申请人在此主张独立权利要求项1、37和65叙述确定宿主细胞RNA图谱(权利要求1)、检测宿主组织中的miRNA图谱(权利要求37)、和宿主细胞RNA标志的检测(权利要求65)。所述RNA标志和RNA图谱不是细菌RNA，而是例如来自椎间盘组织的宿主细胞RNA。
如在第2页和第3页处的申请中所公开的，例如，宿主细胞RNA能够区别慢性低毒力感染，即使这些低级感染仅导致局部水平上的微小炎性应答。公开示例性miRNA标志(汇总在第2页处)，显示miR-29a-3p和miR-574-3p提供区别痤疮丙酸杆菌阳性椎间盘组织的95％准确性。
