一种生物芯片原位制备系统及其应用方法
技术领域
本发明属于生物芯片制备技术领域，具体涉及生物芯片原位制备系统及其应用方法。
背景技术
微阵列，也被称为“生物芯片”，是由固定在基底上成百上千的功能化探针组成的一种集成化的分析装置，已经被引入生物化学以及医学诊断领域，用于进行准确的、高通量的并行分析。其检测原理是基于特定的生物探针与靶标之间的相互作用，从而实现准确、快速、高通量的筛选与检测的前沿技术。
通常根据固定在基底上的探针分子种类被分为蛋白质芯片、糖类微阵列以及基因芯片等。在当前的生物芯片中，核酸微阵列已经成为一种非常重要的生物分析工具。核酸微阵列的应用大都基于核酸探针与其互补的靶标之间的特异性杂交(以形成双链体或者三链体)，对基因层面的医学诊断与治疗具有重要意义。
以DNA为代表的核酸芯片能够轻易的通过DNA合成仪，点样仪等设备来制备，然而对于具有多肽骨架的生物芯片探针例如肽核酸芯片、多肽芯片等，由于在原位制备过程中需要对单体进行活化才能进行偶联反应，尚未有合适的仪器被开发。此外，单体的活化程度会影响到产生副产物的量，进而影响偶联反应的效率。
专利ZL201210146026.8发明了一种具有多通路的预活化装置进行肽核酸芯片的光导原位制备。然而，较大的反应装置体积并未能从根本上解决提高活化效率的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能满足多数生物芯片原位制备的系统，能高效活化微量单体。
本发明提供的这种生物芯片原位制备系统，采用如下技术方案：包括精密注射泵、微流体预活化芯片、多通转向阀、电磁阀、蠕动泵、计算机、PLC、多个试剂瓶；精密注射泵有多个，微流体预活化芯片的数量与精密注射泵的数量一致，微流体预活化芯片上有微型混合通道，每个精密注射泵能同时往相应的微流体预活化芯片注入活化试剂和待活化的单体溶液，使单体溶液在微流体预活化芯片中完成预活化；在各微流体预活化芯片中活化的单体溶液分别进入多通转向阀的各进液通道后从多通转向阀的公共出液口送入微流体反应器中，预活化后的单体溶液在微流体反应器中进行偶联反应；电磁阀主要用于控制系统中液体的走向，蠕动泵为系统中液体的输送提供动力；多通转向阀和PLC的工作通过计算机控制，电磁阀和蠕动泵的工作通过PLC控制。
上述技术方案的一种实施方式中，精密注射泵有四个，微流体预活化芯片由四块，六通转向阀一个，电磁阀有三个，蠕动泵有两个，清洗试剂瓶有两个，分别盛装乙醇试剂和DMF试剂，惰性气体瓶一个，其中的惰性气体为氩气，一个脱保护试剂瓶，一个废液瓶；
上述技术方案的一种实施方式中，每个精密注射泵均有两个注射器，两个注射器中分别预装活化试剂和待活化的单体溶液。
上述技术方案的一种实施方式中，所述微流体预活化芯片由玻璃底片和玻璃盖片键合而成，所述微型混合通道蚀刻于玻璃底片的长度方向中心面上，微型混合通道的一端连通有两个进液孔，另一端连通有一个出液孔，进液孔和出液孔均设置于玻璃盖片上。
上述技术方案的一种实施方式中，所述电磁阀采用两位三通阀；所述微流体反应器为梭型反应池。
上述技术方案的一种实施方式中，两个清洗试剂瓶分别与第一个电磁阀的两个入口连通，第一个电磁阀的出口与第一个蠕动泵的入口连通，该蠕动泵的出口与第二个电磁阀的一个入口连通，第二个电磁阀的另一个入口与惰性气体瓶连通，第二个电磁阀的出口与多通转向阀连通。
上述技术方案的一种实施方式中，采用特氟龙管道作为连通管道输送系统中的液体，连通管道的两端配置聚醚醚酮接头。
上述技术方案的一种实施方式中，所述电磁阀和蠕动泵均与PLC相连，所述多通转向阀和PLC均与电脑通过RS232串口相连。
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述系统预活化单体溶液的方法，包括以下步骤：
