通过经改良酵母菌株酿酒酵母在高温下生产高量乙醇的方法
技术领域
本发明涉及保藏在印度普纳(Pune)的IDA微生物培养物保藏中心(Microbial Culture Collection)的经改良酵母菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Devleela-1，其登录号为MCC 0069，并且涉及通过改良酵母菌株在高温生产高量乙醇的方法。更具体地说，经改良的酵母菌株酿酒酵母在25℃至44℃的温度范围以高浓度产生乙醇。经改良的酵母菌株是耐渗透、耐乙醇、耐热和自絮凝的。
背景技术
化石燃料资源的枯竭为可再生能源需求的持续增长创造了条件。最常见的燃料来源之一是与汽油混合的乙醇。其他行业也使用乙醇，因此对乙醇的需求也在不断增加。存在几种方法，其中全植物材料或全谷物被转化成淀粉，淀粉可以从原始来源分离，或者淀粉在发酵之前直接转化成糖。还存在糖蜜或甘蔗汁、甜菜根糖蜜也用于发酵生产乙醇的方法。然后使用不同的酵母菌株进行发酵。在任何一种情况下，重要的是要有能够在最短时间内生产大量乙醇的酵母菌株。
发酵后，将乙醇蒸馏、纯化、浓缩并脱水，然后用作燃料乙醇或作为可饮用乙醇或用于其他工业应用。因此，发酵液中乙醇浓度越高，下游加工成本越低。发酵后的良好回收也减少了在释放到环境中之前需要处理的支流(affluent)量。因此，一个好的商业酵母菌株应该产生高浓度的乙醇，为此它应该能够在高浓度的乙醇(耐乙醇)、高温(耐热)的情况下在高浓度的糖(耐渗透)下生长，并且应该是自絮凝的。由于世界各地的甘蔗种植区域都具有长期的高环境温度季节，因此酵母菌株的耐热性是任何商业/工业酵母菌株最需要的特性之一，因此，具有在高温下产生高浓度乙醇的酵母菌株将是乙醇工业的福音。
自絮凝是酵母用于乙醇发酵的理想特性。絮凝意味着一旦发酵或搅拌结束，大部分微生物群体将沉积在底部。因此，自絮凝有助于蒸馏过程。如果菌株不收集在底部，那么它往往阻塞蒸馏塔。
在使用酵母生产乙醇中有许多协同应激因素。酵母生长在25℃-32℃的最佳温度范围内。在这个温度范围之上，会出现发酵抑制。高温导致细胞活力下降，以及质膜线粒体和流动性的变化，并且它还增加酵母对乳酸和乙酸的敏感性，这导致较低的乙醇产率。此外，高乙醇可引起酵母中重要的代谢变化，如ATP酶抑制，若干种糖酵解酶的变性和细胞壁的变化。
乙醇生产过程涉及使用糖蜜和甘蔗汁或其他糖来源(如植物材料或谷物)，其研磨为湿的或固体的，将来自这些原料的淀粉和其他木质纤维素材料转化为糖，然后使用酵母菌株通过在室温下发酵的过程将糖转化为乙醇，这在文献中有充分记载。然而，在高温下也会遇到挑战。
本领域技术人员努力通过改善待使用的酵母菌株的性质并且有时通过改变发酵过程来改进乙醇发酵的过程(Benjaphokee等,2012N.Biotechnol.29(3)379-386；Lu等,2012,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.39(l)73-80；Morimura等,1997,J.Fermen.Bioeng.83(3)271-274；Banat等,1992,W.J.Microbiol.Biotechnol.8(3)259-263)。据估计，即使乙醇产率增加1％也会为乙醇产业每年产生1亿美元的商业价值。Torija MJ的文章“Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae”,International Journal of Food Microbiology 2003Jan 15；80(1):47-53报道，酵母细胞的活力在高温(特别是在35℃)降低。它还报道了由于乙醇在升高的温度下的抑制作用，高温下醇的产率较低。
专利CN 103232948 B公开了一种酿酒酵母的耐高温菌株和培育方法。引用的文献公开了在38℃的高温乙醇产率为3.9％(v/v)。此外，它公开了在40℃的高温乙醇产率为12.2％(v/v)。
WO 2014/170330公开了涉及最大醇积累能力和对高醇水平耐受性的酵母等位基因。
EP2837698A1公开了浓度在14％(v/v)-16％(v/v)之间的具有耐乙醇性的酿酒酵母菌株。该菌株可用于通过发酵生产食品(包括饮料)，优选通过必须型获得的食品，比如葡萄酒、啤酒或苹果酒等。发酵在16℃至28℃的温度下进行。
