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一种人乳头瘤病毒的快速检测方法、液相芯片及试剂盒

2021-04-24 03:43:12

一种人乳头瘤病毒的快速检测方法、液相芯片及试剂盒

　　技术领域

　　本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒的快速检测方法、液相芯片及试剂盒。

　　背景技术

　　人类乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)感染与人类多种肿瘤特别是宫颈癌的发生、发展密切有关。而宫颈癌为女性最常见的癌症之一，其发病率仅次于乳腺癌。全球每年新发病例约40万且有超过20万妇女死于该病。在发展中国家，由于宫颈癌筛查工作的不完善，其发生率是发达国家的6倍。近年，年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病以每年2％～3％速度增长，对妇女的身心健康造成极大的危害。因此，对宫颈癌进行早期筛查的一项重要内容就是对HPV的检测。

　　HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒。人类是HPV的唯一宿主，它定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮内，具有高度的宿主特异亲和力。

　　国际癌症研究中心(IARC)专题讨论会(1995年)明确提出，HPV感染是宫颈癌的主要病因。目前鉴定出HPV亚型100余种，其中30余种与宫颈感染和病变有关，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种：将HPV6、11、40、42等归为低危型，主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生殖性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤变(CIN I)；高危型主要为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等，主要导致高度子宫颈上皮内瘤变(CIN II、CIN III)和宫颈癌的发生，尤其是HPV16和18型。因此，检测出样本中的具体HPV亚型对于宫颈癌的防治具有重要的指导意义。

　　HPV病毒无法在体外培养，在体内也不能被诱导出易于检测的免疫反应，因此无法采用血清学检测的方法对其进行诊断和分型。早期HPV的诊断主要是根据典型的临床表现和肉眼可见的尖锐湿疣，或是根据细胞学或病理学特征性改变来判断，包括巴氏涂片(PapSmear)和液基薄层细胞检测(TCT)，但常会出现一种未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)，常可掩盖一部分有意义的组织病理学异常而出现假阴性结果，需结合分子生物学技术进行确诊。

　　荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型。同时，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV感染型别。

　　发明内容

　　为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的提供一种人乳头瘤病毒的快速检测方法、液相芯片及试剂盒，该芯片利用人工合成的、带有一定量可检测基团的标记分子，对同一类微粒载体进行定量标记，显著提高了标记载体的可区分度；基于此芯片，本发明的HPV试剂盒及检测方法能一次检测24种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测，操作简单，具有高通量、高精度的优点。

　　为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

　　本发明提供了一种人乳头瘤病毒检测的液相芯片，主要包括有：

　　(1)微球载体，所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团；

　　(2)可检测标记分子，所述可检测标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体的可偶联基团偶联的基团；

　　(3)不同HPV型别的核苷酸捕获探针，所述探针含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联基团，所述核酸序列能够与不同HPV型别的目标核酸分子形成一定程度的互补配对，探针的核酸序列如SEQ ID No：1～24所示；所述可偶联的基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用。

　　进一步地，所述液相芯片用于同时检测24种HPV的基因型，所述28种HPV包括：作为高危型HPV的HPV-18、HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b和HPV-82；作为中危型HPV的HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-70和HPV-73；作为低危型HPV的HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43。

　　进一步地，所述液相芯片还包括内参核苷酸捕获探针。

　　进一步地，微球载体的可偶联基团选自抗原分子、抗体分子、链亲和素、生物素。

　　更进一步地，微球载体的可偶联基团为链亲和素。

　　进一步地，所述可检测标记分子选自寡核苷酸分子、多肽分子、多糖分子、树形高分子、人工合成的高分子。

　　更进一步地，所述可检测标记分子为寡核苷酸分子。

　　进一步地，所述可独立检测的标记基团选自荧光基团、同位素、磷酸酶、抗原。

　　本发明还提供了一种人乳头瘤病毒的快速检测试剂盒，该试剂盒包括：上述的液相芯片、偶联缓冲液、杂交缓冲液和标记检测试剂。

　　最后，基于上述的液相芯片和试剂盒，本发明提供了一种人乳头瘤病毒的快速检测方法，包括以下步骤：

　　(a)对权利要求1所述的液相芯片的微球载体进行标记；

　　(b)将权利要求1的不同HPV型别的核苷酸捕获探针包载于步骤(a)的被标记的微球载体上；

　　(c)提取待测样品中目标核酸分子，对目标核酸分子进行可检测性标记；

　　(d)使经包载的不同HPV型别的核苷酸捕获探针与步骤(c)的经可检测性标记的目标核酸分子杂交；和

　　(e)检测杂交产物。

　　与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

　　(1)本发明利用人工合成的、带有一定量可检测基团的标记分子，实现了对微粒载体的精准定量标记，显著提高了对同一类微球载体标记的稳定性和可区分度。

　　(2)基于本发明的微粒载体的标记和鉴定方法，本发明提供的HPV检测芯片、试剂盒及方法能一次检测24种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染漏检的缺陷，实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测；同时可进行所需型别的分型检测。