N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和待活化的单体溶液被事先等比例混合被预先装于精密注射泵的一支注射器中，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)作为活化剂被装于精密注射泵的另一支注射器中；
按下精密注射泵的开关，两支注射器同时将两种液体同时注入相应的微流体预活化芯片的微型混合通道中，通过微型混合通道的混合作用，使单体溶液在微型混合通道中完成预活化；
通过计算机控制的六通转向阀以及PLC控制的电磁阀组合，将活化好的单体溶液输送至微流体反应器内，单体溶液充满微流体反应器后，关闭精密注射泵开关。
本发明的目的之三在于提供一种上述系统的控制方法，包括以下步骤：
(1)PLC按照从上位机接收到的指令，依次驱动电磁阀和蠕动泵进行工作，依次执行包含清洗通道，干燥通道等操作，在启动系统后，系统中集成的语音提示器将提示相应的操作，计数器cycle记为0；
(2)PLC驱动电磁阀和蠕动泵工作，依次将DMF溶剂以及乙醇溶剂输送至管道以及微流体反应器内，持续时间为2-5分钟；
(3)完成清洗操作后，PLC将调整电磁阀的转向，开启惰性气体，利用乙醇的挥发性，快速干燥被清洗过的通道，持续时间为2-5分钟；
(4)完成干燥步骤后，PLC控制电磁阀和蠕动泵，将脱保护试剂输送至微流体反应器内，持续10-15分钟，完成脱保护；若是利用本发明进行光导微阵列芯片的制备，则此步骤为利用虚拟掩膜光刻机进行光脱保护，脱去光敏保护基团；
(5)完成脱保护步骤后，再次执行步骤(2)和步骤(3)，然后按下对应单体的精密注射泵开关，注入通过微流体预活化芯片的混合溶液至微流体反应器内，完成单体的偶联反应，持续时间为25-30分钟，完成后，计数器cycle＝cycle+1，并判断是否cycle>＝L，L为所制备的生物芯片探针的目标长度，若cycle>＝L，则制备完成，停止反应，若cycle<L，则返回步骤(2)。
本发明的每个精密注射泵均配置有两支注射器，两支注射器分别预装活化试剂和待活化的单体溶液，通过精密注射泵同时将两支注射器中的活化试剂和待活化的单体溶液往相应的微流体预活化芯片中注入，使单体溶液在微流体预活化芯片的微型混合通道中进行预活化，再送入微流体反应器中进行偶联反应。微流体预活化芯片的采用提高了单体溶液的活化程度，进一步促进微流体反应器中单体溶液偶联反应的效率。原位制备系统中的计算机、PLC、电磁阀和蠕动泵形成液体控制系统，实现生物芯片原位制备过程的自动化。
本发明能够满足多数生物芯片原位制备的需要，特别针对具有多肽骨架，需要单体活化步骤的生物芯片探针制备，如多肽芯片，肽核酸芯片等。
附图说明
图1为本发明实施例一的制备系统示意图。
图2为图1中的液体通道连接示意图。
图3为图1中微流体预活化芯片的放大结构示意图。
图4为实施例一中脱保护、活化以及偶联反应示意图。
图5为实施例一的微型混合通道与传统的方波微混合通道混合效率的对比示意图。
图6为本发明实施例二的制备系统示意图。
图7为本发明两个实施例的PLC与计算机通信示意图。
图8为PLC与相应软元件接线示意图。
图9为软元件工作时序图。
图10为上位机LabView监视面板图。
图11为系统程序流程图。
图中序号：
1-计算机；2-微流体预活化芯片；3-精密注射泵；4-微流体反应器；5-PLC；6-六通转向阀；8-特氟龙管；9-脱保护试剂瓶；10-蠕动泵；11-电磁阀；12-废液瓶；13-乙醇试剂瓶；15-DMF试剂瓶；16-惰性气体瓶；17-气体输送专用管；19-微型混合通道；20-进液孔；21-出液孔；ZSQ-注射器；25-虚拟掩膜光刻机，26-光束。
具体实施方式
实施例一，本实施例将制备系统应用于肽核酸芯片的制备。