WO2014180820 A2公开了酵母细胞，其经过遗传修饰，具有0.5OsM或更高的渗透压耐受性。
因此，本领域需要开发一种产生高量乙醇的经改良的酵母菌株，其具有诸如耐热性、耐渗透性、耐乙醇性、自身絮凝的性质。提供增加的乙醇浓度的乙醇生产改进方法具有显着的经济、环境和工业优势。
本发明的目的
本发明的主要目的是提供具有MCC登录号0069并具有诸如耐热性、耐渗透性、耐乙醇性和自絮凝等性质的经改良的酵母菌株酿酒酵母。
本发明的另一个目的是提供一种通过经改良的酵母菌株生产乙醇的方法。
本发明的另一个目的是提供一种获得经改良的酵母菌株的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产有待用作燃料、溶剂、可饮用乙醇和工业应用的乙醇的方法。
发明概述
本发明提供了具有登记号MCC 0069并具有耐热性、耐渗透性、耐乙醇性和自絮凝的性质的经改良的酵母菌株酿酒酵母。在本发明的一个实施方案中，登记号为MCC 0069的经改良的酵母菌株是自然选择的并经UV暴露。
本发明的一个实施方案还包括利用酵母酿酒酵母经改良的菌株产生增加量的乙醇的方法。
在本发明的另一个实施方案中，经改良的酵母菌株是耐热的。
在本发明的另一个实施方案中，经改良的酵母菌株在生长时耐渗透，并且发酵高浓度的蔗糖和其他单糖和二糖并且产生高浓度/高产率的乙醇，因此也是耐乙醇的。
在本发明的另一个实施方案中，经改良的酵母菌株是自絮凝的。
在本发明的另一个实施方案中，在高温、高糖浓度和高乙醇浓度下使用经改良的酵母酿酒酵母菌株实现了高乙醇生产，导致输入成本显着降低、下游加工改进和支流量减少，因此降低支流处理费用。
在本发明的另一个实施方案中，用于获得经改良的酵母菌株的方法包括以下步骤：
a)使酿酒酵母菌株经受45℃至47℃的温度范围和20％可发酵糖浓度以获得经选择的菌株；并且
b)用紫外光处理所述经选择的菌株以获得经改良的酵母菌株。
在本发明的一个实施方案中，提供一种生产有待用作燃料、溶剂、可饮用乙醇和工业应用的乙醇的方法。
附图的简要说明
图1涉及改良酵母使用20％甘蔗糖蜜在30℃的乙醇生产，其中X轴表示温育时间(小时)，Y轴表示乙醇百分比。
图2涉及改良酵母使用20％甘蔗糖蜜在37℃的乙醇生产，其中X轴表示温育时间(小时)，Y轴表示乙醇百分比。
图3涉及改良酵母使用20％甘蔗糖蜜在42℃的乙醇生产，其中X轴表示温育时间(小时)，Y轴表示乙醇百分比。
图4涉及在30℃使用甘蔗糖蜜作为底物在8小时、10小时、12小时和24小时温育下分离的酵母菌株和经改良的酵母菌株的乙醇生产的比较。系列1代表分离的未经改良的酵母菌株，系列2代表经改良的酵母菌株。X轴表示温育时间，Y轴表示乙醇百分比。
图5涉及在37℃使用甘蔗糖蜜作为底物在48小时、54小时和72小时温育下分离的酵母菌株和经改良的酵母菌株的乙醇生产的比较。系列1代表分离的未经改良的酵母菌株，系列2代表经改良的酵母菌株。X轴表示温育时间，Y轴表示乙醇百分比。
图6涉及HPLC特征曲线(A)本发明生产的乙醇的HPLC特征曲线[HPLC特征曲线显示甘蔗糖蜜发酵期间的乙醇生产几乎没有任何污染](B)纯乙醇的HPLC特征曲线。
发明详述
要注意的是，这里使用的任何术语都不是仅仅描述特定的实施方案，并且不限制其范围或其他情况。实例是：使用单数形式的“一种”，“一个”和“该、所述”也可以包括复数引用，除非在文中明确指出或提及。任何偏差会在文中明确指出。例如“一个要素”或“一种方法”可能意味着一个或多个要素和一种或多种方法。所有单位，前缀和符号可以用SI接受的形式表示。
说明书中提到的数字范围包括定义范围的数字，并包括定义范围内的每个整数。
除非另外定义或指示，否则这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施方案所属领域的技术人员通常理解的相同含义。在实践本发明的实施方案的同时，可以使用许多类似于这里描述的那些的材料和方法或那些的材料和方法的经修改的或等同的材料和方法，而没有对这里描述的优选材料和方法进行任何过度实验。在描述本发明的实施方案和权利要求时提供的标题不是对本发明的实施方案的限制。根据下述定义使用以下术语。术语“产生醇或乙醇的微生物”指能够从任何糖源发酵和生产乙醇的任何生物体，包括酵母，所述糖源例如源自任何来源例如甘蔗、木质纤维素材料、谷物或蔬菜的单糖、二糖或低聚糖。
