综合样本处理系统
技术领域
本发明总体涉及一种用于分离和/或纯化尤其来自难以处理的样本基体和/或难碎裂的有机体的让人感兴趣的分子如核酸和蛋白质的综合样本处理系统，以及利用磁力引发涡旋结合固态整体式过滤件而易于自动化地分离和/或纯化来自样本的核酸的方法。
背景技术
分子试验因其速度、敏感性和特异性而成为对于某些诊断试验的黄金标准。实验室开发试验(LDT)现在是在体外诊断(IVD)市场中最快速增长的环节之一。样本制备对试验可信性至关重要，但通常成为临床分子生物学工作流和诊断试验的瓶颈。虽然有许多分子检测方式，但只有少量的自动样本制备工作流策略。围绕这些样本制备策略和化学构建的现有仪器的花费在$17～$150k范围内，但它们仍无法提供一种用于处理难解样本基体如生痰和/或难碎裂的有机体如革兰氏阳性菌和抗酸杆菌(即分枝杆菌)的综合方法。
包含分枝杆菌菌株的抗酸杆菌通常从感染患者的痰中被分离出。它们被称为“抗酸杆菌”是因为其富脂细胞膜，其相对不可透过各种碱性染料，除非所述染料与苯酚结合。痰是浓稠的且难以处理。大多数分析用痰样含有各种不同量的有机物碎屑和各种脏污的常态或瞬态的菌落。化学去污染/处理一般被用来降低黏度并杀死污染物，同时允许收回分枝杆菌。但是，因为其独特的细胞膜含有分枝菌酸和高含量的脂，故细胞是疏水的且倾向于团聚在一起。这使得它们不可透过常见的着色剂，如革兰氏着色剂。两种抗酸着色剂是常用的，即卡宝品红和荧光色素例如金胺或金胺罗丹明。一旦被着色，这些细胞抗酸化有机溶剂的退色，因此被称为抗酸。但是，它们在依次或同时用酸和酒精处理之后保持品红或金胺着色。
抗酸涂片镜检对分枝杆菌属的敏感性差。显微镜检敏感性受到诸多因素的影响，例如疾病的流行程度和严重性、取样类型、采样质量、取样内存在的分枝杆菌细胞数量、处理方法(直接或浓缩的)、离心分离方法、着色技术和检验质量。有人建议只应在至少100个(在低收入国家)和优选300个(在工业化国家)的显微镜浸没视野(或等同的荧光视野)的检验之后才报告阴性结果。因此，当正确进行显微镜检时，它可能是费时费力的。
分枝杆菌菌株是缓慢生长的杆菌，其常见增代时间为12到18小时。菌群只在1周或8周繁殖时间后才能被看到。含有低浓度分枝杆菌细胞的样本进一步使得几次继代培养变为是必须的。在特定培养基上的分枝杆菌培养可以允许识别出生物学样本所含的特定的分枝杆菌属。但这尤其对于那些只处于感染过程初期的患者而言是费时的。
已经研发出核酸杂交试验来检测生物学样本中的分枝杆菌菌株。最初的试验利用了直接探针杂交。但在采自患者的样本中所含的分枝杆菌细胞的浓度通常太低以致无法产生阳性杂交信号。因此已经研发出利用PCR扩增的试验。例如，被商业化为“AmplifiedTM结核分枝杆菌直接试验”试剂盒或者MTD试验试剂盒的试剂盒(Gen-Probe公司，美国加利福尼亚州92121，圣地亚哥)采用了MtbC专属rRNA扩增(转录介导扩增)，随后是根据Gen-Probe HPA方法(杂交保护测定)的扩增子检测。
鉴于上述限制条件，人们需要一种简单高效的系统，其集成有样本均质化、难碎裂的微生物的裂解和多核苷酸纯化以满足临床实验室和类似用户的需求。
发明内容
在一个方面，本申请提供一种综合样本纯化系统，包括外壳、样本容器架、滤头架和柱形磁体。所述样本容器架和滤头架布置在该外壳中。该样本容器架设计为用于保持一个或多个样本容器，该滤头架设计为用于保持一个或多个滤头。该柱形磁体靠近且外设于样本容器架，并且可被设于外壳内的电动机驱动而绕磁体的中心纵轴线转动。
在一些实施例中，该外壳包括装有一个或多个试剂的一个或多个试剂架。
在一些实施例中，该系统包括多个所述样本容器、多个所述滤头和一个或多个试剂架。
在某些实施例中，该柱形磁体具有围绕磁体纵轴线对称布置的磁极。在其它实施例中，该柱形磁体具有设置在磁体的纵向对置两端上的相对的磁极。在另外一些实施例中，该柱形磁体是电磁体。
在一个实施例中，一个或多个样本容器被密封且被设计成在注入一种或多种试剂溶液之后保持闭合的系统。
在一个实施例中，该系统还包括布置在该外壳内的试剂架，由此该试剂架包括存放在该架内的分隔的密封的孔内的试剂。
在使用中，该样本容器包括磁性搅拌件和多个珠粒，其设计成当该样本容器包含细胞材料且该柱形磁体绕其纵轴线转动时该磁性搅拌件自旋且搅动珠粒以经历细胞材料杂乱混合，使得样本均质化和细胞碎裂。
在一个实施例中，珠粒包括玻璃、塑料、陶瓷材料、矿物、金属或其组合。在特定实施例中，珠粒是二氧化硅珠粒。
在一个实施例中，珠粒所具有的直径在10～1000微米范围内。
在一个实施例中，该磁性搅拌件包含金属或合金。在特定实施例中，该磁性搅拌件包含不锈钢。在另一个实施例中，该磁性搅拌件包含涂有聚合物的合金芯。在特定实施例中，该磁性搅拌件包括涂有聚合物的合金芯，由此该合金芯包括钕铁硼或钐钴和/或该聚合物是PTFE或聚对二甲苯。
另一方面，自动化核酸纯化系统包括上述特征，还包括自动吸移系统和一个或多个机械手，机械手设计为用于按照预定方式自动分配试剂到一个或多个样本容器并处理样本材料和试剂。在使用中，该自动纯化系统包括多个所述样本容器(每个装有搅拌件和珠粒)、多个滤头和一个或多个试剂架。
在另一方面中，一种用于纯化来自样本的靶分子的方法，包括如下步骤：(a)提供根据本文的样本纯化系统；(b)将样本连同磁性搅拌件和多个珠粒放置在样本容器中；(c)将该样本容器安放在样本容器架上；(d)使该柱形磁体绕其纵轴线转动，从而该磁性搅拌件自旋且搅动珠粒至足以均质化样本且破碎样本内细胞而形成细胞裂解物的程度；(e)使至少一部分细胞裂解物流过滤头的第一开口，从而细胞裂解物内的靶分子结合到滤头内的滤芯上；(f)经第一开口将细胞裂解物的未结合部分从滤头排出，其中未结合部分在离开滤头前经过滤芯至少两次；以及(g)通过使洗脱缓冲液流过滤头的第一开口来洗脱结合至滤芯的靶分子并经第一开口将洗脱缓冲液从滤头排出，其中该洗脱缓冲液在离开滤头前经过滤芯至少两次。
在一些实施例中，该靶分子是多核苷酸分子。在一个实施例中，样本包含痰。在特定实施例中，痰样本疑似含有结核分枝杆菌(MTB)，且该方法进一步包括下列步骤：用专用于MTB的引物来扩增洗脱的多核苷酸分子，并确定该多核苷酸分子是否含MTB DNA。
在另一个实施例中，靶分子纯化方法包括使用自动纯化系统，其还包括自动吸移系统和一个或多个机械手，机械手设计成以预定方式自动分配试剂到一个或多个样本容器中并处理样本材料和试剂。在此情况下，每个上述步骤在所述多个样本容器中的每个中被重复，使用同等数量的滤头和一个或多个试剂架。
附图说明
详细说明将参照以下附图，其中：
