抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法
技术领域
本发明涉及畜牧兽医技术领域，特别涉及一种抗鸡产气荚膜梭菌感染的%20饲用益生菌筛选方法。
背景技术
产气荚膜梭菌是一种重要的人和动物肠道共生菌和条件性致病菌,可产%20生多种外毒素,对人和多种动物具有致病性,尤其对鸡坏死性肠炎的爆发具%20有重要意义。该病不仅可降低动物生产性能和饲料报酬,增加死亡率,造成巨%20大的经济损失,还可通过鸡肉制品引起人的感染,对人类健康构成重大威胁。%20在养鸡业中通常采用添加抗生素控制鸡坏死性肠炎,随着抗菌药物的不断应%20用，细菌中的耐药菌株数量也在不断的增加，目前，耐药性的问题已非常严%20重，应用常规药物和常规方法抵抗鸡产气荚膜梭菌感染的难度越来越大，随%20着抗生素类饲料添加剂在我国的限制使用,产气荚膜梭菌感染发病在我国养%20鸡业中也会日益严重。建立一种抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方%20法，有利于筛选出高效的专用益生菌，对防治鸡产气荚膜梭菌感染具有重要%20意义。
益生菌在保障人畜健康或防治某些疾病方面发挥着越来越重要的作用，%20特别是在我国抗生素将全面禁用的前提下，肠道健康及腹泻将是威胁我国畜%20牧业发展的瓶颈问题，研发新的抗生素替代品，筛选具有特殊功效防治动物%20腹泻发生，保障动物肠道健康的饲用益生菌已成为国内外研究的热点。尽管%20目前我国已开展了大量的益生菌的筛选工作，并且广泛应用于生产实践，但%20是这些益生菌主要是用于促进动物肠道营养物质的消化吸收，促进生长，且%20很多益生菌并非来源于本体动物，进入宿主体内后，很难与宿主适应，难以%20发挥其确切功效。
传统的益生菌筛选技术主要包括体外抑菌法和体内攻菌方法，存在着盲%20目性、效率低和针对性不强，以及多为外源菌等缺点。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选%20方法，旨在筛选出高效的专用益生菌，防止鸡感染产气荚膜梭菌。
为实现上述目的，本发明提出的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛%20选方法，包括如下步骤：
步骤1：在产气荚膜梭菌感染爆发的鸡场，通过临床症状的观察和病理损%20伤的检测，结合产气荚膜梭菌的定性PCR检测，挑选具有典型临床症状及明%20显病理损伤的发病鸡和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病鸡各20-30只，%20分别采集各个肉鸡的肠道内容物；
步骤2：利用16srRNA通用引物扩增各个肠道食糜中微生物的16srRNA%20基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定，然后再利用标签引物进行第二次%20扩增，并对所扩增的片段进行浓度测得，将第二次扩增产物稀释至相同的浓%20度，等量混合，构建测序文库，进行测序；
步骤3：利用QIIME分析平台，对两组鸡肠道菌群进行分析，比较其α%20多样性(组内)和β多样性(组间)，对聚类的肠道微生物OTU进行物种注%20释，分析两组鸡肠道菌群物种分布；分析比较两组肉鸡肠道的差异菌群，核%20心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病鸡肠道中的差异菌群中分析出其中的%20优势菌和核心菌,根据优势菌和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的%20菌株；
步骤4：将抗病鸡肠道菌群接种到肉汤中，厌氧培养，然后再用选择培养%20基固体平板划线培养，根据步骤3中确定的优势菌和核心菌的菌落特性，挑%20选阳性菌落，分别接种到液体选择培养基中增菌培养；
步骤5：对所筛选的益生菌进行生化特性鉴定和16s全基因测序鉴定，并%20从其中筛选出了两株益生菌。
需要说明的是，核心菌是指在所有抗病鸡肠道或粪便中都有分布的，优%20势菌是指在差异菌群中占有比较高的比率的菌落。通常，核心均群和优势菌%20群是有重叠的。
优选地，所述步骤1中，所述临床症状包括：
肉鸡饲料摄入量减少、体增重降低、营养吸收不良、腹泻、严重肠道坏%20死及死亡率增加等死性纤维素性肠炎临床症状的观察，从产气荚膜梭菌定性%20PCR检测阳性的肉鸡群中，挑选发病鸡和抗病鸡.