术语“发酵”指的是微生物对有机物质进行酶、厌氧、半厌氧或有氧分解，其中糖转化为乙醇、二氧化碳(废物)和细胞能量。发酵方法和其他步骤或通过发酵(包括终产物的分离、蒸馏、乙醇的纯化和变性或脱水)的乙醇生产方法是本领域已知的并且充分记载。
术语“耐渗透性”意指能够从高浓度糖生长和生产乙醇的酵母菌株，其中糖可以是单糖、二糖或来自任何来源的木质纤维素或淀粉糖化后存在的任何糖。
术语“糖化”意指通过酶的作用将淀粉或其他木质纤维素材料转化为糖如单糖、二糖、寡糖等。糖化方法在本领域中是公知的，并且可以由本领域技术人员进行。
术语“乙醇(醇)耐受性”意味着酵母在高浓度乙醇存在下产生和发挥功能的能力，例如在含有高浓度乙醇的培养基中生产乙醇。术语“耐热性”意指选择的酵母菌株在高温下生长并保持功能性的能力，例如乙醇生产。
术语“菌株”意指在本发明描述的条件下产生乙醇的功能性酵母菌株，或其在本文中描述的突变体，例如酵母酿酒酵母菌株。术语功能性酵母或突变体是指通过遗传改良直接或间接获得的酵母菌株，包括通过使用化学试剂或紫外光诱导的突变或通过自然选择或自发突变，这可以通过任何方式或通过使用保留了酵母菌株酿酒酵母菌株的耐乙醇性、耐热性和耐糖性的参照菌株来达到。
术语“产率”通常是指通过实例和各种实施方案通过在此描述的方法在发酵过程中产生的终产物例如各种类型的乙醇(包括燃料乙醇、工业乙醇或可饮用乙醇)的量。产率还可以指发酵液中终产物的浓度、体积、百分比或浓度，以及通过测量终产物的任何其他手段。在本发明中测量的优选终产物是醇，更确切地说是乙醇，可以使用本领域技术人员已知的方法将其分离、纯化和浓缩。在本发明的一些实施方案中，使用酵母菌株酿酒酵母的乙醇产率在9％至21.82％v/v乙醇的范围内，包括如本发明所述的其间的所有整数和分数。
本发明生产的乙醇被用作生物燃料、溶剂、可饮用乙醇并用于工业应用。
酵母菌
本发明提供来自印度恰蒂斯加尔州(Chhattisgarh)巴斯特(Baster)地区的经选择的酵母菌株，并测试其相比于目前使用的工业酵母菌株并且在印度使用的发酵条件下的改进/增强的乙醇生产。
根据布达佩斯条约条款，酵母菌株酿酒酵母被保藏在印度普纳(Pune)的公认的国际保藏机构微生物培养物保藏中心(Microbial Culture Collection)并且保藏号为MCC 0069。
从具有高水平干物质的发酵植物提取物中分离的20种酵母菌株的组中选择酵母菌株酿酒酵母。经过大量实验之后，首先纯化存在于发酵植物材料中的酵母菌株，在实验室中保持纯培养物，通过将酵母菌株接种在含有可发酵糖的未处理糖蜜中检查其在高温下的生长(取决于至少在印度的从工厂到工厂以及区域到地区的甘蔗汁糖变化的精制工艺)。在自来水中制备稀释液，与琼脂混合，加热溶解琼脂，然后铺在皮氏培养皿上(如果需要，可以高压灭菌糖蜜)。所有二十种天然分离物都在含有以下物质的培养基上进一步生长：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、当需要时(该培养基将被称为YPD)和玻璃蒸馏水。在无菌玻璃蒸馏水中制备每种天然分离物的连续稀释液，测量光密度，并通过将其分散在YPD平板上计数该光密度下的细胞数/ml。为了选择对高温最耐受的菌株以及糖蜜中的糖浓度，将所有20种分离物分别悬浮于无菌蒸馏水中以获得细胞数。将每种分离物铺在糖蜜平板上。分别将来自每种分离物的二十个板在高温下温育，直到看到生长。在最初选择用于筛选的20种菌株中，17种在高温下没有显示出任何生长，因此被丢弃。使用具有平均菌落数/平板的三种分离物用于进一步研究。然而，菌落是大小不等的混合物，因此，对于下一组实验，所有小的菌落都被丢弃。将在此选择的大菌落进一步铺在如上所述的糖蜜平板上，并重新检查其生长。将这些集落中的每一个悬浮在YPD培养基中并铺在如上所述的糖蜜平板上以获得单菌落并且还重新检查它们不是酵母细胞的小菌落形成单位和大菌落形成单位的混合物并且是稳定的克隆。在这个阶段，在选择用于进一步研究的三个分离株中，两个被丢弃，因为这两个分离株的单菌落再次产生小菌落和大菌落的混合物，表明这些分离物在这里使用的严格选择过程(高温和高的糖蜜糖浓度)中不稳定。在目前的实验装置中，每个菌落都来源于单个酵母细胞，并且设计这些实验的目的是为了选择群体中存在的突变体，其将在高温下发酵高浓度的糖产生大量的乙醇。重新接种后，选择在糖蜜平板上在高温生长良好的三个菌落(从现在开始称为克隆)用于进一步研究。