一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学域，特别涉及一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法。
背景技术
水稻产量关乎世界粮食安全，一直以来都是农业科技工作者关注的焦点和热点。我们目前可以通过各种手段来提高水稻产量，比如施肥打药、科学种田、合理灌溉、发展杂交稻、发展再生稻、三季稻种植、通过转基因技术改良水稻等。随着社会的进步，在我们要建设环境友好型社会和要求食品安全的情况下，大力改良水稻，节约化肥少打药是一个共识，而这里就有两点值得关注，一是发展杂交稻，例如红莲型杂交稻“路优8号”和“洛优10号’，具有高产、优质、广适、节省农药化肥；二是发掘优质基因转化水稻提高水稻产量和抗逆抗病虫害能力，如显著提高水稻产量的玉米基因shrunken-2(Sh2)，Bph14/I S抗褐飞虱基因等。
研究发现农杆菌侵染的宿主多，农杆菌转基因先在双子叶植物(如拟南芥和烟草等)中得到了应用，后来在单子叶植物(水稻、玉米、高粱、小麦等)里也得到应用。农杆菌转基因技术的高效和其具有的独特优势，使得多个大型突变体库被构建成功；研究人员可以采用一些方法如接头PCR、环化PCR,TaiL-PCR等鉴定插入位点的侧翼序列，而有的侧翼序列信息己经被提交在网站上供有需要的其他科研工作者参考和分析，好处就是省去了我们费时费力的图位克隆工作。
农杆菌介导的转基因技术的优点。1、由于插入的T-DNA序列是己知的，这就可以从正向遗传学方法研究基因和表型的关系，而且克隆基因相对简单些；2、农杆菌转基因虽然会插入多个拷贝，但是相对来说还是很低的，有利于得到纯合的能稳定遗传的单株，符合孟德尔遗传分离定律等；3、目前的研究表明T-DNA插入有偏好性，但是也有随机性，并在大型突变体库的构建中得到了应用。
菰是国家二级保护植物品种，也是水稻的近缘属，具有生物量大、抗病从，耐寒等许多优良性状，近年来被众多研究学者作为水稻育种优良基因资源库的重要来源。然而，针对菰的分子生物学研究仍处于起步阶段，菰的遗传信息获得还很不完善，对菰基因信息的有限所知严重阻碍了其作为水稻育种优良基因资源库的研究与应用，因此开发一种高效利用菰的优良基因资源库进行水稻品种改良的方法十分重要。
目前，水稻育种分为传统杂交育种和基因重组育种，传统杂交育种具有遗传背景单一，筛选周期长的缺点，无法高效富集优良基因，基因重组育种又受限于对单一基因的测序、定位和克隆，无法高通量筛选优良的转基因水稻品种。因此，开发一种快速，简单、高效的高通量转化菰的cDNA文库改良水稻品种的方法十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前对菰遗传资源利用和水稻育种中存在的问题，本发明公开了一种快速，简单、高效的高通量转化菰的cDNA文库改良水稻品种的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法，包含以下操作步骤：
(1)菰cDNA文库的构建；
(2)E.coli菰cDNA文库大规模质粒抽提；
(3)菰目的cDNA过表达文库质粒电转化农杆菌，方法如下：
(A)首先从-70℃取出6支农杆菌感受态放置于冰上融解；
(B)电转前加入2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻吹打混匀；
(C)将质粒和细胞的LB混合物从一侧加入冰上预冷的电转杯，用吸水纸擦干净电转杯外面的水份，然后放在电转仪上以2500V高压进行电击；
(D)迅速取出电转杯，加入900μL预冷的LB培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，并吸出菌液转移到2mL离心管中，27℃，250rpm振荡培养2h，依次对6支农杆菌感受态进行电转，随后同样的条件进行摇菌；
(E)涂平板时，每管各取100μL菌液涂在含氨苄青霉素的LB平板上，28℃倒置培养2-3d，然后对平板上的菌落进行计数。
(4)农杆菌介导菰cDNA转化改良水稻品种：
(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中。用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽。按每平皿10粒种子将种子接种到N6固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养35天；
(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养20d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有羧基乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养3天；
(c)将含有菰cDNA的农杆菌涂布于含有Rif和氨苄青霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养28h。在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有菰cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50uL，50mg/mL的羧基乙酰丁香酮，标定OD600为0.1。然后加入在AS上生长3天的愈伤组织，42℃条件下热孵育30min；