　　(3)相较于现有技术中HPV分型检测需PCR扩增，从而导致PCR扩增后多余的游离核苷酸影响后续的特异性杂交反应，从而使检测结果的信噪比差的缺陷，本发明的检测方法不需要使用PCR扩增即可实现HPV的分型检测，操作简单，具有高通量、高精度的优点。

　　附图说明

　　图1为本发明的人乳头瘤病毒的快速检测方法流程图。

　　图2为HPV-18、HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59内参分子标准曲线。

　　图3为HPV-68a、HPV-68b、HPV-82、HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-70、HPV-73、HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43内参分子标准曲线。

　　具体实施方式

　　下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。可以从材料、方法和反应条件等方面对本发明所公开的内容进行改进，所有这些改进均应落入本发明的范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

　　本发明提供的核酸检测方案包括六个操作步骤：微球载体的荧光标记、捕获探针包载、核酸样本提取、核酸样本的荧光标记、液相杂交和杂交信号分析。

　　实施例1：液相芯片的制备

　　1、捕获探针序列的设计合成

　　针对HPV-18、HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b、HPV-82、HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-70、HPV-73、HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43共24种型别的核酸序列，分别设计合成与其序列互补的捕获探针，捕获探针序列如SEQ ID NO：1-24所示。合成捕获探针，在其5'末端偶联生物素基团，使其能够与琼脂糖微球表面的链亲和素基团偶联。捕获探针序列如表1所示：

　　表1不同HPV型别的核苷酸捕获探针

　　将每4个型别的HPV病毒(计4个捕获探针)作为一组进行检测，分组情况如下。第一组：HPV-18、HPV-16、HPV-31、HPV-33；第二组：HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51；第三组：HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59；第四组：HPV-68a、HPV-68b、HPV-82、HPV-26；第五组：HPV-53、HPV-66、HPV-70、HPV-73；第六组：HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43。

　　2、微球载体的荧光标记

　　本实施例使用的微球载体为购自GE Healthcare Bio-Sciences公司的琼脂糖微球(StreptavidinHigh Performance，17-5113-01)，该微球表面偶联有可与生物素结合的链亲和素分子。用于荧光标记(荧光编码)琼脂糖微球的标记分子为人工合成的寡脱氧核糖核酸分子，其序列如SEQ ID NO：25所示，3'末端均含有生物素基团，使其能够与琼脂糖微球表面的链亲和素分子基团偶联。此外，这两个分子的5'-末端均具有可检测的荧光基团，标记分子1的荧光标记为：5’-Alexa 488-aaaaaaaaaa-biotin，标记分子2的荧光标记为：5’-Texas Red-aaaaaaaaaa-biotin。

　　标记反应：在75μL的总反应体系中，加入一定量的琼脂糖微球(本实施例反应中，加入5×103个琼脂糖微球)。加入一定量的标记分子1和一定量的标记分子2，两者的总浓度为0.2pmol/μL(本实施例反应中，加入0.1pmol/μL的标记分子1和0.1pmol/μL标记分子2)。根据加入标记分子1和标记分子2的相对含量，可对不同的琼脂糖微球进行可识别的差异化编码。

　　用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物，荧光编码四种琼脂糖微球。其中，用于包载HPV-18捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-16捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-31捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-33捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　用于包载HPV-35捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-39捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-45捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-51捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　用于包载HPV-52捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-56捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-58捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-59捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　用于包载HPV-68a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-68b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-82捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-26捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　用于包载HPV-53捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-66捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-70捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-73捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　用于包载HPV-6捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝4:1，用于包载HPV-11捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝2:1，用于包HPV-42捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:2，用于包载HPV-43捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为：标记分子1的浓度/标记分子2的浓度＝1:4。