如本文前面所述，用这些克隆重复进行的生长研究显示，所有三个克隆均产生均一大小的克隆，这表明这些克隆在高糖浓度和高温下都是稳定的。然后测试所有三个克隆从糖蜜的乙醇产量，不进行任何补充。在这里，又有两个克隆因为醇产量低而被丢弃。所述两个克隆产生的醇的量在37℃和40℃时为～12％醇，而第三个克隆在37℃和40℃时都产生～14％醇，但残留糖约为7-8％。最后，只选择了一个克隆。将来自该克隆的在无菌蒸馏水中的10×106个细胞/ml(在直径～9厘米的无菌培养皿中5ml)暴露于UV[紫外]光并且在含有～20％可发酵糖的糖蜜板上在45℃-47℃铺板。在整个选择过程中，使用含有以下项的未纯化糖蜜：非常高量的盐、可能对许多微生物有毒的其他金属、可发酵的糖和一些不可发酵的糖。
选择10个显示出良好生长的随机菌落并在高温下测试稳定性和乙醇产量，最后仅选择一个克隆并命名为Devleela-1。该菌株被鉴定为酿酒酵母并且已经被保藏在印度普纳(Pune)的IDA微生物培养物保藏中心并且保藏号为MCC 0069。
表1：关于分离的酿酒酵母菌株，选择的酿酒酵母菌株和UV暴露的酿酒酵母菌株的性质的比较数据
UV暴露的酿酒酵母菌株比自然选择的酿酒酵母菌株产生更多的醇，残留糖的百分比几乎为零，并且接种物被使用5次而醇生产效率没有改变。由于其产生了更多的醇，其也比自然选择的酿酒酵母菌株更耐受乙醇。
在糖蜜中的不同浓度的可发酵糖下并且在不同温度下分别测试乙醇产量。在第一组中，测试了在25℃从6％至15％的可发酵糖浓度范围的乙醇产量。类似地，在其他温度，例如30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、44℃和45℃，测试乙醇生产。选择的标准是在高于30℃的温度的最大乙醇产量，优选在最短时间内。还测试了在以下情况下的乙醇生产：通过以170rpm温育来制备种子培养物，但是在温育后，在所需温度下在静态条件下继续发酵。
在具有不同浓度的可发酵糖的烧瓶中在自来水中稀释的糖蜜中进行乙醇发酵，这些可发酵糖在120℃高压灭菌20分钟。通过在不同浓度的糖蜜中分别接种三个克隆中的每一个并在25℃-37℃下使它们生长18-20小时来制备第一种子物或起始培养物。该起始或种子培养物用于接种新鲜糖蜜。将烧瓶在需要的温度下在170rpm的旋转振荡器中温育，并且在不同的时间段后测试乙醇生产。将整个发酵液蒸馏并收集乙醇。在这个过程中，可以收集原始体积的50％。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。在选定的在45℃生长的三个克隆中，其中一个克隆即使在30℃也未能产生超过12％v/v的乙醇，因此被丢弃。尽管两个克隆在30℃产生了超过14％的乙醇，但其中只有一个克隆在30℃以上的温度产生了超过14％v/v乙醇，并被选中进一步研究。该菌株通过在45℃在含有20.6％可发酵糖的糖蜜中生长并且生产乙醇而进一步被测试。确认现有的经改良菌株稳定后，将其命名为Devleela-1。
在本发明的实施方案中，通过在发酵过程中使用经改良酵母酿酒酵母作为乙醇生产微生物实现了增强的乙醇生产方法，从而导致提高的醇产率。
糖和乙醇耐受性
在一个实施方案中，经改良的酵母菌株显示在高蔗糖浓度中生长，所述蔗糖含有存在于作为甘蔗糖蜜的甘蔗工业废产物中以及未经提纯和未经稀释或经稀释的甘蔗汁中的其它干物质。存在于这些可发酵培养基中的蔗糖和其他还原糖(没有任何补充或者存在无机盐形式的氮源，所述无机盐为铵盐或硝酸盐、脲、镁盐以及钾盐或磷酸盐或镁盐)被经改良的菌株利用来生长并发挥功能并将这些糖转化成乙醇。在这些培养基中，可发酵的还原糖可以从5％变化到35％，特别是蔗糖。然而，在30℃至45℃的温度范围，经改良酵母菌株可容易地在未处理的70％糖蜜浓度(具有45％的还原糖)中生长。还原糖可以是单糖或二糖或任何其他形式的糖。
高温下的可持续发酵和高乙醇产量导致开支减少，因为发酵器不需要冷却或冷冻以及通常用于在发酵期间维持酵母活力的其他手段。因此，在高温在高浓度乙醇生产中使用耐热酵母菌株是经济的、环境友好的和技术上有益的。
乙醇生产
根据本发明，乙醇是来自本文所述的要求保护的方法的经改良的酵母菌株发酵期间优选的最终产物。在优选实施方案中，乙醇产率在9％至21.82％(v/v乙醇产量)的范围内。从本发明要求保护的方法获得的乙醇产率通过化学方法以及高压液相色谱(HPLC)分析来鉴定。在这里描述的实施方案中，更高的乙醇产率导致投入成本更低、更经济地实现乙醇生产。