图1是示出用于裂解细胞并从中纯化核酸的综合方法的一个实施例的流程图。
图2示出根据一个实施例的示例性的单通道核酸纯化系统。
图3示出磁体相对于样本裂解腔的示例性安放位置。
图4示出示例性吸移滤头。
图5A和5B是描绘根据另一实施例的自动的8通道核酸纯化系统的示意图。
图6示出根据另一个实施例的一次性运输装置。
图7示出用于来自痰的核酸的MagVor(Magnetically-induced Vortexing磁致涡旋)/滤头纯化的示例性步骤顺序。
具体实施方式
在描述本发明的优选实施例时，为了清楚起见而采用具体术语。但本发明并不打算局限于所选的具体术语。应该理解，每个具体零部件包括按照相似的方式工作来完成相似目的所有技术等同。
图1是描绘一种用于裂解细胞并纯化让人感兴趣的分子如其中的核酸或蛋白质的综合方法的示例性过程步骤的流程图。方法10包括：将装有液态样本悬浮体、磁性搅拌件和细胞裂解珠粒的样本管安放在靠近磁体的样本架上(步骤11)；通过在磁性搅拌件和细胞裂解珠粒的参与下使磁体以足以裂解样本悬浮体中的细胞的速度转动来均质化该样本悬浮体(步骤13)；使均质化的样本悬浮体流过滤芯基体，此时让人感兴趣的分子结合至滤芯基体(步骤15)；清洗滤芯基体(步骤17)并从滤芯基体中洗脱结合的让人感兴趣的分子(步骤19)。在一些实施例中，该样本管预装有磁性搅拌件和/或细胞裂解珠粒和/或促进细胞裂解的和/或保留靶分子完整性的试剂。
该液态样本悬浮体是悬浮在液态裂解介质中的样本。示例性的样本可以包括生物学样本、环境样本或非自然样本。示例性的生物学样本可以包括组织样本、生物学流体样本、细胞样本、真菌样本、原生动物样本、细菌样本和病毒样本。组织样本包括从任何动物或植物中分离出的组织。生物学样本包括但不限于血、脐带血、血浆、血沉棕黄层、尿、唾液、痰、NALC处理痰、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽抽出液(NPA)、胃液、浓缩咳嗽采集物、脑脊髓液、口腔液、灌洗液(例如支气管的)、胸膜液、粪便和白细胞去除样本。细胞样本还包括培养细胞、来自包括固定的包蜡(FFPE)组织在内的任何细胞源的新鲜或冻结的细胞和组织。细菌样本包括但不限于培养细菌、分离细菌和在任一前述生物学样本中的细菌。病毒样本包括但不限于培养病毒、分离病毒和在任一前述生物学样本中的病毒。环境样本包括但不限于空气样本、水样本、土壤样本、岩石样本和从自然环境中获得的任何其它样本。人工样本包括并不存在于自然环境中的任何样本。“人工样本”的例子包括但不限于纯化的或分离出的材料、培养材料、合成材料和任何其它人造材料。
液态裂解介质可以是等渗的、低渗的或高渗的。在一些实施例中，液态裂解介质是含水的。在某些实施例中，液态裂解介质含有缓冲液和/或至少一种盐或多种盐的组合物。在一些实施例中，液态裂解介质的pH值范围为从约5至约8、从约6至8、或者从约6.5至约8.5。各种pH缓冲液可以被用来获得期望的pH值。合适的缓冲液包括但不限于三羟甲基氨基甲烷(Tris)、MES、双(2-羟基乙胺基)三羟甲基甲烷、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、1,3-二[三羟甲基甲氨基]丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、TEA、HEPPS、N-三羟甲基甲基甘氨酸、Gly-Gly、N-二(羟乙基)甘氨酸和磷酸盐缓冲液(如尤其是磷酸钠或磷酸钠钾)。液态裂解介质可以尤其包含约10毫米至约100毫米的缓冲液、约25毫米至约75毫米缓冲液、或者约40毫米至约60毫米的缓冲液。在液态介质中所用的缓冲液的类型和数量可以根据应用的不同而变。在一些实施例中，液态裂解介质的pH值约为7.4，这可以通过使用约50毫米的三羟甲基氨基甲烷缓冲液来获得。在一些实施例中，液态裂解介质是水。
真核细胞、原核细胞和/或病毒可以以任何合适的浓度悬浮。优选该样本包含以并不干扰磁性搅拌件运动的浓度悬浮在液态介质中的细胞。在一些实施例中，真核细胞和/或原核细胞的悬浮浓度的范围尤其是1～1×1010细胞/毫升、1～1×105细胞/毫升、或者1×103～1×104细胞/毫升。在一些实施例中，病毒粒子的悬浮浓度的范围是1～1×1013粒子/毫升、1～1×1010粒子/毫升、或者1×105～1×107粒子/毫升。
在某些优选实施例中，样本疑似含有MTB。在一个实施例中，样本是鼻咽抽出液。在另一个实施例中，该样本是鼻咽拭子。
本文所用的术语“细胞”是指真核细胞、原核细胞、病毒、内孢子或者其任何组合。于是，细胞可以尤其包含细菌、细菌芽孢、真菌、病毒粒子、单细胞真核有机体(如原生动物、酵母菌等)、来自多细胞有机体的分离细胞或团聚细胞(如原代细胞、培养细胞、组织、整个有机体等)或者其任何组合。
术语“样本”是指含有靶分子或疑似含有靶分子的任何材料。
术语“核酸”是指个别核酸和核酸聚合链，包含DNA和RNA，无论是天然出现的或人工合成的(包含其类似物)或者其改性物，尤其是那些已知出现在自然中的且具有任意长度的改性物。
术语“样本容器”是指长形的大致管状的容器或指管，其用于紧固和/或处理样本以便核酸纯化或容纳与处理后样本结合的试剂。该样本容器不必是柱形的并且可以沿其整个长度或其部分长度略呈锥形。
与细胞相关的术语“裂解”是指至少一小部分细胞的完整性破碎而从碎裂细胞中释放出胞内成分例如核酸和蛋白质。
术语“均质化”是指掺混或涡旋(不同元素如粪便、组织、痰、唾液)成均匀的混合物。
术语“闭合系统”或“闭合容器”是指如下的管或容器，其被密封且以基本闭合(如果不是完全闭合)方式工作以妨碍或防止外源或外界材料在处理过程中进入(或离开)管或容器。闭合系统或容器的组成部件可以在使用前在制造地点被预先消毒、在使用时被消毒和/或在相应的闭合系统在使用前组装好且关闭之后被消毒。
术语“单次使用的一次性”是指所述零部件是不再用的。即，在完成其既定使用即靶样本的处理或制造之后，它被处理掉。
本文所用的术语“整块吸附剂”或“整体吸附性材料”是指多孔的三维吸附性材料，其在单件内具有连续互连的孔结构，其可以包含刚性的、自支撑的基本整块的结构。整块的制备例如通过浇注、烧结或聚合前体成具有期望形状的模子。术语“整块吸附剂”或“整体吸附性材料”是要有别于封装在床结构中或嵌埋入多孔基体中的个别吸附性颗粒的集合体，在此，最终产品包括个别吸附性颗粒。多孔整块聚合物是近十年来研发出的一种新型材料。不同于由很小的珠粒构成的聚合物，整块是单个连续的聚合物件，其制备利用了简单模制工艺。术语“整块吸附剂”或“整体吸附性材料”也是要有别于吸附性纤维或涂有吸附剂的纤维集合体如滤纸或涂有吸附剂的滤纸。