如图1、图2所示，本实施例公开的这种具有多肽骨架的生物芯片探针原位制备系统，主要设备包括四个精密注射泵3、四块微流体预活化芯片3、一个六通转向阀6、三个电磁阀11、两个蠕动泵10和一个微流体反应器4。各设备之间采用特氟龙管8作为连通管道输送液体，同时在特氟龙管的两端配置聚醚醚酮接头。
从图1可以看出，每个精密注射泵1均有两支注射器ZSQ，两支注射器中分别预装活化试剂和待活化的单体溶液。
本实施例的微流体预活化芯片2采用玻璃底片和玻璃盖片键合而成。结合图1和图3可以看出，微流体预活化芯片2的长度方向中心面上有微型混合通道19。本实施例的微型混合通道19采用CN201621081990.7中公开的结构，将微型混合通道19蚀刻于玻璃底片上，微型混合通道的一端连通有进液孔20和出液孔21均设置于玻璃盖片上。
每个精密注射泵3的两支注射器ZSQ分别通过特氟龙管8与相应微流体预活化芯片2上的进液孔通过聚醚醚酮接头连接。
同时开启四个精密注射泵，每个精密注射泵分别针对一块微流体预活化芯片注入活化试剂和单体溶液，使单体溶液在微流体预活化芯片的微型混合通道中进行预活化。经四块微流体预活化芯片同时预活化完成的单体溶液分别经六通转向阀的四个进液口流入，从六通转向阀的公共出液口流出送入微流体反应器中进行偶联反应，直至微流体反应器中充满单体溶液。本实施例的微流体反应器采用ZL201210159002.6公开的结构，具有流速均匀性的特点，其内的液体均一推进、无气泡、无残余、无交叉污染。
系统进行工作前需对流通通道进行清洗和干燥。
根据需要，本实施例的电磁阀均采用两位三通阀。结合图1和图2可以看出连通管道中液体的走向通过六通转向阀和电磁阀来控制。
本实施例选用乙醇试剂和DMF试剂作为清洗试剂。如图1、图2所示，两清洗试剂瓶分别与图1中中间位置的电磁阀11的一个入口相连，该电磁阀的出口与左边蠕动泵10的入口相连，该蠕动泵的出口与左边电磁阀的一个入口相连，左边电磁阀的另一个入口与惰性气体源通过气体输送专用管17相连，左边电磁阀的出口与六通转向阀的其中一个入口相连。概括的说，清洗剂乙醇与DMF试剂共用一个蠕动泵，两者通过电磁阀进行切换，两者共同构成液体清洗通道。氩气作为干燥惰性气体与清洗通道通过电磁阀进行切换。
如图1所示，由计算机1控制的PLC5驱动所有电磁阀和蠕动泵的工作。计算机1控制六通转向阀6来实现连通管道中液体的走向。同时通过左边的电磁阀控制连通管道中清洗试剂和惰性气体的切换。废液瓶置于通风柜中，清洗后的废液流入废液瓶中。干燥后的惰性气体直接吹进废液瓶中，废液瓶上有开孔，惰性气体可排入通风柜排走。本实施例的PLC采用可编程逻辑器三菱PLC(FX3GA)。
因为采用微流体预活化芯片2，贵重的待活化的单体溶液只需与DIEA事先等体积混合后存放，用注射器取样即可，将注射器固定在微量注射泵上即可执行自动化操作。通过精密注射泵3驱动其上的两支注射器ZSQ同时前进，在微流体预活化芯片2的微型混合通道19内完成混合与单体活化，从微型混合通道的出液孔21实时流出的溶液即为活化完成的单体溶液，并通过特氟龙管输送至六通转向阀6。
六通转向阀6通过接受计算机软件发出的指令来控制步进电机运行从而实现流体通路的切换，注意六通转向阀6接触液体部分的材料能适用于各种腐蚀性液体，可以满足实验需求。
本实施例的精密注射泵3采用保定兰格精密注射泵，流量范围在0.823μl/分钟-21.41ml/分钟，且具有RS485的联机端子可用于与计算机通信，可实现软件控制。电磁阀11采用Burkert微量电磁阀6606，所有管路接头均采用聚醚醚酮(PEEK)和聚四氟乙烯材料，能够耐受各种有机溶剂的腐蚀，满足实验要求。