继续乙醇生产的发酵过程直至产生足够产率的乙醇。发酵过程可以进行20小时到80小时或更长的时间。根据本发明，本领域技术人员将能够确定本发明中描述的任何变量，例如发酵培养基中的糖浓度，发酵的长度或发酵温度，以通过利用经改良的酿酒酵母菌株产生期望的乙醇产率。
本发明提供了用于乙醇生产的方法并且包括经改良的酿酒酵母菌株、特别是在液体培养基中含有糖的培养基。如本发明所述，在支持酵母的生长和增殖的温度下进行改良的酵母菌株的培养。除了至少一种糖，所述培养基还可以含有一种以上的糖，可以或可以不含有氮源(如无机盐或有机盐)或氮的任何其他来源(例如蛋白胨、大豆膳食等)、氨基酸、或其他支持经改良的酵母菌株生长的化学盐。合适的培养基包括例如使用甘蔗(所述甘蔗是甘蔗汁或者在蔗糖生产过程中的不同加工阶段获得的糖蜜)生产的培养基，补充或者没有补充氮源或者其他生长和增殖辅助性化学盐或者天然材料。
在本发明的一个实施方案中，通过降低残留可发酵糖水平的量来证明高乙醇产量。更低的残留可发酵糖水平是乙醇生产速率和数量的指标。一个理想的乙醇生产将是以下条件：残留的可发酵糖为0％，乙醇产量为100％，然而，这是不可能的，因为一些数量的糖将用于微生物的生长、增殖和维持。100％糖的利用提高了底物的完全使用，从而显着降低了乙醇生产的投入成本。
由于糖向乙醇转化的增加，经改良的酿酒酵母菌株产生更多的乙醇和更少的残留糖。在本发明的优选实施方案中，残糖水平小于1％，优选0.3％，更优选0.02％。更低的残留糖水平是在温度高于30℃，优选高于35℃或在37℃或在40℃达到的。
在另一个实施方案中，虽然保持高糖耐受性、高耐乙醇性和高温耐受性，但是证实在发酵过程中应激较少或没有应激，因为观察到在发酵过程中酵母菌株不产生甘油。乙醇发酵过程中的甘油产量是产生甘油而非乙醇的应激指标。经改良的酵母菌株在本发明所述的温度范围内不产生任何甘油。
本发明的实施方案在非限制性实施例中再次被定义。应该理解的是，这些实施例虽然指示了本发明的某些实施方案，但仅通过说明提供。从上面的讨论和这里给出的例子中，任何本领域技术人员将能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方案进行各种改变和修改使本发明适应各种用途和条件。
实施例
实施例1
获得酿酒酵母的经改良的酵母菌株的方法
从发酵植物提取物分离的20种酵母菌株的组中选择具有高水平干物质的酿酒酵母菌株。经过大量实验之后，首先纯化存在于发酵植物材料中的酵母菌株，在实验室中保持纯培养物，通过将酵母菌株接种在45℃-47℃的高温下在含有超过20％可发酵糖的未处理糖蜜中检查它们的生长，糖蜜浓度可以在55％-60％之间变化。在这里，从工厂收到的糖蜜被认为是100％)，并在自来水中进行稀释，与1.2％琼脂混合，加热溶解琼脂，然后铺在培养皿上。
直接选择酵母菌株在不同浓度的糖蜜中生长，例如从印度各地的不同糖厂收集到的从10％到70％糖蜜。取决于糖蜜的来源，这里使用的糖蜜中的可发酵糖浓度优选蔗糖连同其他可发酵糖一起在45％至60％之间变化。从糖厂接收的糖蜜浓度被认为是100％，并根据需要用水稀释，同时还考虑糖蜜的稀释或工作浓度中可发酵糖的浓度。此处所述的酵母菌株在未纯化的在水中稀释的70％糖蜜浓度中生长。
所有二十种天然分离物都在含有以下物质的培养基上进一步生长：酵母提取物(10克)、蛋白胨(10克)、葡萄糖(10克)、琼脂(10克)并且当需要时(该培养基称为YPD)玻璃蒸馏水1000毫升。在1ml无菌水中制备每种天然分离物的系列稀释液，测量600nm(纳米)处的光密度，并通过将其分散在YPD平板中计数在该光密度下的细胞数/ml。为了选择对高温最耐受的菌株以及糖蜜中的糖浓度，将所有20种分离物分别悬浮于无菌蒸馏水中以获得106个细胞/毫升(ml)。将100微升的每种分离物涂布在糖蜜板上，其中每块板的直径为约9厘米。将来自每种分离物的二十个平板分别在45℃和47℃下温育直至看到生长。