在一个方面，本申请提供一种综合样本纯化系统，包括外壳、样本容器架、滤头架和柱形磁体。所述样本容器架和滤头架设置在外壳中。该样本容器架设计成保持一个或多个样本容器，滤头架设计用于保持一个或多个滤头。该柱形磁体靠近且外设于样本容器架且可被设于外壳内的电动机驱动而绕磁体的中心纵轴线转动。
图2示出了根据一个实施例的示例性单通道样本纯化系统100。图2中的系统100包括外壳104、样本容器架108、滤头致动器/架112和柱形磁体116。样本容器架108和滤头架112布置在外壳104内。样本容器架或样本容器座108保持样本容器120。图2中的滤头致动器/架112设计成保持附接于注射器176的滤头124，注射器如此设计，注射器176中的注射柱塞174上下移动以便经滤头124吸入和分配液体。柱塞174被连接至架112中的控制柱塞运动的致动器。柱形磁体116靠近且设置在样本容器架108之外，且通过设于外壳104内的电动机130绕磁体116的中心纵轴线转动。
每个样本容器120可以包含一个或多个用于裂解样本中的细胞的裂解腔。优选地，样本容器120(和其它系统部件)被密封且设计成在注入样本144和/或一种或多种试剂溶液之前和之后保持闭合的系统。容器120可以用盖、帽或罩来密封。样本容器120能以任何合适的材料、尺寸和形状制造。在某些实施例中，容器120由塑料制造。容器120的内表面优选是化学惰性的。样本容器120例如可以呈采尿杯、微型离心管(如Eppendorf管)、离心管、指管、微孔板等的形状。在一些实施例中，容器120具有单腔/单室用于保持细胞180、珠粒160和搅拌件156，如图3所示。在一些实施例中，某个容器120可以包括多个分立的腔/室(如一排孔)，每一个都能够相互隔离地保持细胞180、珠粒160和磁性搅拌件156的混合物。在一些实施例中，样本容器120被预装有磁性搅拌件和/或细胞裂解珠粒以及促进细胞裂解并保存靶分子生物活性的化学物质和/或酶。
系统100可以包括多个样本容器120、多个滤头124、一个或多个试剂架132或其组合。样本容器架108可以设计成保持多个样本容器120并能安放在外壳104的支撑面上以便同时处理多份样本144。同样，滤头架112可以设计成保持多个滤头124并能安放在外壳104的支撑面上以便同时处理多份样本144。样本容器架108也可以被用作样本144的支架以供存放。例如多个样本容器120可以安放在样本容器架108上且在分析前被存放在冰箱或冷柜中。
现在参见图3，在使用中，样本容器120和柱形磁体116被设计成：当使柱形磁体116绕其纵轴线转动时，样本容器中的磁性搅拌件156自旋且以足以造成细胞180碎裂和均质化的力搅动珠粒160。
柱形磁体116可以具有许多磁体形状或配置形式。在一个实施例中，该磁体具有沿着并围绕磁体纵轴线对称布置的磁极(即北极和南极)。磁体可以具有围绕并沿着纵轴线交替的多个相反磁极，优选是偶数个，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24。在其它实施例中，该柱形磁体具有设置在磁体的纵向对置两端上的相对的磁极。在另外一些实施例中，柱形磁体是电磁体。
可以在样本容器120之上、之下或旁边使磁体116绕穿过磁体116中心的轴线转动。在某些实施例中，样本容器120垂直于样本容器120所放置的表面安放，且使磁体116围绕垂直于样本容器120所放置的表面的轴线转动。在其它实施例中，样本容器120垂直于样本容器120所放置的表面安放，且使磁体116绕平行于样本容器120所放置的表面的轴线转动。在另外一些实施例中，样本容器120垂直于样本容器120所放置的表面安放，且使磁体116绕与样本容器120所放置的表面成一定角度的轴线转动。该角度大于0度但小于180度。
图3示出磁体116相对于样本容器120的相对位置。磁体116绕轴线A转动且造成样本容器120内的磁性搅拌件156在相同方向上沿平行于轴线A的轴线B转动。虽然图3只示出了一个轴线B，但本领域技术人员将会理解，磁性搅拌件156可以绕平行于如图所示的其它A轴线的其它B轴线转动。转动的磁性搅拌件156碰撞珠粒160且在此过程中裂解细胞180。磁体116可以与样本容器120并排地或在其之上、之下或对角线方向上安置，样本容器垂直于样本容器120的腔或支架所处的表面190安放。
样本容器120且尤其是样本144、珠粒160和磁性搅拌件156位于变化磁场的作用范围内。例如样本容器120可以位于转动磁场的作用范围内，例如通过在邻近或靠近柱形磁体116处安放容器120。变化的磁场尤其迫使磁性搅拌件156运动如转动、往复运动或其组合，其又迫使珠粒160、细胞和液态介质运动。在一些实施例中，样本悬浮体144用磁性搅拌件156以足以裂解容器120内的细胞的转速和持续时间被搅动。合适的转速和持续时间视应用而定且可以根据经验由本领域普通技术人员来确定。一般而言，足以裂解细胞的转速由如下因素来定，例如细胞类型、样本悬浮体144的浓度、样本悬浮体的量、磁性搅拌件156的尺寸和形状、细胞裂解珠粒160的量/数目、尺寸、形状和硬度以及样本容器120的尺寸和形状。
在某些实施例中，磁性搅拌件156以在1000～6000rpm之间的、优选约为5000rpm的速度转动1～600秒、优选约90～120秒的时间。在某些实施例中，样本容器120(例如呈尿液分析杯或管的形状)被安放在架内的磁性搅拌件上，且以最高设定速度(>1000rpm)被搅拌。在其它实施例中，样本容器120是在微型板如ELISA板中的孔。在其它实施例中，样本容器120是具有样本进口和样本出口的柱形容器。
在某些实施例中，磁性搅拌件156的转速被提高以提高裂解效率并缩短实现裂解所需的时间。在某些其它实施例中，转速被调整，从而只有某些类型的细胞被裂解。例如在包含多种细胞180类型的样本悬浮体144中，搅拌件156可以以第一速度转动以裂解第一组细胞，接着以第二速度转动以裂解第二组细胞。在其它实施例中，容器120被耦接至温度控制模块，其控制在裂解过程之前、之中和/或之后的样本悬浮体144的温度。在某些实施例中，样本悬浮体144的温度被保持在2～8℃。在一些实施例中，样本悬浮体144在裂解过程之前、之中和/或之后(例如在磁性搅拌件转动期间)被加热到40～80℃、50～70℃或者约60℃。
