用于单细胞转录组测序文库构建的试剂盒及文库构建方法
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒。
背景技术
随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足科研需求。单细胞测序解决了用组织样本测序或样本少时无法解决的细胞异质性难题，为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向。单细胞测序已逐渐成为科研热点。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。
单细胞转录组分析主要用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。将此技术应用于临床，理论上可以在生理或病理情况下连续追踪基因表达的动力学变化，从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表达谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因的转录组的分析，这些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。但是，鉴于目前的技术手段，单细胞转录组测序仍然存在覆盖率低的弊端，导致除mRNA以外的长非编码RNAs难以检测，并且不能区分正义链与反义链。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种用于单细胞转录组测序文库构建的试剂盒及文库构建方法。本发明在传统的单细胞转录组测序文库构建方法的基础上进行了巧妙的改进，以显著提高单细胞测序文库的产量及纯度，从而保证数据产出的稳定性。
本发明的技术方案如下：
本申请人提供了一种单细胞转录组测序文库的构建方法，包括以下步骤：
步骤A：对单细胞转录组进行扩增，构建单细胞cDNA文库；
步骤B：对cDNA文库进行片段化文库的构建，从而得到单细胞转录组测序文库。
所述步骤A单细胞cDNA文库的构建包括：
步骤A-1：单细胞裂解；
步骤A-2：反转录合成一链cDNA；
步骤A-3：合成二链cDNA及PCR预扩增；
步骤A-4：对扩增产物进行纯化，得到单细胞cDNA文库。
所述步骤A-3的二链cDNA合成及PCR预扩增中，优选采用Takara公司的Ex
所述PCR的反应程序包括变性、退火、延伸步骤；变性步骤可在93-98℃进行0.1-5分钟；退火步骤可在55-65℃进行0.1-10分钟；延伸步骤可在72℃进行0.1-15min；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可进行15-30个。
优选的，所述变性步骤可在95-98℃进行0.2-1分钟；退火步骤可在58-60℃进行0.5-2分钟；延伸步骤可在72℃进行5-11min；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可进行18-22个。
所述PCR在温度循环步骤前的模板可在93-98℃进行1-30分钟的热处理。优选的，所述PCR在温度循环步骤前的模板可在95-98℃进行1-5分钟的热处理。
所述步骤B包括：
步骤B-1：单细胞cDNA文库的片段化；
步骤B-2：对片段化的cDNA进行纯化；
步骤B-3：对纯化后的cDNA片进行段末端修复，得到平末端的DNA片段；
步骤B-4：将平末端的DNA片段连接上接头，得到加接头的DNA片段；
步骤B-5：对加接头的DNA片段进行PCR扩增；
步骤B-6：对扩增产物进行纯化得到单细胞转录组测序文库。
所述步骤B-1中优选采用超声打断的方法对cDNA文库进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220片段化处理cDNA文库时的参数设置为：循环数即Duty Cycle为9％-11％，强度即Intensity为4-6，循环数/爆发即Cycle/Burst为100-120，时间即Time为50-70s。
本申请人还提供了一种用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒，可适用于所述单细胞转录组文库的构建方法，所述试剂盒包括：用于构建单细胞cDNA文库的试剂，用于构建测序用DNA片段文库的试剂。
所述用于单细胞cDNA文库构建的试剂包括但不限于：NP40；dNTPmix；SUPERase·InTMRNaseInhibitor(Ambion)；oligo-dT primer；5×SMARTScribeTM First-strandBuffer(Clontech)；DTT(Invitrogen)；TSO；betaine；SMARTScribeTM ReverseTranscriptase(Clontech)；10×Ex Taq Buffer(Takrara)；ISPCR primer；Ex Taq HS(Takara)；nuclease-free water；
用于测序用DNA片段文库构建的试剂包括但不限于：EB Buffer；10×End RepairReaction Buffer(NEBNext)；End Prep Enzyme Mix(NEBNext)；Blunt/TA Ligase MasterMix；Adaptor for Illumina(NEBNext)；Ligation Enhancer(NEBNext)；USERTM Enzyme；Q5Hot Start HIFI PCR Master Mix(NEBNext)；index primer；universal primer。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供的单细胞转录测序方法比现有方法更为科学合理，能够显著提高单细胞测序文库的产量及纯度，从而保证数据产出的稳定性。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行详细说明。需说明的是，此处描述的实施例是对本发明的解释说明，而并非对本发明的限定。
关于下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规实验方法。关于下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获取。
实施例采用本发明提供的文库构建方法构建单细胞转录组测序文库。
1、单细胞cDNA文库制备
1.1单细胞裂解
将单细胞以0.5μl以内体积收集到包含2.65μl细胞裂解液的无RNA酶的200μl的PCR管内，其中细胞裂解液的成分如表1所示：
表1
1.2一链cDNA的合成
1)向单细胞裂解混合物中加入1μloligo-dT引物(10μM)，涡旋混匀，使单细胞充分裂解。
2)瞬时离心，将反应管置于提前预热的PCR仪中，72℃孵育3min，然后立即将反应管放到冰上，静置1min。
3)加入5.85μl的一链反应体系，用手指轻拨反应管管壁混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底，其中一链反应体系成分如表2所示：