　　3、捕获探针包载

　　将内参核酸捕获探针(内参核酸捕获探针序列如SEQ ID NO：26所示(capture-reference：5’-biotin-aaaaaaaaaa agtcagtcag tcagtcagtc agtcagggcc agtcca)、各种型别HPV特异性的捕获探针分组包载于琼脂糖微球表面，每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针。

　　捕获探针的包载反应如下：在100μL反应体系中，加入5×103个琼脂糖微球、终浓度10pM的内参核酸捕获探针，内参核酸捕获探针序列、终浓度40pM的各种型别HPV捕获探针。

　　4、待测样品中核酸样本提取

　　选择26份经测序法进行HPV检测与分型的宫颈样本。其中4份为低危型HPV单型感染，包括HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43感染各一份；5份为中危型HPV单型感染，包括HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-70和HPV-73各一份，15份为高危型HPV单型感染，包括HPV-18、HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b和HPV-82各一份；另外2份为混合型感染(HPV-6&HPV-18，HPV-42&HPV-16)。按照常规的技术方案，提取其中的核酸成分。为了检测总RNA样本的质量，取一定量的RNA样本，上样到8％的变性PAGE凝胶上，进行电泳分离。观察18S、28S rRNA条带的完整性和含量的关系，确定所提取的总RNA样本的质量是否合格。对于检测合格的总RNA样本，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计(NanoDrop Technologies)进行定量，储存于-80℃冰箱中备用。

　　5、核酸样本的荧光标记：利用Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒，对获得的总RNA及参入的内参核酸(内参核酸序列如SEQ ID NO：27所示)进行荧光标记。按照试剂盒的说明书进行操作，步骤具体如下：1)取5μg总RNA样本，加入DNase/RNase-free去离子水至40μL，加入10×Labeling BufferA 5μL，Label IT Reagent 5μL，总反应体积为50μL；2)将反应体系置于37℃条件下孵育1小时；3)使用G50 Microspin纯化柱纯化标记后的样本，用于随后的液相杂交反应。

　　6、液相杂交

　　将包载了捕获探针的微球载体与经可检测性标记的目标核酸分子杂交，杂交反应过程为：在一个40μL杂交体系中，加入一组四种等量的包载不同HPV型别捕获探针的琼脂糖微球，每种微球的使用量为2×103。向反应体系中加入上述获得的荧光标记的核酸样本400ng，在25℃条件下孵育40分钟，完成杂交反应。

　　7、杂交信号分析：使用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screeningand Analysis系统，获得微球载体的杂交荧光图像。利用该系统的Columbus图像数据存储和分析系统(Columbus Image Data Storage andAnalysis system)，分析获得的荧光图像，对目标核酸进行定性和定量分析。分析过程具体如下：

　　1)背景荧光的去除：在每个反应中，均包括一定量无任何包被的原始形态的参照微球，用于去除检测过程中产生的背景荧光信号。利用这些参照微球，确定各个荧光通道的背景值。在去除荧光背景的情况下，完成后续分析。

　　2)琼脂糖微球的荧光编码：通过计算每个微球A488荧光值与Texas Red荧光值的比值，确定该微球的荧光编码比值(A488/Texas Red)。以某种微球荧光编码的理论值为基准，确定位于该基准值附件的微球，作为该荧光编码微球的候选群体。获得每个候选群体中间80％的微球个体，用于后续分析。

　　3)目标核酸的荧光定量：检测每个编码微球的Cy5荧光值，减去背景荧光值、以及由于荧光干涉造成的误差荧光值，获得该微球目标核酸的荧光检测值。

　　4)目标核酸的分型、相对和绝对定量：利用目标核酸分子与内参分子的标准校准曲线(calibration curve)，对目标核酸分子分型，并计算目标核酸分子的含量，检测结果如表2所示。

　　表2 26份样本检测结果

　　结果表明根据加入标记分子1和标记分子2的相对含量，可对不同的琼脂糖微球进行可识别的差异化编码，通过荧光检测能区分具有不同荧光编码的琼脂糖微；基于对不同荧光编码的琼脂糖微球进行鉴别，用待测样品的不同型别的HPV核酸分子与内参分子的标准校准曲线(如图2和图3所示)，计算目标核酸分子的含量。

　　以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

　　序列表

　　<110> 武汉尚码生物科技有限公司

　　<120> 一种人乳头瘤病毒的快速检测方法、液相芯片及试剂盒

　　<160> 27

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 47

　　<212> DNA