磁性搅拌件156可以由金属或金属合金制造。在一个实施例中，磁性搅拌件156由不锈钢制造。在其它实施例中，磁性搅拌件156由涂覆有化学惰性材料如聚合物、玻璃或陶瓷材料(例如瓷)的合金芯制造。示例性合金芯材料包括钕铁硼钐钴。示例性涂覆聚合物包括生物相容性聚合物如PTFE和聚对二甲苯。
磁性搅拌件156可以是任何形状的且应该小到足以被安放到样本容器120中且在容器120内运动或自旋或搅动。磁性搅拌件156尤其可以是杆状的、柱状的、十字形的、V形的、三角形的、矩形的、棒状或盘状的搅拌件。在一些实施例中，磁性搅拌件156具有矩形形状。在一些实施例中，磁性搅拌件156具有双分叉的音叉形状。在一些实施例中，磁性搅拌件156具有V形形状。在一些实施例中，磁性搅拌件156具有梯形形状。在某些实施例中，搅拌件156的最长尺寸略微小于容器直径(例如容器直径的约75～95％)。
细胞裂解珠粒160可以是任何颗粒状的和/或珠状的结构，其硬度大于细胞硬度。珠粒160可以由塑料、玻璃、陶瓷、矿物、金属和/或任何其它合适的材料制造。在某些实施例中，珠粒160可以由非磁性材料制造。珠粒160可以关于至少一个轴线是旋转对称的(如球形、圆形、卵形、椭圆形、蛋状和水滴状颗粒)。在某些实施例中，珠粒160具有多面体形状。在其它实施例中，珠粒160是无规则形状颗粒。在一些实施例中，珠粒160是带有凸起的颗粒。珠粒160所具有的直径尤其可以在10～1000微米、20～400微米或者50～200微米的范围内。添加至每个裂解容器的珠粒160数量尤其可以在约1～10000毫克、1～1000毫克、1～100毫克、1～10毫克范围内。
在细胞已裂解后，细胞裂解物被吸入合适滤头124中以容许核酸结合到其中的滤芯基体126(见图4)。一般，裂解物在未结合部分被排出滤头124同一端之前经过滤芯基体126至少两次。此刻，滤头124内的结合核酸能被存放在密封容器中以供在其它时候进一步分析。或者，结合核酸可以从滤头中利用合适的如以下还要描述的洗脱缓冲液被洗脱。
图4示出了示例性滤头。滤头124包括嵌入移液头127中的多孔整块结合滤芯基体126。整块结合滤芯基体126包括整块吸附剂或整体吸附性材料。多孔整块材料与核酸特异性结合且由刚性的自支撑的基本呈整体的结构构成。在一些实施例中，多孔整块材料不包含产生核酸亲和性的附加材料。在一些优选实施例中，多孔整块材料是玻璃基的整体材料如玻璃熔块。在某些实施例中，玻璃熔块是烧结玻璃熔块。多孔整块材料如玻璃熔块或烧结玻璃熔块的孔隙度可以根据应用而不同。总体而言，多孔整块材料应该具有的孔隙度允许针对特定应用有期望的样本流速且能够保持在期望尺寸范围内的核酸。在一些实施例中，整块结合滤芯基体126是玻璃熔块，其由具有不同孔隙度的两段(126a和126b)构成。
在一些实施例中，多孔整块材料是玻璃熔块或烧结玻璃熔块，其孔隙度(即平均孔尺寸)在2～～400微米、2～300微米、2～220微米、2～200微米、2～180微米、2～160微米、2～140微米、2～120微米、2～100微米、2～80微米、2～60微米、2～40微米、2～20微米、2～16微米、2～10微米、2～5.5微米、4～400微米、4～300微米、4～220微米、4～200微米、4～180微米、4～160微米、4～140微米、4～120微米、4～100微米、4～80微米、4～60微米、4～40微米、4～20微米、4～16微米、4～10微米、4～5.5微米、10～400微米、10～300微米、10～220微米、10～200微米、10～180微米、10～160微米、10～140微米、10～120微米、10～100微米、10～80微米、10～60微米、10～40微米、10～20微米、10～16微米、16～400微米、16～300微米、16～220微米、16～200微米、16～180微米、16～160微米、16～140微米、16～120微米、16～100微米、16～80微米、16～60微米、16～40微米、40～400微米、40～300微米、40～220微米、40～200微米、40～180微米、40～160微米、40～140微米、40～120微米、40～100微米、40～80微米、40～60微米、100～400微米、100～300微米、100～220微米、100～200微米、100～180微米、100～160微米、100～140微米、100～120微米、160～400微米、160～300微米、160～220微米、160～200微米、160～180微米、200～400微米、200～300微米或者200～220微米的范围内。在其它实施例中，多孔整块材料是玻璃熔块或烧结玻璃熔块，其具有孔隙度不同的两段(126a和126b)。每一段所具有的孔隙度可以在上述范围内(例如4～10微米区段和16～40微米区段，或者16～40微米区段和100～160微米区段)。
在一些实施例中，滤芯的厚度在1～30毫米、1～25毫米、1～20毫米、1～15毫米、1～10毫米、1～8毫米、1～6毫米、1～4毫米、2～30毫米、2～25毫米、2～20毫米、2～15毫米、2～10毫米、2～8毫米、2～6毫米、2～4毫米、4～30毫米、4～25毫米、4～20毫米、4～15毫米、4～10毫米、4～8毫米、4～6毫米、6～30毫米、6～25毫米、6～20毫米、6～15毫米、6～10毫米、6～8毫米、8～30毫米、8～25毫米、8～20毫米、8～15毫米、8～10毫米、10～30毫米、10～25毫米、10～20毫米、10～15毫米、15～30毫米、15～25毫米、15～20毫米、20～30毫米、20～25毫米或者25～30毫米的范围内。
在一些实施例中，多孔整块材料可以用一种或多种具有对让人感兴趣的分子的亲和性的材料例如多核苷酸、蛋白质、脂质或多糖来改性。在一些实施例中，该多孔整块材料可以用具有核酸亲和性的一种或多种材料被改性。
在一些实施例中，滤芯由多孔玻璃整块、多孔玻璃陶瓷或者多孔整块聚合物制造。在一些实施例中，多孔玻璃整块的制造利用了如美国专利US4,810,674和US4,765,818所述的溶胶-凝胶法，所述文献兹被援引纳入。多孔玻璃陶瓷的制造可以借助多孔玻璃整块的可控结晶。在优选实施例中，多孔玻璃整块、多孔玻璃陶瓷或者多孔整块聚合物未被涂覆或嵌埋任何附加材料如多核苷酸或抗体来改善其与核酸的结合亲和性。
在一些优选实施例中，该滤芯由可让液态样本穿过的细微多孔玻璃熔块制造。多孔玻璃熔块未涂覆或未嵌埋有任何附加材料如多核苷酸或抗体以改善其对核酸或让人感兴趣的其它分子的亲和性。适用于纯化核酸的基材包括由烧结玻璃制造的多孔玻璃熔块，其通过在热压机中压碎珠粒以形成单个整体结构来形成。熔块的均匀结构提供了在熔块内的可预测的液体流动并容许洗脱液具有与样本流相似的流体动力学。可预测的液体流动容许在洗脱过程中的高回收率。