表2
oligo-dT引物序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’(其中“V”为碱基“A”或“C”或“G”；“N”为任意碱基)；
TSO引物序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-3’。
4)将反应管置于提前预热的PCR仪中，进行反转录合成一链cDNA，反应程序如下：
42℃90min,(50℃2min,42℃2min)×10cycles,70℃15min,4℃保存。
1.3二链cDNA的合成及PCR预扩增
1)向一链合成产物中加入40μl的二链合成的PCR反应体系，用手指轻拨反应管管壁混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底，其中二链反应体系成分如表3所示：
表3
ISPCR引物序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。
2)将反应管置于提前预热的PCR仪中，进行二链cDNA的合成及PCR预扩增，反应程序如下：
98℃2min,(98℃15s,60℃30s,72℃6min)×18cycles,72℃5min,4℃保存。
1.4双链cDNA的纯化
1)纯化前将4℃储存的Ampure XP磁珠(Beckman Coulter)置于室温平衡30min，期间用无水乙醇与nuclease-freewater配制体积分数为80％的乙醇。
2)用移液器吸取45μl的Ampure XP磁珠加入步骤1.3扩增得到的双链cDNA产物中，并轻缓吹打10次混匀，然后于室温下静置10min。
3)将反应管置于磁力架上，静置5min。待溶液澄清后，用移液器小心吸取丢弃上清液(注意不要吸到磁珠)，然后用移液器加入200μl80％乙醇漂洗2次(2次漂洗之间间隔时间为30s)，最后用10μl移液器小心地吸取丢弃反应管底部残留的液体。
4)室温静置干燥5min，让乙醇尽量挥发干净。
5)将反应管从磁力架上取下，并用移液器加入15μlnuclease-freewater，并反复吹打直至溶液均一，然后室温静置5min。
6)将反应管置于磁力架上，静置2min。待溶液澄清后，用移液器小心吸取14μl上清(注意不要吸到磁珠)至干净的200μl PCR管内。
1.5cDNA文库质检
1)从纯化后的cDNA产物中吸取1μl，用Qubit3.0检测cDNA的总产量。
2)吸取1μlcDNA产物，用Agilent2100高灵敏DNA芯片检测cDNA的浓度与纯度。
2、单细胞转录组测序文库制备
2.1Covaris超声打断cDNA产物
取50ngcDNA产物，置于CovarismicroTube中，加入EB缓冲液补足体积至100μl。在提前预冷4℃循环水的Covaris S220超声打断仪上进行超声打断，程序参数设置为：
循环数(Duty Cycle)10％，强度(Intensity)5，循环数/爆发(Cycle/Burst)100，时间(Time)60s。
2.2片段化cDNA产物的纯化
用移液器从CovarismicroTube中取出50μl打断后的cDNA产物，置于干净的200μlPCR管中，加入90μlAmpure XP磁珠，同步骤1.4操作对片段化的cDNA产物进行纯化，加入57μl的nuclease-freewater洗脱，取出55.5μl纯化产物转移到干净的200μl PCR管内。
2.3末端修复
1)向55.5μl纯化后的cDNA产物中加入末端修复反应体系，用移液器吹打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底，其中反应体系成分如表4所示：
表4
2)将反应管置于PCR仪中，进行末端修复，反应程序如下：
20℃30min,65℃30min。
3)反应结束后立刻置于冰上，然后立即进入下一步接头连接反应。
2.4接头连接
1)向末端修复后的产物中加入接头连接反应体系，用移液器吹打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底，其中反应体系成分如表5所示：
表5
2)将反应管置于PCR仪中，于20℃孵育15min。
3)孵育结束后，向产物中加入3μl USER酶，充分混匀后置于PCR仪中，于37℃孵育15min。
2.5接头连接后产物的纯化
向接头连接后的86.5μl产物中加入86.5μl Ampure XP磁珠，同步骤1.4操作对进行纯化，加入17μlnuclease-free water洗脱，取出15μl纯化产物转移到干净的200μl PCR管内。
2.6PCR扩增富集
1)向步骤2.5纯化得到的17μl产物中加入PCR扩增反应体系，用移液器吹打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底，其中反应体系成分如表6所示：
表6
2)将反应管置于提前预热的PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应程序如下：
98℃30s,(98℃10s,65℃75s)×12cycles,65℃5min,4℃保存。
2.7PCR扩增产物纯化
向50μl PCR扩增产物中加入45μl Ampure XP磁珠，同步骤1.4操作进行纯化，加入33μlnuclease-free water洗脱，取出28μl纯化产物转移到干净的200μl PCR管内。
2.8测序文库质检
1)从步骤2.5纯化得到的测序文库中吸取1μl，用Qubit3.0检测测序文库的总产量。
2)吸取1μl测序文库，用Agilent2100高灵敏DNA芯片检测测序文库的浓度与纯度。
3、用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒，包括：用于构建单细胞cDNA文库的试剂，用于构建测序用DNA片段文库的试剂。
所述用于单细胞cDNA文库构建的试剂包括但不限于：NP40；dNTPmix；SUPERase·InTMRNaseInhibitor(Ambion)；oligo-dT primer；5×SMARTScribeTM First-strandBuffer(Clontech)；DTT(Invitrogen)；TSO；betaine；SMARTScribeTM ReverseTranscriptase(Clontech)；10×Ex Taq Buffer(Takrara)；ISPCR primer；Ex Taq HS(Takara)；nuclease-free water；
用于测序用DNA片段文库构建的试剂包括但不限于：EB Buffer；10×End RepairReaction Buffer(NEBNext)；End Prep Enzyme Mix(NEBNext)；Blunt/TA Ligase MasterMix；Adaptor for Illumina(NEBNext)；Ligation Enhancer(NEBNext)；USERTM Enzyme；Q5Hot Start HIFI PCR Master Mix(NEBNext)；index primer；universal primer。