在最初选择用于筛选的20种分离株中，17种在45℃时不显示任何生长，因此被丢弃。使用具有平均300个菌落/平板的三种菌株用于进一步研究。然而，菌落是大小不等的混合物，因此，对于下一组实验，所有小的菌落都被丢弃。将在此选择的大菌落进一步铺在如上所述的糖蜜平板上，并重新检查其生长。这个过程重复了5次以上(随机数)，并且选择了来自三种原始分离物中每一个的显示良好生长的10个菌落。将这些菌落中的每一个悬浮在1ml YPD培养基中并铺在如上所述的糖蜜平板上以获得单菌落并且还重新检查它们不是酵母细胞的小菌落和大菌落形成单位的混合物并且是稳定的克隆。在这个阶段，在选择用于进一步研究的三种分离株中，两种被丢弃，因为这两种分离株的单个菌落再次产生小菌落和大菌落的混合物，表明这些分离物在这里使用的严格选择过程中不稳定(高温和高糖浓度的糖蜜)。在目前的实验装置中，每个菌落都来源于单个酵母细胞，并且设计这些实验的目的是为了选择群体中存在的突变体，其将在高温下发酵高浓度的糖产生大量的乙醇。重新接种后，选择在45℃和47℃在含有20％可发酵糖的糖蜜平板上显示良好生长的三个菌落(从现在开始称为克隆)用于进一步研究。如前文所述，用这些克隆重复进行的生长研究表明，所有三个克隆都产生了均一大小的克隆，这表明这些克隆在高糖浓度和高温下都是稳定的。然后测试所有三个克隆从糖蜜(不进行任何补充)的乙醇产量。在这里，这些克隆中又有两个因为醇产量低而被丢弃。
通过化学方法在30℃使用不同浓度的糖蜜针对乙醇生产筛选在更高浓度的糖蜜下(20％的糖蜜和高于20％的糖蜜)生长的酵母菌株(EA Crowell和C.S.Ough.Am.J.Enol.Vitic 1979，30，1,61-63)。将在具有不同浓度的可发酵糖的100ml烧瓶中在自来水中稀释的50ml糖蜜在120℃高压灭菌20分钟。通过在不同浓度的糖蜜中分别接种三个克隆中的每一个并在30℃下使它们生长20小时来制备第一种子物或起始培养物。该起始或种子培养物用于接种新鲜的50ml糖蜜，其中最终接种物浓度为10％。将烧瓶在需要的温度下在170rpm的旋转振荡器中温育，并且每6.0小时测试乙醇生产直至培养72小时。将整个50ml发酵液蒸馏并收集乙醇。在这个过程中，实现了近50％的回收率。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
最后，仅选择一个克隆，并将来自该克隆的1×106个细胞/ml暴露于UV[紫外]光12ergs/mm2 20秒，以获得在45℃在含有20％可发酵糖的糖蜜板中的1.1％存活率。在整个选择过程中，使用未纯化糖蜜，其含有非常高量的盐、可能对许多微生物有毒的其他金属、可发酵的糖和一些不可发酵的糖。
实施例2
使用糖蜜进行乙醇发酵
将在不同浓度的糖蜜中观察生长后选择的产生最高乙醇的菌株然后在25℃至44℃的不同温度下测试乙醇生产。在另一个实验中，在不同时间段使用最佳温度测试乙醇生产，其中在接种6小时、12小时、20小时、24小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时，66小时和72小时直至96小时后的不同时间范围测试醇生产。经改良的酿酒酵母菌株产生乙醇的最大产率。
实施例3
重铬酸钾试剂的制备
将0.5克重铬酸钾溶于5ml玻璃蒸馏水中并将溶液保持在冰中。之后，缓慢加入45ml浓硫酸，偶尔混合内容物。该溶液继续在冰中再冷却约60分钟并避光。
实施例4
乙醇估算
将1ml乙醇样品/蒸馏产物与1ml重铬酸钾试剂混合，彻底混合后，将溶液置于预置在80℃的水浴中10分钟。然后将其冷却至室温，并在575nm处对比普通水制备的空白而记录光密度。根据使用无水乙醇制备的标准曲线计算醇浓度。
实施例5
用二硝基水杨酸法估算可发酵糖
二硝基水杨酸(DNS)试剂的制备
在蒸馏水制成的100ml 1％氢氧化钠溶液中，将1.0克二硝基水杨酸，200毫克结晶苯酚和50毫克亚硫酸钠通过不断搅拌同时溶解。在所有成分溶解后，溶液在黑暗中储存直至使用。在使用前分开取出试剂量并加入少量亚硫酸钠，混匀并使用。
实施例6
使用DNS试剂进行糖估算
将糖蜜稀释至所需浓度，并且将1ml样品与1ml DNS试剂混合并在沸水浴中加热15分钟。冷却至室温后，在510nm处对比使用水制备的空白而测量光密度。使用利用葡萄糖制备的标准曲线计算糖浓度。
实施例7
残留的可发酵糖水平
如通过DNS方法(Miller,1959,Analytical Chemistry,31,426-428)所判定的，经改良的酵母菌株显示低残留可发酵糖和高乙醇产量。