(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干。随后，将其转移到共培养培养基上，22℃，黑暗下培养3d；
(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含400mg/L头孢霉素的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；
(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有450mg/L，头孢霉素60mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织15颗，28℃黑暗条件下培养20天，再将愈伤组织接种到新的含有450mg/L头孢霉素、60mg/L氨苄青霉素筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养20天；
(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置4～6天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长15～20天，幼苗长至2～4cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；
(h)当转基因一苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；
(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，筛选优良水稻品系。
2.优选地，所述菰cDNA文库构建包含以下操作步骤：
(1)菰总RNA提取，加液氮在研钵中研磨菰的幼茎，用TRIzoL分别提取各种材料的总RNA，并取少量RNA用于琼脂糖凝胶电泳和测定其OD260/OD280，OD260/OD230值.；
(2)参照Creator SMART cDNA Construction Kit说明书采用LD PCR方法合成一二链，并电泳检测结果.将合成的cDNA产物随后用DSN双链特异性核酸酶进行均一化处理，均一化后的样品进行PCR扩增，并电泳检测结果；
(3)均一化后的PCR产物纯化回收后末端加A，用PCR clean up Kit回收加A产物，连接到pMD19T-simpLe Vector载体上，转化到E.coli中，涂布于含氨苄青霉素(25pg/mL)的LB平板进行培养.使用M13通用引物对随机挑取的100个单菌落进行PCR扩增后电泳鉴定，根据电泳结果估计插入片段的大小以及小片段率，并计算库容量。
优选地，所述农杆菌菌株为EHA105，E.coli菌株为DH10B或TOP10，所述水稻品种为日本晴。
优选地，转基因系T0代均种植与温室，套袋自交，T1～T2代群体种植于室外大田。
优选地，所述E.coli菰cDNA文库大规模质粒抽提方法如下：
(A)取400μL的E.coli菰目的库菌液接到含有200mL LB培养基的1L锥形瓶中，加200uL氨苄青霉素，37℃，300rpm培养16h；
(B)取四个100mL离心管将菌液离心，收集沉淀，条件是4℃,12000g离心2min；
(C)每个离心管分别加入10mLP1(P1用前要确保加入RNase A和LyseBLue)，然后将沉淀混匀，不要有块状沉淀；
(D)每个离心管各加入10mL37℃预热的P2并立即扣上盖子，动作轻柔，上下颠倒10次彻底混匀菌液，直到细菌悬液变蓝为止，室温25℃孵育时间3min；
(E)上述菌液变蓝以后每管应及时加入10mL预冷的P3，并立刻上下轻柔颠倒10次混匀菌液，可见蓝色变清，出现白色絮状物，再冰上孵育20min；
(F)孵育后，4℃，12000g离心30min，吸取上清，弃去沉淀；
(G)再次离心以4℃，12000g离心15min，同样吸取上清。
(H)用QBT平衡液平衡柱子，取一个QIAGEN-tip 500，加入QBT 10mL，通过重力作用，使QBT液体自然流空；
(I)将含有质粒的上清加入柱子，使其自然流下通过滤膜，用洗涤液QC洗涤3次，每次30mL，自然流空的方式清洗柱子，然后用15mL质粒洗脱液QF洗脱DNA；
(J)沉淀DNA，加入异丙醇10.5mL(按照洗脱液0.7倍的体积)到洗脱液中，立刻上下颠倒混匀，然后4℃，12000g离心30min，弃去上清；
(K)用6mL 75％酒精清洗，12000g离心15min，弃上清；
(L)自然干燥沉淀15min，加100μLTE，PH8.0溶解沉淀，用Nanodroping测定质粒的浓度。
优选地，所述菰为未被菰黒粉菌感染的中国野生结实颖果菰。
本发明获得的有益效果：
将菰的基因通过cDNA文库的构建高通量转化进入水稻基因组中，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、叶形、叶色方面均呈现出明显的变化，考种分析显示23个水稻转基因系与产量提升相关。本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良，亦可利用转基因水稻的突变性状反向研究菰cDNA文库中单个或多个基因的功能。