优选地，所述病理损伤包括肠腔扩张充气，肠壁增厚，肠壁充血，有出%20血斑点，肠黏膜坏死，呈大小不等、形状各异的伪膜样坏死灶，肌肉苍白似%20放过血，肝脏和脾脏肿大，呈暗褐色。
优选地，步骤1中采集的肠道内容物置放于-80℃条件下保藏。
优选地，所述步骤3还包括通过确定所述优势菌和所述核心菌的种类，%20获取其菌落特性。
优选地，在步骤5后，还包括：
将所筛选的益菌接种至试验新生肉鸡体内，然后对试验肉鸡产气荚膜梭%20菌攻毒试验，观察并记录攻毒肉鸡发病情况计算发病率和死亡率，并测定试%20验肉鸡肠道组织形态结构及免疫细胞、免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，%20根据腹泻率、发病率和死亡率的统计结果、肠道组织形态结构及免疫细胞、%20免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，来分析所筛选的益生菌抗产气荚膜梭%20菌感染的效果。
优选地，所述步骤5还包括：
将购自没有进行产气荚膜梭菌免疫的鸡场的40只1日龄产气荚膜梭菌阴%20性肉鸡采用常规日粮饲喂，随机分为四组，四组分别为益生菌A组、益生菌%20B组、益生菌A+B组和对照组，每组10只肉鸡；
将所筛选的两组益生菌进行体外培养后，从1日龄早上开始对益生菌组%20肉鸡接种所筛选的益生菌，至7日龄；
第8日龄晚上每组肉鸡均口服灌注接种产气荚膜梭菌A型CVCC-52进行%20攻毒，攻毒后持续观察48h，观察并记录攻毒肉鸡发病情况计算发病率和死亡%20率；
攻毒48h后，屠宰肉鸡采集肠道黏膜组织样品，测定肠道形态结构及免%20疫细胞，免疫及炎性因子和黏膜功能蛋白质水平来评判所筛选的益生菌抗鸡%20产气荚膜梭菌感染的效果。
优选地，在所述步骤5中，
试验肉鸡自1日龄至7日龄，首日接种剂量为5×102cfu/100uL，然后每%20天依次为5×103cfu/100uL、5×104cfu/100uL、5×105cfu/100uL、5×106cfu/100uL和5×107cfu/100uL。
优选地，试验肉鸡使用产气荚膜梭菌A型CVCC-52进行攻毒的的攻毒剂%20量为109cfu/100uL。
优选地，在步骤5中：
所述免疫及炎性因子包括白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、%20Ⅰ型干扰素、肿瘤坏死因子-α和肠型脂肪酸结合蛋白。
优选地，两株益生菌为枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌。
本发明通过对发病肉鸡和抗病肉鸡肠道菌群的宏基因组学大数据分析入%20手，有针对性地从抗病肉鸡肠道庞大的微生物菌群中筛选具有抗产气荚膜梭%20菌感染的益生菌，所筛选的益生菌来源于本体动物，避免了益生菌与宿主的%20不适应，且针对性强，避免了筛选的盲目性，节省了大量的人力、物力及时%20间。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完%20整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全%20部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造%20性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过对发病肉鸡和抗病肉鸡肠道菌群的宏基因组学大数据分析入%20手，有针对性地从抗病肉鸡肠道庞大的微生物菌群中筛选具有抗鸡产气荚膜%20梭菌感染的益生菌，本发明主发明步骤如下：
步骤1：临床产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡的筛选及肠道食糜样本的%20采集。
在产气荚膜梭菌感染爆发的鸡场，通过临床症状的观察和病理损伤的检%20测，结合产气荚膜梭菌的定性PCR检测，通过肉鸡饲料摄入量减少、体增重降%20低、营养吸收不良、腹泻、严重肠道坏死及死亡率增加等死性纤维素性肠炎%20临床症状的观察；肠腔扩张充气，肠壁增厚，肠壁充血，有出血斑点，肠黏%20膜坏死，呈大小不等、形状各异的伪膜样坏死灶，肌肉苍白似放过血，肝脏%20和脾脏肿大，呈暗褐色等病理损伤的剖检，从产气荚膜梭菌定性PCR检测阳性%20的肉鸡群中，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病鸡和无典型临床%20症状及明显病理损伤的抗病鸡各20-30只，分别采集各个肉鸡的肠道内容物，%20于-80℃保存备用。