残留糖水平低于1％，表明可发酵糖或还原糖转化为乙醇的高转化率。HPLC分析显示一些小的峰，其小于用乙醇获得的峰的1％，表明几乎所有可发酵糖都转化为乙醇。残留糖在37℃时最低，为0.02％，在35℃和40℃时略高，为平均0.21％。此外，发酵完成后，通过本发明使用的方法没有检测到残留糖水平。
虽然本发明描述了从甘蔗糖蜜和甘蔗汁中生产乙醇，但任何其他可发酵糖如植物提取物或含高糖的果汁等都将是同等优良的，并且本领域技术人员可以在此如实施例中描述的方法中作出各种修改并获得类似的结果。糖的来源的这类修改和改变也意图落入所附权利要求的范围和精神内。
表2：37℃发酵后的残留糖浓度
使用标准DNS方法在所需发酵时间后估计糖蜜的总糖。
实施例8
未经改良的分离的酵母菌株利用甘蔗糖蜜作为底物生产乙醇
a)在30℃和170rpm下在20％糖蜜中20小时准备“未经改良的分离的”酵母菌株在30℃种子培养物中生产乙醇。接种后在不同时间点移除烧瓶，并且用重铬酸盐法测定乙醇浓度。
表3：“未经改良的分离的”酵母菌株在30℃生产乙醇
b)在30℃和170rpm下在20％糖蜜中20小时准备“未经改良的分离的”酵母菌株在37℃种子培养物中生产乙醇。接种后在不同时间点移除烧瓶，并且用重铬酸盐法测定乙醇浓度。
表4：“未经改良的分离的”酵母菌株在37℃生产乙醇
c)“未经改良的分离的”酵母菌株在42℃生产乙醇，未经改良的分离的酵母菌株生长在42℃时相对较差。
实施例9
经改良的酵母菌株利用甘蔗糖蜜作为底物生产乙醇
a)经改良的酿酒酵母菌株生产乙醇。从当地制糖厂收集糖蜜，并通过标准DNS方法估计总糖。将含有50ml糖蜜的100ml烧瓶在pH 4.5-5.2的自来水中稀释(根据工厂糖蜜中存在的糖浓度)，并通过高压灭菌进行灭菌。使用20小时长的10％种子培养物(以用于发酵的糖蜜浓度为10％作为最终接种物浓度制备)接种每个烧瓶，并在30℃以170rpm温育。每次温育后取出两个烧瓶；蒸馏乙醇并使用重铬酸钾法估算其浓度。
表5：在30℃&170rpm下在20％甘蔗糖蜜中乙醇的百分比
b)经改良的酿酒酵母菌株生产乙醇。从当地制糖厂收集糖蜜，并通过标准DNS方法估计总糖。将含有50ml糖蜜的100ml烧瓶在pH 4.5-5.2的自来水中稀释(根据工厂糖蜜中存在的糖浓度)，并通过高压灭菌进行灭菌。使用20小时长的10％种子培养物(以用于发酵的糖蜜浓度为10％作为最终接种物浓度制备)接种每个烧瓶，并在37℃以170rpm温育。每次温育后取出两个烧瓶；蒸馏乙醇并使用重铬酸钾法估算其浓度。
表6：在37℃&170rpm下在20％甘蔗糖蜜中乙醇的百分比
c)经改良的酿酒酵母菌株生产乙醇。从当地制糖厂收集糖蜜，并通过标准DNS方法估计总糖。将含有50ml糖蜜的100ml烧瓶在pH 4.5-5.2的自来水中稀释(根据工厂糖蜜中存在的糖浓度)，并通过高压灭菌进行灭菌。使用20小时长的10％种子培养物(以用于发酵的糖蜜浓度为10％作为最终接种物浓度制备)接种每个烧瓶，并在42℃以170rpm温育。每次温育后取出两个烧瓶；蒸馏乙醇并使用重铬酸钾法估算其浓度。
表7：在42℃&170rpm下在20％甘蔗糖蜜中乙醇的百分比
实施例10
经改良的酵母菌株利用甘蔗汁作为底物生产乙醇
a)在0.5％硫酸铵存在下，UV改良的酵母菌株在30℃利用甘蔗汁进行乙醇生产。种子物在30℃下以170rpm 20小时来制备，然后用于接种发酵。将烧瓶在30℃在170rpm下温育，在如下表所示的不同时间点取出，并且通过重铬酸盐法测量醇浓度。
表8：在30℃&170rpm下在甘蔗汁中乙醇的百分比
b)甘蔗汁购自当地供应商，并且在自来水中稀释至20％，向其中加入0.5％硫酸铵(终浓度)。加入硫酸铵作为氮源以支持酵母生长。种子物在30℃下以170rpm 20小时来制备，然后用于接种发酵。将烧瓶在37℃在170rpm下温育，在如下表所示的不同时间点取出，并且通过重铬酸盐法测量醇浓度。
表9：在37℃&170rpm下在甘蔗汁中乙醇的百分比
c)在0.5％硫酸铵存在下，UV改良的酵母菌株在42℃利用甘蔗汁进行乙醇生产。种子物在30℃下以170rpm 20小时来制备，然后用于接种发酵。将烧瓶在42℃在170rpm下温育，在如下表所示的不同时间点取出，并且通过重铬酸盐法测量醇浓度。
表10：在42℃&170rpm下在甘蔗汁中乙醇的百分比
实施例11
经改良的酵母菌株利用水稻作为底物生产乙醇