虽然滤芯基体126一般安放在移液头127中，但它也可以被装入具有不同体积和形状的柱、注射器或其它外壳里。可以利用各种器械使溶液经过滤芯基体126，包括人工或自动的移液器、注射器、注射泵、手持式注射器或用于使液体运动经过滤芯基体126的其它类型的自动方法或人工方法。
如图5A和5B所示，该系统可以还包括一个或多个布置在外壳中的试剂架132。试剂架132被设计成保持一个或多个试剂。试剂架132可以呈托盘状，试剂可以在准备好使用时被倒入其中。在此情况下，该试剂可以被倒入托盘中以促进试剂被吸入多个移液头以便在样本144处理过程中送至多个样本孔。或者，试剂架132可以呈块或包括多个孔152的多孔板(如24孔、96孔等)形式，由此这些孔中的每一个设计成保持任何试剂以便处理一份单独的样本144。在某些实施例中，孔152可以预填充有试剂并在架132内被密封。在一些实施例中，架132位于样本容器架108和/或滤头架112的附近(图5B)。
样本纯化系统100可以人工操作，或者它可以设计成通过可编程逻辑半自动或全自动地运行。在某些实施例中，该系统可以进一步包括自动吸移系统136(图5A)和一个或多个机械手(未示出)，机械手设计成以预定的计算机控制方式自动将试剂从一个或多个试剂架132分配到多个样本容器120中并处理样本材料和所用试剂到合适的废物容器172中(图5B)。
在一个操作模式中，试剂架132呈多孔板形式(如24孔、96孔等)。优选地，混合物通过使用自动液体移运处置来混合，因为这将减少为了制备待调查的混合物所需要完成的工作量。机器人也可以利用本领域已知的设备和方法来执行自动抽样实验操作流程。
任何合适的机器或设备可以被用来使样本144穿行经过自动纯化系统100及其各不同的处理步骤。例如本文所用的系统100可以利用本领域已知的各种各样的机器人来自动化样本144、试剂和其它系统部件的运动。示例性的机器人系统能够使样本在一个轴、两个轴或三个轴上运动和/或使样本绕一个轴、两个轴或三个轴转动。示例性的机器人在轨道上运动，轨道可以位于工件之上、之下或旁边。一般，机器人部件包括功能部件例如机械手，其能够抓取和/或移动工件、插入移液管、分配试剂、吸出等。本文所用的“机械手”是指这样的装置，其优选由微处理器控制且物理传送样本144、容器120、滤头124、样本容器架108、滤头架112和试剂架132从一个地点到另一个地点。每个地点可以是自动纯化系统100中的一个单元。用于机械手控制的软件通常可以从机械手制造商处获得。
可以使机器人在轨道上平移，例如在工作区上方、下方或侧旁，和/或可以包括铰接部段，其允许机械手到达工作区的不同地点。机器人可以被本领域已知的马达驱动，马达可以例如是电动的、气动的或液压驱动的。任何合适的驱动控制系统可以被用来控制机器人，例如标准PLC编程或本领域已知的其它方法。可选地，机器人包括位置反馈系统，其以光学或机械方式测量位置和/或力并容许机器人被引导至期望地点。可选地，机器人也包括位置确保机构例如机械止挡、光标或激光导向器，其允许反复到达特定位置。
示例性的自动化抽样实验操作流程可以例如利用Eppendorf epMotion5070、epMotion5075、Hamilton STARlet、STAR和STAR+液体移运机器人。这样的实验操作流程可以被调整以用于从整个血液、组织、唾液、拭子中分离RNA、分离基因组DNA以及循环游离DNA例如循环肿瘤DNA和来自母体血浆的循环胎儿DNA提取物和富集物。
核酸纯化方法
另一方面，一种用于纯化来自样本的核酸的方法，包括如下步骤：(a)提供根据本文的核酸纯化系统；(b)将样本、磁性搅拌件和多个珠粒注入样本容器；(c)使柱形磁体绕其纵轴线转动，从而磁性搅拌件自旋且搅动珠粒以经历细胞内容物的杂乱混合至足以均质化该样本且破碎样本中的细胞而形成细胞裂解物的程度；(d)使至少一部分的细胞裂解物流过滤头的第一开口，从而细胞裂解物中的核酸结合至滤头中的滤芯；(e)经第一开口将细胞裂解物的未结合部分排出该滤头，其中该未结合部分在离开滤头之前经过滤芯至少两次；(f)通过使洗脱缓冲液流过滤头的第一开口并经第一开口将洗脱缓冲液从滤头排出来洗脱结合至滤芯的核酸，其中该洗脱缓冲液在离开滤头之前经过滤芯至少两次。
可以采用用于执行本申请的方法的任何方式，包括全手动、半自动或全自动的实验操作流程。但是，滤头的特征、适应性、简单性和工作流容许其易于调整、自动化且有效用于多个临床样本基体、输入样本量和液体移运系统。于是，在一个优选实施例中，该操作方式包括某种自动化。在一个实施例中，该核酸纯化方法包括自动吸移系统和一个或多个机械手，该机械手设计用于自动分配试剂到一个或多个样本容器中并按照预定方式将样本材料和试剂处理掉至合适的一次性容器。在此情况下，每个上述步骤在所述多个样本容器的每一个中利用同等数量的滤头以及一个或多个试剂架而被重复。
疑似含有MTB的样本对使用者是潜在危险。因此，样本可以通过加热和/或加入试剂被预处理，该试剂适用于灭活存在于样本中的微生物以缓解该危险。微生物例如MTB的灭活可以通过加热来执行(例如90℃，5分钟)以便活性蛋白质变性、细胞壁结构的酶消化、机械破碎以便物理破碎或灭活细胞、化学处理或者其组合。
化学灭活带来了减少或消除对热的需求的潜在可能。当处理样本以便培养时，简单的试剂被用来消化该痰和消毒该样本。为了培养，将存在于痰样本中的其它群落灭活是重要的，从而MTB可以生长而没有被其它更快速生长的细菌压倒。最好选择可以采用试剂例如氢氧化钠(例如3～5％)或氯化十六烷基吡啶的去污或灭活步骤来灭活所有其它细菌，但保持具有更厚更坚固的细胞壁的MTB细胞完整无损和活着。但是，根据所用的方法，20～90％的MTB细胞可以在此过程中被杀死。但关于核酸纯化，MTB细胞无需是活的或完好无损，只要细菌基因组DNA仍能被扩增。
灭活试剂优选允许样本的有限稀释和/或低pH值以获得与二氧化硅结合的相容性。这些试剂可以在采集时被添加至样本。在一些实施例中，过氧化氢、酒精例如乙醇和邻苯基苯酚(如0.2～0.5％)可以被用作主要活性成分。过氧化氢(H2O2)可以按照6～25％浓度被用作化学消毒剂并且在溶液中非常稳定。在与0.85％磷酸混合时，H2O2在低pH值下是活性的。仅乙醇(例如95％)就能在15秒中灭活痰或水中的MTB。作为农业杀真菌剂的邻苯基苯酚按照0.1～0.41％与乙醇或异丙醇一起在PHENO-CEN、SRAYPAK和CLIPPERCIDE喷洒杀菌剂中来使用。此外，邻苯基苯酚可以按照低的试剂与样本之比在室温在15分钟内来使用并且它可以被用在乙醇或异丙醇中或与6.65％的2-苄基-4-氯苯酚在低pH值Phenolic 256中组合使用(50％～100％)。