步骤2：产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡肠道微生物菌群的高通量测%20序。
用Qiagen公司生产的专门用于提取食糜及粪便中微生物基因组的试剂盒%20提取各个肠段食糜中微生物基因组，检测所提基因组的质量，并对其浓度进%20行测定。
首先利用16srRNA通用引物扩增各个肠段食糜中微生物的16srRNA基因，%20并对扩增片段进行检测和浓度测定，然后再利用标签引物进行第二次扩增，%20并对所扩增的片段进行浓度测得，将第二次扩增产物稀释至相同的浓度，等%20量混合，构建测序文库。文库构建好后，用NaOH进行变性后，利用illumina%20公司的测序试剂盒和Miseq测序仪进行序列测定。
步骤3：产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡肠道微生物宏基因组学对比分%20析。
利用QIIME分析平台，对两组鸡肠道菌群进行分析，比较其a多样性和β%20多样性，对聚类的肠道微生物OTU进行物种注释，分析两组鸡肠道菌群物种%20分布；以LEFSe分析比较两组肉鸡肠道的核心菌群和差异菌群。
步骤4：抗产气荚膜梭菌感染的益生菌的筛选及鉴定。
根据宏基因组学分析结果，比较抗病鸡和发病鸡肠道菌群中差异菌群、%20核心菌群和优势菌群，分析只出现在抗病鸡肠道中的差异菌群，然后在分析%20这些差异菌群中哪些是出现在抗病鸡肠道菌群中的优势菌和核心菌，然后针%20对这些优势菌和核心菌选择不同鉴别培养基。首先抗病鸡肠道菌群接种到肉%20汤中，厌氧培养，然后再用选择培养基固体平板划线培养，根据预期筛选益%20生菌的菌落特性，挑选阳性菌落，接种到液体选择培养基中增菌培养。
步骤5：对所筛选的益生菌进行生化特性鉴定和16srRNA全基因测序鉴%20定。通过以上试验，初步筛选出了两株理论上具有抗鸡产气荚膜梭菌感染的%20益生菌A和B。
本发明通过对发病肉鸡和抗病肉鸡肠道菌群的宏基因组学大数据分析入%20手，对肠道微生物菌群进行高通量测序及宏基因组学对比分析，有针对性地%20从抗病肉鸡肠道庞大的微生物菌群中筛选具有抗鸡产气荚膜梭菌感染的益生%20菌。一方面，所筛选的益生菌是专门针对肉鸡产气荚膜梭菌感染的防治；另%20一方面，所筛选的益生菌来源于本体动物，避免了益生菌与宿主的不适应；%20再一方面避免了筛选的盲目性，节省了大量的人力、物力及时间。
抗产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道益生菌效果验证
将购自没有进行产气荚膜梭菌免疫的鸡场的40只平均体重为38.94±0.32g%20的1日龄产气荚膜梭菌阴性肉鸡，采用常规日粮饲喂，随机分为四组，分别为：
益生菌A组、益生菌B组、益生菌A+B组和对照组。
每组10只肉鸡；体外培养所筛选的两株益生菌后，按10倍量逐日递增的%20方式，从1日龄早上开始对益生菌组肉鸡接种所筛选的益生菌，至7日龄，首%20日接种剂量为5×102cfu/100uL，然后每天依次为5×103cfu/100uL、%205×104cfu/100uL、5×105cfu/100uL、5×106cfu/100uL和5×107cfu/100uL；益生菌%20A组接种益生菌A，益生菌B组接种益生菌B，益生菌A+B组接种A和B两种益%20生菌，每种益生菌各占1/2，对照组接种相同剂量的生理盐水(100uL)。第8%20日龄晚上每组肉鸡均口服灌注接种产气荚膜梭菌A型CVCC-52进行攻毒，攻毒剂量为：109cfu/100uL。试验期为2天，观察并记录攻毒肉鸡发病情况计算发%20病率和死亡率，攻毒后2天屠宰肉鸡采集肠道黏膜组织样品，测定肠道形态结%20构及免疫细胞，免疫及炎性因子和黏膜功能蛋白质水平来评判所筛选的益生%20菌抗鸡产气荚膜梭菌感染的效果。
实验效果
(1)发病率与死亡率
攻毒后观察一周，以饲料摄入量减少、体增重降低、营养吸收不良、腹%20泻、严重肠道坏死等肠炎症状为发病标准，观察记录临床症状及发病情况，%20统计发病率与死亡率。
发病率(％)＝试验期内每组总发病数/(每组肉鸡只数×试验天数)×100％，%20死亡率(％)＝每组总死亡数/每组总数×100％。
表1.益生菌对产气荚膜梭菌感染肉鸡发病率和死亡率的影响