六通转向阀6的公共出液口与脱保护试剂瓶9的入口通过右边的电磁阀相连，以保证脱保护试剂不会进入到六通转向阀中，对其阀体造成腐蚀性的损坏，右边电磁阀的出口与微流体反应池相连，通过该电磁阀，可以将芯片制备过程中的光脱保护反应与偶联反应相隔离。
在肽核酸芯片制备过程中，一般首先对9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基化固相基底采用哌啶脱去保护，暴露出氨基基团。使用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N'N'，Nf-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)对单体溶液先进行活化然后再与固相上露出的氨基反应，完成偶联反应，通过循环往复的脱保护操作，偶联反应，得以延长探针的长度。传统的单体预活化通常需要人工将活化剂与单体溶液混合，持续几分钟后，才能进行偶联反应，本实施例先采用具有微型混合通道的微流体预活化芯片对单体溶液进行活化，一方面能够降低试剂量，可以增加活化反应的速率、节省活化的时间。另一方面，能够减少副产物的产生，进而增强偶联反应效率。
本实施例的微流体预活化芯片2的尺寸为75mm*25mm，采用改进的上述微型混合通道能够在低速即低雷诺数条件下，利用十几微升的试剂量能够实现最高90％以上的混合效率。如图5所示，其中的(a)为传统的方波微混合通道，(b)为本实施例的微型混合通道，通过对比(a)和(b)可以看出两者在进行同样的酚酞遇碱变色的反应中，本实施例的微型混合通道能够显著提高混合效率，从而证明了采用微混合通道进行单体预活化的可行性。
实施例二，本实施例将制备系统用于制备高密度生物芯片。
如图6所示，制备高密度生物芯片一般采用光刻法，本制备系统可以轻易地与虚拟掩膜光刻机25联用，通过从光刻机中投射不同图案的光束26到微流体反应器4表面，实现固相基底表面的光脱保护反应，进而实现单体溶液的偶联反应。
如图7所示，当光刻机中发出的紫外光束投影到微流体反应器4的表面时，被光敏基团2-(2-硝基苯)丙氧羰基(NPPOC)保护的固相基底被脱去NPPOC保护，从而暴露出氨基基团，精密注射泵3驱动的单体溶液和活化试剂经过微流体预活化芯片完成单体溶液的活化，活化好的单体溶液输送至微流体反应器中脱去保护的固相基底表面，完成偶联反应。通过在每一次光脱保护时切换不同图案的掩膜光束图，能够实现每次循环在不同的点位发生光脱保护反应，从而在经过循环往复的反应循环，可以在固相基底上制备出大量的不同种类的探针，实现高密度的生物芯片制备。
依照此制备流程，采用微流控混合芯片用于单体溶液的预活化，通过六通转向阀选择单体溶液的种类，然后通过微混合芯片将选择的单体溶液与活化试剂(打开右边的电磁阀开关)进行充分混合，随后输入到经过光敏基团保护的氨基化玻片基底表面修饰的微流体反应器内发生偶联反应，然后采用六通转向阀选择清洗试剂，关闭其他流路上的电磁阀，将微流体反应器冲洗干净，然后通过六通转向阀选择脱保护试剂注入微流体反应器，在虚拟掩膜光刻机发出的365nm紫外光和掩膜图的配合下，在特定点位上发生光脱保护反应，反应结束后再次冲洗。随后按照目标探针的长度和种类，循环上述步骤。在此过程中，需要实现精密注射泵3、六通转向阀6、电磁阀11等元器件的协同作用，以达到上位机控制的功能。
如图8所示，两个实施例均采用计算机1与PLC5通信，从而控制PLC驱动的电磁阀11和蠕动泵10等实现自动控制。为了实现芯片制备过程的仪器化操作，本系统将上述描述的执行液体操作功能的元件(蠕动泵、电磁阀)以及提示灯，语音提示器都通过可编程逻辑器进行控制。
如图9所示的PLC元件接线图，包含偶联指示灯，蠕动泵，电磁阀，另外还有扬声器用于提示系统操作，表1给出了PLC的各输出端口的执行部件和功能定义。
表1 PLC输出端执行元件