灭活试剂与样本体积的体积比一般将在约0.1:1至3:1的范围内。
在原代样本容器内的微生物灭活对于提供BSL-1相容性工作流是重要的(即工作流不需要生物安全柜)。许多实验操作流程牵涉到在消毒之前的样本移送，这样的操作可能产生气溶胶且感染使用者。因此，BSL-1相容性需要极其小心在消毒之前的样本移送，尤其是那些会产生气溶胶且感染使用者的样本移送。
依据样本性质，样本可以一开始被液化以减小其黏度和异质性以便一致的样本处理。痰样是一项特殊挑战。痰中的MTB是最具处理挑战性的细胞和样本类型之一，因为抗酸杆菌具有富脂疏水细胞壁以及痰的黏稠异质性。用于痰的标准提取方法一般以沉降过程开始，它通常牵涉到用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)和氢氧化钠(NaOH)来处理，随后是离心分离、澄清和再悬浮。因此，在处理高度黏稠样本如痰时，样本可以接受化学处理以减小黏度，使得随后处理步骤(例如MagVor)不受影响。用于添加至样本的示例性粘液溶解试剂包括但不限于NALC、苄基二甲基烷基胺-磷酸三钠(Z-TSP)、苯甲烃铵和Primestore(Longhorn Vaccines&Diagnostics，圣安东尼奥特克斯)，其含有用于细菌裂解和RNA和DNA稳定的具体配方。在一个实施例中，通过借助粘液溶解试剂的化学处理的样本液化在60℃进行20分钟。患者痰样一般可以按照在1～10毫升范围、5～10毫升范围或更大的体积来采集。
在90s-1剪切速率下，痰的黏度范围为约100～6000cP(mPa.s)。以mPa·s测量的黏度通过抗剪强度除以剪切速率来确定。该样本优选被液化以便将痰黏度减小至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
当处理样本时，至少一个磁性搅拌件和多个细胞裂解珠粒存在于样本容器中。使用者可简单地将样本悬浮体加入样本容器，将样本容器靠近柱形磁体放置，并通过使该磁体以足以让转动磁场造成磁性搅拌件转动和足以均质化并裂解细胞地在样本容器内搅动细胞裂解珠粒的速度搅动样本悬浮体。
样本悬浮体、细胞裂解珠粒和磁性搅拌件可以按照任何顺序被放入样本容器中。在一些实施例中，样本悬浮体在细胞裂解珠粒和磁性搅拌件之前被加入样本容器中。在其它实施例中，细胞裂解珠粒和/或磁性搅拌件在样本采集之前被放入样本容器。
在某些实施例中，特定类型细胞的裂解可以通过在搅拌步骤之前和/或之中将添加剂加入样本悬浮体来促成。添加剂的例子包括酶、去污剂、表面活性剂和其它化学物质如碱和酸。已经发现碱性条件(如10mMNaOH)可以在搅拌过程中针对某些类型的细胞提高裂解效率。样本悬浮体可以在搅拌过程中也或替代地被加热以提高裂解效率。但是，添加剂可能对包含核酸扩增和检测的下游处理步骤是有害的且应该在可能时被消除以简化此过程。
搅拌件/珠粒组合相对于传统的裂解方法带来许多优点。搅拌件/珠粒比化学和酶促方式快速许多，并且相对于许多其它类型的物理裂解方法提供改善的细胞或病毒裂解。搅拌件/珠粒方法也易于利用机器人和/或微流控技术来自动化。柱形磁体可再用，不需要精确对准容器并且能驱动多个腔室。磁性搅拌件的成本低廉，容许其单次一次性使用。
在MagVor步骤之后，含一种或多种促溶剂的合适的结合缓冲液被添加至样本容器以促进核酸结合至滤芯基体126。当溶液pH值小于7时，核酸对二氧化硅的BOOM化学或者促溶结合是最高效的。在此情况下，含氯化锂或氯化钠或胍基离子的高离子强度溶液一般与脂肪醇例如乙醇或异丙醇组合以分别盐析出DNA并促进核酸结合。合适的结合缓冲液以一定浓度被采用，从而当它被添加至处理后样本时，所造成的体积在滤头容量范围内。这减少了吸放周期数目和进而缩短了总处理时间。
在某些实施例中，结合缓冲液被添加至样本且在MagVor之后在60℃被培养10分钟。在其它实施例中，在MagVor步骤在之前，促溶剂和脂肪醇在液化步骤被加入。在其它实施例中，所述灭活、均质化和裂解的步骤以单个步骤形式在短到15分钟时间里完成。
示例性的促溶剂包括但不限于促溶盐如硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍脲、硫脲、十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十六烷吡啶、氯化钠、氯化锂、氯化钾、高氯酸钠、高氯酸锂、碘化钠和碘化钾；脂肪醇如丁醇、乙醇、丙醇和异丙醇；苯酚和其它苯酚化合物。
在一些实施例中，为了促进高分子量(HMW)核酸选择性结合至滤芯基体，以0％至约10％、优选在约4％至约6％(最佳＝4.7％)范围提供脂肪醇如异丙醇，并且以1.0M至4.0M、优选在约3.0M至约4.0M范围提供促溶盐如异硫氰酸胍和/或盐酸胍。
在一些实施例中，为了促进低分子量(LMW)核酸至滤芯基体的结合(浓缩)、以约10％至约25％、优选约15％至约20％(最佳＝17.7％)范围提供脂肪醇如异丙醇。
在其它实施例中，为了促进从痰中分离出MTB DNA，可以约20％至约60％、优选约30％至约50％(最佳＝44％)范围提供脂肪醇如乙醇。
在上述灭活和均质化步骤之后，溶液的pH值应该根据需要被调节以获得低于7的pH值。在pH值高于7的情况下，溶液可以用弱酸如醋酸钾或磷酸钠被中性化。这在采用pH≥11的NaOH或者邻苯基苯酚时将是必需的。低pH值酚试剂和过氧化氢试剂是固有酸性的且将最不可能需要附加缓冲液。
在一个实施例中，核酸结合至滤芯基体可以通过借助在两者之间的鲁尔锁定连接将滤头124附接至注射器176来实现。在另一个实施例中，滤芯基体在注射器176中。图4示出了示例性的滤头124。滤头124包括嵌入在滤头体127内的多孔二氧化硅基体126、用于防止污染使用者和暴露于使用者面前的气溶胶过滤件128和帮助保持闭合系统的滤头帽129。在一个实施例中，帽129被连接至带有芯件的滤头124。在一些实施例中，帽是普通的Falcon管帽208。滤头124被设计成允许液样随着滤头124的每次吸入和分配流过基体。利用注射器176或其它合适的器械，容器120内的细胞裂解物向上经过滤头124的远端，使得细胞裂解物中的核酸结合至移液头127中的滤芯基体126。一般，细胞裂解物被上下拉动经过滤芯基体126，使得裂解物和未结合部分在未结合裂解物部分经移液头127远端被排出到合适的一次性容器172之前经过滤芯基体126至少两次。