(2)肠道形态结构及免疫细胞
将厚约5μm的黏膜组织，经苏木素-伊红染色后制成肠道切片，使用显微 镜观察，并通过病理图文报告分析系统取图和拍照，测量对照组、益生菌A组、 B组和A+B组试验肉鸡的小肠黏膜的绒毛高度、隐窝深度、绒毛宽度和绒毛表 面积，免疫细胞数量及密度，测量结果如表2所示。
表2益生菌对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道形态结构的影响
绒毛高度与隐窝深度会直接反映肠道的功能状况，小肠绒毛萎缩会导致 成熟的上皮细胞数量减少，成熟的绒毛上皮细胞才具有吸收养分功能，因此 成熟的细胞数量减少会使营养成分得不到充分吸收；隐窝深度反映了绒毛上 皮细胞的生成率，小肠隐窝变浅后，说明细胞成熟率上升，分泌功能增强； 绒毛高度/隐窝深度反应小肠的功能状态，比值下降表明黏膜受损消化率下降。 由表2可知，益生菌A及B均可显著提高绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度的比值 及绒毛表面积，降低隐窝深度，说明益生菌A及B可以有效降低产气荚膜梭菌 感染导致的肠黏膜损伤。
(3)免疫及炎性因子
使用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法，测定对照组、益生菌A组、B 组和A+B组试验肉鸡血清免疫与炎性相关因子的含量，测定结果如表3所示。
表3益生菌对大肠杆菌感染肉鸡免疫及炎性因子的影响
白细胞介素(IL-6)活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，能使B细胞 前体成为产生抗体的细胞；和集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的 生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能。白细胞介素8(IL-8)又称嗜中 性粒细胞因子，是炎症性疾病的重要介质，在抗感染、免疫反应调节以及抗 肿瘤方面有重要作用。白细胞介素10(IL-10)能够抑制活化的T细胞产生细胞 因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子，特别是抑制TH1细胞产生IL-2、 IFN-γ和lt等细胞因子，从而抑制细胞免疫应答。IFN-α称为Ⅰ型干扰素，可以诱导细胞产生抗病毒酶来干扰病毒的转录和翻译达到抑制病毒增殖的效果。 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显 毒性的细胞因子。肠型脂肪酸结合蛋白(iFABP)在长链脂肪酸的摄取、转运及 代谢调节中发挥着重要作用。iFABP在血清中的含量微乎其微,肠缺血时iFABP 能较早释放,且在缺血时细胞膜的通透性较大,其分子可以通过细胞膜而释放 入血。由表4可知，益生菌A和B可显著降低血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、 NF-κB含量，显著提高IFN-α、TNF-α、iFABP的含量，说明益生菌A和B可以 有效降低产气荚膜梭菌感染引发的炎症，提高机体免疫调节能力。
上述益生菌A及B是从众多益生菌中随机挑选出来的。经过多次实验对比 发现，枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌组对产气荚膜梭菌感染具有很好的抗性，参 照表4。
表4.枯草芽孢杆菌组和丁酸梭菌组对产气荚膜梭菌感染肉鸡发病率和死亡率 的影响
从表4可以看出，枯草芽孢杆菌组和丁酸梭菌组的发病率要比表1中益生 菌A和益生菌B低，死亡率也明显低于表1中益生菌A和益生菌B。另外，枯草 芽孢杆菌和丁酸梭菌的组合菌株，其发病率和死亡率远远低于表1中的益生菌A和益生菌B，除此之外，该组合菌种对应的发病率和死亡率比枯草芽孢杆菌 组和丁酸梭菌组都要低，说明枯草芽孢杆菌组和丁酸梭菌组具有协同抵抗产 气荚膜梭菌的功效。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围， 凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直 接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