a)使用水稻作为底物生产乙醇：将100g用120,00Uα-淀粉酶在85-90℃处理12小时，然后用250,00U葡糖淀粉酶在55-60℃处理12小时。然后向混合物中补充硫酸镁(40mg/100ml)、氯化铵(80mg/100ml)、磷酸氢二钾(140mg/100ml)、酵母提取物(40mg/100ml)。在30℃在170rpm 18小时来制备种子物。在30℃，170rpm下进行发酵。
表11：在30℃使用水稻作为底物生产乙醇
b)使用水稻作为底物生产乙醇：将100g用120,00Uα-淀粉酶在85-90℃处理14小时，然后用250,00U葡糖淀粉酶在55-60℃处理11小时。然后向混合物中补充硫酸镁(40mg/100ml)、氯化铵(80mg/100ml)、磷酸氢二钾(140mg/100ml)、和酵母提取物(40mg/100ml)。在30℃在170rpm 18小时来制备种子物。在37℃，170rpm下进行发酵。用重铬酸钾法测定乙醇浓度。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表12：在37℃使用水稻作为底物生产乙醇
c)使用水稻作为底物生产乙醇：将100g用120,00Uα-淀粉酶在85-90℃处理12小时，然后用250,00U葡糖淀粉酶在55-60℃处理12小时。然后向混合物中补充硫酸镁(40mg/100ml)、氯化铵(80mg/100ml)、磷酸氢二钾(140mg/100ml)、酵母提取物(40mg/100ml)。在30℃在170rpm 18小时来制备种子物。在40℃，170rpm下进行发酵。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表13：在40℃使用水稻作为底物生产乙醇
d)使用水稻作为底物生产乙醇：将100g水稻用120,00Uα-淀粉酶在85-90℃处理12小时，然后用250,00U葡糖淀粉酶在55-60℃处理12小时。然后向混合物中补充硫酸镁(40mg/100ml)、氯化铵(80mg/100ml)、磷酸氢二钾(140mg/100ml)、酵母提取物(40mg/100ml)。在30℃在170rpm 18小时来制备种子物。在42℃，170rpm下进行发酵。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表14：在42℃使用水稻作为底物生产乙醇
实施例12
经改良的酵母菌株利用珍珠粟(bajra)作为底物生产乙醇
在1200Uα-淀粉酶在85-90℃处理3小时、随后在25000U葡糖淀粉酶在55-60℃处理3小时后使用珍珠粟作为底物生产乙醇。然后向混合物中补充硫酸镁(7mg/100ml)、氯化铵(10mg/100ml)、磷酸氢二钾(50mg/100ml)。在30℃，170rpm下18小时来制备种子物，并在37℃，170rpm下进行发酵。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表15：在37℃使用珍珠粟作为底物生产乙醇
实施例13
经改良的酵母菌株利用玉米作为底物生产乙醇
用1200Uα-淀粉酶在85-90℃处理5小时、随后用200,00U葡糖淀粉酶在55-60℃处理18小时(两者都是商品级的)后使用玉米作为底物生产乙醇。使用各底物在30℃，170rpm下18小时来制备种子物。在37℃，170rpm下进行发酵。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表16：在37℃使用玉米作为底物生产乙醇
实施例14
经改良的酵母菌株利用香蕉树浆(banana trunk pulp)作为底物生产乙醇
使用香蕉树浆(木质纤维素底物)作为底物生产乙醇。在纸浆中补充氯化铵(50mg/100ml)、磷酸氢二钾(80mg/100ml)和硫酸镁(20mg/100ml)、酵母提取物(10mg/100ml)、氯化钙(10mg/100ml)。在纸浆中在30℃在170rpm 18小时来制备种子物。在37℃，170rpm下进行发酵。乙醇浓度用重铬酸钾法测定。每种情况下的残留可发酵糖也通过DNS(二硝基水杨酸)方法测试。
表17：在37℃使用香蕉树浆作为底物生产乙醇
本发明的优点
1.具有耐渗透性、耐乙醇性、耐热性和自絮凝性的经改良的酵母菌株。
2.在高温、高糖浓度和高乙醇浓度下使用经改良的酵母酿酒酵母菌株产生高乙醇产量显着降低了投入成本，改善了下游加工并降低了支流量，从而降低了支流处理的成本。