样本与促溶试剂的组合使DNA和二氧化硅脱水以促进吸附到多孔二氧化硅基体126上。随后的清洗缓冲液的吸放周期(2～3次)从基体126除去杂质。此刻，含有结合至滤芯基体126的核酸的滤头124可以被存放在密封的容器120里以供在其它时候进一步分析。或者，结合核酸可以利用进一步如下所述的合适的洗脱缓冲液从滤头中被洗脱。
核酸已经被表明在包括二氧化硅在内的固态支承物上是极其稳定的，尤其当无需附加稳定剂地在脱水状态下存放时。因此，另一方面，本申请提供一种稳定纯化核酸以便运输的方法，该方法的形式为单次使用的一次性运输装置200，该运输装置包括附接至合适的保持管212的(例如50毫升锥形管)的帽208的顶侧的鲁尔锁合接头204，使得滤头124附接至管帽208的底侧(图6)。
在使用(即核酸洗脱以供分析)之前，附接至帽208的滤头124从保持管212上被取下且如图2所示被附接至注射器176。在此情况下，使用者能通过鲁尔锁合接头204容易插入和移除滤头124，同时紧抓住管帽208，使得保持管212保护使用者和滤头124以免污染。当此操作顺序结束时，带有结合核酸的多孔二氧化硅滤芯基体126可以被干燥，带帽的滤头124被旋拧到空的保持管212上以便运输。在运输期间，保持管212保护滤头124免于污染。稳定化的核酸可以随后用洗脱缓冲液被再水合且洗脱至存放管中以便长期冻结存放，或利用与诊所所用的相似的自动化系统或简单使用一次性注射器176直接被洗脱到检测分析装置或者样本管中。在后者情况下，注射器176可以用作用于洗脱缓冲液穿过二氧化硅基体126的吸放周期的机构。
在准备分子分析时，洗脱缓冲液的吸放周期(2～3次)从基体126中除去结合核酸。该过程的完结导致了在PCR相容性缓冲液中的核酸纯化。此做法容许就规格而言的灵活性，从而它可以与液体移运系统连用以用于高流率应用或者与简单的移液头连用以用于低流率应用。
图7示出用于对来自痰的核酸进行MagVor/滤头纯化的示例性步骤顺序。疑似含有MTB的痰样用样本容器来收集。含有灭活试剂和粘液溶解试剂的化学试剂混合物被添加(步骤1)。样本容器随后被安放在提取座(或架)上且样本内容物经受磁致涡旋(MagVor)达2～15分钟、优选约10分钟(步骤2)。在细胞裂解之后，容许珠粒沉淀1～2分钟且结合缓冲液被加入容器(步骤3)。使用者将滤头附接至图6中的管帽/鲁尔锁合接头的底侧且利用鲁尔锁定连接将注射器连接至管帽/鲁尔锁合接头的顶侧(步骤4)。使用者将滤头从上方穿透过帽并刺入容器，并将细胞裂解物吸入滤头并使注射器杆上下移动进过滤芯基体2～3次以促进结合至滤芯基体，由此使未结合部分回到管中(步骤4)。在此结合步骤后，样本容器用装有清洗试剂的新管被更换，且滤芯基体用收集在管内的清洗缓冲液被清洗(步骤5)。在清洗步骤之后，管被提离出液体。在一些实施例中，滤头通过使空气经过滤芯基体被进一步干燥(步骤6)。在一些实施例中，进行几个回合的空气干燥以减少残余清洗试剂。接着，使用者使滤头/帽适配接头脱离注射器，将滤头放回到装有干燥剂的新保持管中，并将滤头/帽适配接头联接至保持管以便存放(步骤7)。滤头中的核酸对于运输是稳定的或者可以从滤头中洗脱纯化核酸以供PCR分析等。核酸的洗脱可以通过在收集前使洗脱缓冲液经过滤芯基体2到3次来完成。
添加剂如海藻糖、0.1％Triton-X-100或Plus试剂(Biomatrica)可以被加入洗脱缓冲液中或被添加至洗脱核酸中以增强其稳定性。
在某些实施例中，该方法进一步包括如下步骤：洗脱核酸，用专用于预定靶的引物扩增洗脱核酸，确定样本是否含有对应于靶的核酸。优选用于检测的靶包括在痰中找到的细菌和病毒病原体，包括但不限于MTB、金黄色酿脓葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、粘膜炎莫拉菌、克雷白氏杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、百日咳博德特氏菌、脑膜炎奈瑟菌、炭疽杆菌、诺卡氏菌、放线菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌属、耶氏肺孢子菌、甲型流感病毒、巨细胞病毒和鼻病毒。
本文所述的系统100可以检测到低于1000细胞/毫升、优选低于100细胞/毫升、更优选低于50细胞/毫升、最优选低于10细胞/毫升水平的MTB。假定1群落形成单位(cfu)大致等于10个细胞，上述系统可以被用来提供至少100cfu/毫升、10cfu/毫升、5cfu/毫升或甚至1cfu/毫升的检测。
但应该认识到，每个临床样本是独一无二的并且将在黏度、粒子、黏液、表面污染物、微生物和/或人类基因背景方面彼此不同。假定有临床样本成分和自动滤头样本制备实验操作流程的既定使用的预期变化，因此可能需要改动滤头程序中的某些步骤以获得期望结果。
例如，虽然本文所述的滤头具有较大的孔尺寸，但样本均质化和液化对于高效细胞裂解和随后与滤芯基体结合的步骤极其重要。伴随均质且良好液化的裂解物，样本也能以更高流速经过滤头，这缩短了总样本处理时间。如以下用大量血浆试验操作流程所显示，大的输入样本量可以用如下滤头来有效处理，该滤头给使用者提供彻底均质化并液化难以处理的样本(在线或离线)的机会，只需最小程度的关注输入样本量。
此外应该认识到，在核酸结合或洗脱期间的较慢流速一般导致较高的核酸产量，尽管付出了总处理时间的代价。较慢流速也将DNA剪切程度减至最低程度。
建议滤芯基体的完全干燥以防止残余溶剂随纯化核酸样本共同洗脱并抑制下游处理或试验。因为滤头未通过离心分离或真空过滤被干燥，故在干燥步骤中将流速和周期数两者提高到最大程度是重要的。
因为形状、滤头材料和至机械通道手的附接方法对于每位仪器制造商来说都是独特的，故每个液体移运系统需要不同的滤头构造。滤芯基体尺寸(直径、厚度和孔尺寸)与核酸结合能力(和洗脱效率)相关，就像对任何固相提取技术所预期的那样。虽然厚(>4毫米)的基体可以被嵌入1毫升滤头中以增强针对大量样本的核酸结合能力和/或平衡在具体滤头规格间的基体结合能力，在滤头厚度和初始结合步骤(在原裂解物存在情况下)中的流速之间仍有权衡。因此，有时有利的是将大直径基体嵌入大通量滤头中以用于自动实验操作流程的初始步骤(例如用于大量提取的5毫升Hamilton/Akonni )。假定有由液体移运机器人制造商指定的具体滤头配置，但期望滤头核酸产量在来自不同的制造商的液体移运平台间或者在不同滤头尺寸间都是相同的并不合理。自动滤头实验操作流程的临床评估和与可商业获得的自动系统的直接比较将在别处详细报告。