附图说明
图1氨苄青霉素引物PCR鉴定阳性转基因株系
M：DNA Marker
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：
转化中国野生结实颖果菰cDNA文库改良水稻品种
(1)中国野生结实颖果菰cDNA文库的构建：
(1.1)中国野生结实颖果菰总RNA提取，加液氮在研钵中研磨中国野生结实颖果菰的幼茎，用TRIzoL分别提取各种材料的总RNA，并取少量RNA用于琼脂糖凝胶电泳和测定其OD260/OD280，OD260/OD230值.；
(1.2)参照Creator SMART cDNA Construction Kit说明书采用LD PCR方法合成一二链，并电泳检测结果.将合成的cDNA产物随后用DSN双链特异性核酸酶进行均一化处理，均一化后的样品进行PCR扩增，并电泳检测结果；
(1.3)均一化后的PCR产物纯化回收后末端加A(条件为模板:10μL，10×PCR Buffer:5μL，dNTPmix:1μL，rTaq酶:0.3μL，H2O:33.7μL，72℃，30min)，用PCR cLean up Kit回收加A产物，连接到pMD19T-simpLe Vector载体上，转化到感受态E.coli DH10B中，涂布于含氨苄青霉素(25pg/mL)的LB平板进行培养.使用M13通用引物对随机挑取的50个单菌落进行PCR扩增后电泳鉴定，根据电泳结果估计插入片段的大小以及小片段率，并计算库容量；
(2)E.coli DH10B中国野生结实颖果菰cDNA文库大规模质粒抽提：
(A)取400uL的E.coli DH10B中国野生结实颖果菰目的库菌液接到含有200mL LB培养基的1L锥形瓶中，加200μL氨苄青霉素，37℃，300rpm培养16h；
(B)取四个100mL离心管将菌液离心，收集沉淀，条件是4℃,12000g离心2min；
(C)每个离心管分别加10mL P1(P1用前要确保加入RNase A和LyseBLue)，然后将沉淀混匀，不要有块状沉淀；
(D)每个离心管各加入10mL37℃预热的P2并立即扣上盖子，动作轻柔，上下颠倒10次彻底混匀菌液，直到细菌悬液变蓝为止，室温25℃孵育时间3min；
(E)上述菌液变蓝以后每管应及时加入10mL预冷的P3，并立刻上下轻柔颠倒10次混匀菌液，可见蓝色变清，出现白色絮状物，再冰上孵育20min；
(F)孵育后，4℃，12000g离心30min，吸取上清，弃去沉淀；
(G)再次离心以4℃，12000g离心15min，同样吸取上清。
(H)用QBT平衡液平衡柱子，取一个QIAGEN-tip 500，加入QBT 10mL，通过重力作用，使QBT液体自然流空；
(I)将含有质粒的上清加入柱子，使其自然流下通过滤膜，用洗涤液QC洗涤3次，每次30mL，自然流空的方式清洗柱子，然后用15mL质粒洗脱液QF洗脱DNA；
(J)沉淀DNA，加入异丙醇10.5mL(按照洗脱液0.7倍的体积)到洗脱液中，立刻上下颠倒混匀，然后4℃，12000g离心30min，弃去上清；
(K)用6mL 75％酒精清洗，12000g离心15min，弃上清；
(L)自然干燥沉淀15min，加100μLTE，PH8.0溶解沉淀，即为重组质粒溶液。
(3)中国野生结实颖果菰目的cDNA过表达文库质粒电转化农杆菌EHA105，方法如下：
(A)首先从-70℃取出6支农杆菌EHA105感受态放置于冰上融解；
(B)电转前加入2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻吹打混匀；
(C)将质粒和细胞的LB混合物从一侧加入冰上预冷的电转杯，用吸水纸擦干净电转杯外面的水份，然后放在电转仪上以2500V高压进行电击；
(D)迅速取出电转杯，加入900μL预冷的LB培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，并吸出菌液转移到2mL离心管中，27℃，250rpm振荡培养2h，依次对6支农杆菌EHA105感受态进行电转，随后同样的条件进行摇菌；
(E)涂平板时，每管各取100μL菌液涂在含氨苄青霉素的LB平板上，28℃倒置培养2-3d，然后对平板上的菌落进行计数。
(4)农杆菌EHA105介导中国野生结实颖果菰cDNA转化改良水稻“日本晴”：
(a)选择日本晴颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中。用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽。按每平皿10粒种子将种子接种到N6固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养35天；
(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养20d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有羧基乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养3天；