PLC硬件程序的设计是为了在高密度生物芯片原位制备过程中将DMF冲洗、乙醇冲洗、氩气干燥、紫外光脱保护、碱基单体偶联等重复的步骤按照一定的时间顺序，依次执行，并设定相应的执行时间。因此需要编写PLC下位机程序驱动相应的蠕动泵、电磁阀等软元件，能够提升本系统的自动化程度。
上位机采用LabView软件编写的监测面板以监控每一步反应的进行，以及流程。以实施例一肽核酸生物芯片的原位制备为例，通常要求探针的长度达到17个碱基，才能满足相应的检测需求。因此，在编写硬件程序的时候，在执行17个循环后，停止运行，同时监视面板上的时间进度条控件能够监测到冲洗乙醇溶剂的过程、冲洗DMF溶剂的过程，氩气干燥的过程，光脱保护反应以及偶联反应的过程。此外还可以通过此操作面板，能够通过点击开启、暂停以及停止系统的按钮，对PLC发出指令，执行相应的命令。整个芯片制备过程能够通过该面板监视到当前制备的循环数以及剩余的循环数，以便操作者能够随时对系统的运行情况有所掌握(如图10)。要通过上位机监视PLC所控制的电路运行，需要通过将相应的输出端口Y的状态以及相关元件的值实时通过FX3GA-232BD通信板发送给上位机软件。本制备系统中PLC的控制电路为Y1-Y16，因此，根据PLC组合元件的命名特点，只要将K4Y1，4表示有四组位元件，每组4个位元件，起始地址为Y1(Y1Y2Y3Y4，Y5Y6Y7Y10，Y11Y12Y13Y14，Y15Y16)每隔10ms将状态发送给上位机即可。
下面以光刻法制备高密度生物芯片为例来介绍系统运行流程(图11)如下：
通过按下PLC输入端的X0端的开关按钮开关能够启动PLC硬件程序，首先执行的语音提示命令1(10秒，将该命令的定时器时间设置为K100，即100*100ms＝10s)，“欢迎进入系统”，T0定时结束后开始播放语音命令2，提示操作者操作北昂流体六通进样阀软件，点击切换端口命令将六通阀指向清洗液的进入端口(这一步是为了复位，防止由于以前的操作而修改了默认处于第四端口的六通阀)，这一部分由于可能需要的时间较长，因此将命令执行两分钟，将定时器T1设置为K1200＝1200*100ms＝2分钟。待两分钟定时结束后，就要自动进行有机溶剂清洗(DMF和乙醇)和惰性气体干燥(氩气)这一连贯步骤。由于清洗是由蠕动泵提供动力，电磁阀Y4提供转向操作，因此，首先需要设置电磁阀端口，然后执行蠕动泵Y3上电的操作(Y3，Y4几乎同时上电)。清洗的顺序是先用万能溶剂DMF充分溶解残留再阀体内部以及各种通道内的物质1分钟，然后采用挥发性溶剂乙醇进行冲洗1分钟。2分钟后，电磁阀Y5转向氩气端口，干燥2分钟后，电磁阀Y5掉电，由于本系统采用的电磁阀为两位三通电磁阀，因此，在掉电后能回到默认状态，上电才会改变状态。
在执行完成清洗和干燥流程后，整个系统中的管道流路不存在任何试剂污染，因此，此时可以执行相应的光脱保护实验操作，光脱保护实验必须在有机溶剂环境下进行，因此，需要将脱保护试剂通过系统中的管路输送到反应池中，此时电磁阀Y6和蠕动泵Y3需同时开始上电2分钟，待脱保护试剂充满整个反应池，整个曝光过程预计在10分钟之内，因此，为了预留出充足的时间，在注入脱保护试剂后，预留15分钟的时间给光刻机工作进行光脱保护实验。
光脱保护反应结束后，重复执行清洗和干燥的步骤，执行单体偶联的操作，单体偶联通过精密注射泵将单体溶液和活化溶液在微流体混合装置中实现充分活化，最后输送到反应池中完成缩合反应。为了充分反应，系统将这一步需要的时间定为25-30分钟。
在偶联结束后，将cycle计数加1，然后需要执行判断指令程序采用CMP命令执行比较命令Cycle是否大于17当Cycle>＝17时，即可认为序列已经制备完成，完成最后一次曝光即可终止程序，当Cycle<17时表示制备未完成，程序将跳转到前方重复执行曝光和偶联的步骤，直至合成次数达到17次。