MagVor/滤头过程相比于传统方法有许多优点。首先，此过程与自动化兼容。其次，将滤芯基体约束在移液头内降低了其易交叉污染性。另一方面，在自旋盘上的纤维状二氧化硅基体可以很容易地破碎和释放出可能是污染源的细微粒子。相似地，依赖磁珠粒活动性以便纯化的技术带来了相似危险。滤芯基体的相对大的孔隙度容许高黏度的样本流过基体而不堵塞。多个吸入和分配周期容许相比于采用样本单次经过基体的离心分离法的增强的靶核酸结合。此外，促溶化学提供了用于去除抑制剂和核酸酶的健全方法，且使其具有长期稳定性。
将进一步通过以下的不应被解读为限制性的例子来说明本发明。本申请全文所引用的所有参考文献、专利和公开专利申请以及附图和表的内容被援引纳入本文。
例子
例1：MagVor均质化和裂解
相对于苏云金杆菌孢子、酿脓链球菌和痰中的MTB来测试MagVor系统的效力，为此利用体积之比v:v为1:1的玻璃珠粒与样本、1毫升总样本体积和30～120秒的MagVor裂解。从生痰中提取MTB DNA就其分枝杆菌细胞壁和低(10个杆菌)感染剂量而言是极具挑战性的。裂解效力通过在MagVor处理之前和之后的等量生痰样本的定量实时PCR来估算。MagVor处理被发现相对于未处理的样本(即相同的痰样本的等分试样但未被MagVor系统处理)以通过平均2.5个周期(近似1log)改善了核酸检测。
为了调查物理裂解试剂盒组成(粒子、搅拌盘、涂层)可能干扰核酸提取和纯化的程度，进行对四种珠粒和三种磁性盘的分析以识别出没有在MagVor裂解后在溶液中产生超细颗粒的裂解珠粒和磁性盘。NPA样本被聚集，通过实时PCR被确认对让人感兴趣的靶DNA的阴性，接着用完好无损的甲氧西林MRSA或MTB靶细胞示踪。样本(0.5毫升)被一式两份处理且通过5000rpm的10分钟MagVor处理被裂解。核酸用采用胍基结合缓冲液的人工MagVor/滤头程序被纯化，随后通过定量实时PCR(或RT-PCR)被分析。玻璃珠粒易沉淀至裂解管底部且在这些实验中未表现出对DNA或RNA的明显抑制或降解。
如表1所示，相比于未处理，尤其在高滴度下利用MagVor处理获得DNA回收率的一致改善。
表1.MagVor/滤头自示踪NPA对MRSA和MTB DNA的综合回收：
例3：综合型MagVor/滤头原型与Qiagen核酸纯化试剂盒的对比
综合系统的核酸裂解和纯化效力相比于相似的Qiagen核酸纯化试剂盒被评估。模型样本类型包含NPA中的MRSA、NPS中的甲型流感、来自全血的人类基因DNA和NPA中的MTB。Qiagen试剂盒包括DNA迷你试剂盒(无机械裂解，但有10分钟蛋白酶K处理)、Viral RNA迷你试剂盒(无机械裂解，但采用RNA载体)和Mini Blood试剂盒(10分钟蛋白酶K培养)。因为Qiagen不具有专用于MTB提取的试剂盒，故将BD GeneOhm裂解试剂盒与Qiagen迷你DNA提取试剂盒组合使用。BD裂解和Qiagen试剂盒也具有有限的输入样本量，因此，NPA和NPS样本以200微升体积被处理，全血以100微升、10微升和1微升体积被处理。针对每个样本类型和滴度(每份样本n＝24提取)准备、密封和处理复制试剂板，通过定量实时PCR分析纯化核酸，对比其平均周期阈值(Ct)和从相似的Qiagen提取(每份样本n＝8提取)中获得的平均周期阈值。用每个板进行阳性和阴性对照以检测潜在交叉污染。
该分析的结果被汇总在表2中且展示出相对于Qiagen试剂盒的相似的性能和效力。对于这两种系统，NPA中的MRSA和NPS中的甲型流感的检测限制条件都约为103细胞或病毒/毫升。人类DNA易于从1微升全血中获得，且模板对照表明无核酸交叉污染证据。这些数据表明综合样本制备原型相对于可商业获得的高品质样本制备试剂盒的扩展性和效力。
表2.相对于其它DNA提取试剂盒的自MagVor-滤头系统(n＝24)的核酸回收
例4：痰液化
因为大多数提交用于分枝杆菌培养的样本在分析之前被能快速增生分枝杆菌的各种有机物污染，故呼吸样本一般被提交给消化-去污预处理。于是，通过使用在减少或消除污染细菌的同时释放出陷留在黏液素和细胞中的分枝杆菌的操作程序来从临床样本中最佳地收回分枝杆菌。
NALC-NaOH沉降已经成为用于去污并消化非结核性分枝杆菌(NTM)的痰液样本的标准。但是，自生痰中提取MTB DNA是极富挑战性的，因为一方面是痰的高黏度和异质性且另一方面是难破裂的MTB细胞壁。DNA提取物的运输相比于生痰减轻了后勤复杂程度(就冷运输而言)。虽然NALC-NaOH确实是一个消化过程，但NALC快速丧失其活性，要求每天复原新鲜试剂。此外，此程序需要离心分离，其额外增加了复杂性和装备。另外，NaOH暴露造成MTB细胞死亡并降解DNA。
因此，研发出如下的液化方法是让人感兴趣的，其能作为用于对处理生痰有兴趣的使用者的替代可选手段。因为生痰是难于送至样本容器的样本类型，故研发出采用酶溶液的单步骤痰液化程序。通过加入1份液态酶至10份生痰并在56℃培养15～20分钟，甚至高度异质且黏稠的痰样也被液化至与5～10％甘油相似的黏度。这些液化痰样易移送和用人工MagVor和滤头实验操作流程处理，而没有造成在裂解管中的磁性盘停止转动或堵塞滤头。
例5：自生痰提取MTB DNA
如图5A和5B所示的自动的8通道原型系统被用来表明自TB阳性生痰提取DNA的可行性。利用Truant TB荧光着色剂，无法识别的患者样本通过涂片镜检被确定为或是Smear 2+、或是Smear 4+。四等分的Smear 2+生痰样本和四等分Smear 4+生痰样本根据例4中的液化实验操作流程被处理且随后被添加至MagVor管。综合MagVor/滤头试验操作流程随后通过自动提取/纯化进行。用IS6110qPCR分析仪分析洗脱液，发现提取物的浓度对于Smear 2+是3.6±0.7pg/μL，对于Smear 4+是49±8pg/μL。此数据支持自动核酸分离仪用于自TB阳性样本提取DNA的可行性。
表3示出稀释系列研究的结果，其对照比较借助自动系统的MTB实时检测和借助人工MagVor/滤头系统的MTB实时检测。MTB细胞被掺入500微升TB阴性痰和沉淀物(经NALC-NaOH处理的痰)中，在此，10个细胞粗略等于1cfu/毫升。对应于抗酸杆菌(AFB)涂片阳性和AFB涂片阴性的相应细胞等级被纳入进来以便比较。
表3.表明通过人工和自动MagVor/滤头系统的MTB DNA实时检测的稀释系列研究
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