(c)将含有中国野生结实颖果菰cDNA的农杆菌EHA105涂布于含有Rif和氨苄青霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养28h。在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌EHA105悬浮培养基轻轻吹打含有中国野生结实颖果菰cDNA的农杆菌EHA105，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌EHA105悬浮培养基中，同时加入50uL，50mg/mL的羧基乙酰丁香酮，标定OD600为0.1。然后加入在AS上生长3天的愈伤组织，42℃条件下热孵育30min；
(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干。随后，将其转移到共培养培养基上，22℃，黑暗下培养3d；
(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含400mg/L头孢霉素的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；
(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有450mg/L头孢霉素，60mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织15颗，28℃黑暗条件下培养20天，再将愈伤组织接种到新的含有450mg/L头孢霉素、60mg/L氨苄青霉素筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养20天；
(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置4～6天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长15～20天，幼苗长至2～4cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；
(h)当转基因一苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；
(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，转基因系T0代均种植与温室，套袋自交，T1～T2代群体种植于室外大田，每份材料种植30～50株，每行10株，常规水稻种植管理，筛选优良水稻品系。
(5)阳性转基因系PCR鉴定：
首先先取10cm长的T2代水稻叶片，加入2mL离心管中，并用剪刀将其剪成0.5mL大小，加入2xCTAB 100μL，在打样机上将水稻叶片打碎，再加入600μL的2xCTAB于65℃水浴锅中水浴1h。然后冷却到室温再加入700μL的氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒10次后进行室温12000rpm离心15min。离心后吸取上清500μL，再加入500μL异丙醇，混匀后放到-20℃冰箱中沉淀30min，沉淀过后，12000rpm，4℃条件下离心15min。此时弃去上清，再用75％酒精清洗沉淀，12000rpm，4℃条件下离心15min。弃去酒精，无菌台上吹干，加入100μL无菌ddH20溶解沉淀DNA。
根据转基因载体pMD19T-simpLe Vector上的氨苄青霉素基因序列片段设计引物(表1)，对转基因材料进行PCR阳性鉴定，条件如下：
PCR体系：ddH2O 6.0μL，10×buffer 1.0μL，TaqMIX 1.5μL，模板1μL，引物0.5μL；
PCR反应条件：95℃10min，95℃45s，63.5℃45s，72℃1min，35循环，72℃10min。
表1氨苄青霉素验证引物序列
实验结果如下：
中国野生结实颖果菰cDNA文库库容量是6.2×106CFU/mL，转化效率是100％，并按照文库构建试剂盒CloneMinerTM II cDNA Library Construction Kit中鉴定插入片段大小的方法，通过BsrGI酶切的方式鉴定了插入载体中的片段的大小介于1kb～3kb。
表2筛选获得的23个产量提升转基因系的表型
由表2可知，根据表型综合筛选出来的具有增产潜质的23个基因系中，单株产量、株高和分蘖数均显著增加，为品种的增产提供了基础，生育期明显缩短，可以增加单位时间内的土地种植效益，叶形较野生型有显著改变，最终的结果还是增加了叶表面积，为光合作用积累营养物质打下基础。
由图1可知经过T0、T1、T2代的种植，稳定遗传外源基因的阳性转基因系仍为绝大多数，可见本发明在高效改良水稻品种的同时，还兼具遗传稳定性，为将菰的优良基因整合进入水稻提供了可靠的方法，筛选出的阳性克隆还可用于基因功能研究和定位，为进一步了解菰的基因功能提供可能。
综上所述，本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良，亦可利用转基因水稻的突变性状反向研究菰cDNA文库中单个或多个基因的功能。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
