一种具有核酸内切酶活性的RecJ蛋白及在基因编辑中的应用
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，并且特别地涉及基于核酸酶的酶切活性开展的基因编辑、基因组修饰、基因组突变和质粒消除。本发明涉及核酸酶形式的遗传工程工具，所述核酸酶可以在没有序列指导下进行多位点剪切和在有序列指导下进行定点剪切。此外，本发明涉及体外或体内的核酸序列特异性编辑以及用于实现该过程的相关方法。
背景技术
RecJ蛋白属于一类磷酸二酯酶，广泛分布在细菌、古菌和真核生物。典型的RecJ,如大肠杆菌的RecJ,具有DHH、DHHA1和OB三个结构域，能够从5′-3′降解单链DNA。DHH、DHHA1形成催化的核心，而OB结构域在结合DNA方面起辅助作用。而细菌的RecJ-like蛋白，只具有DHH和DHHA1两个结构域，能够发挥寡核糖核酸酶和磷酸酯酶的作用，参与了核苷酸的循环。
RecJ是依赖于Mg2+或Mn2+的一类特异性核酸外切酶，大量研究表明RecJ和RecBCD可能有功能上的重叠。在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，RecB和RecJ的突变导致重组修复缺失。耐辐射球菌本身缺乏RecBCD,当敲除RecJ后，其生长受到抑制并且对高温异常敏感。大肠杆菌和耐辐射球菌的RecJ核心结构域能够与单链DNA结合蛋白相互作用，从而激活RecJ的核酸酶活性。
RecJ同源基因在几乎所有的真核生物、原核生物和古菌中都被发现了，表明从进化早期开始，就一直存在RecJ基因。RecJ在同源重组的RecF通路中是必不可少的，在RecQ解螺旋酶解开双链DNA后，其能够降解5′链并形成3′突出，用于重组启动。RecJ还参与了RecBCD通路,有助于RcBCD促进的重组，在DNA的修复过程中有着重要作用。RecJ蛋白除了能够特异地从单链DNA的5′端降解DNA外，还可以从单链RNA的3′端降解RNA。
到目前为止，所有被报道的RecJ，只能发挥外切酶的功能，且仅作用于单链DNA或RNA。申请人通过对来自嗜碱芽孢杆菌的RecJ蛋白的研究，发现来自嗜碱芽孢杆菌的RecJ不仅能够发挥核酸外切酶的功能，也能够发挥核酸内切酶的功能，能够内切质粒DNA成开环和线性化，并彻底降解，上述功能与已报道的RecJ截然不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种RecJ蛋白在基因编辑中的应用，使用RecJ蛋白进行双链DNA的切割；从而能够对基因组DNA进行切割，从而产生突变，是一种诱发突变，产生突变体库的新技术。
本发明首先提供RecJ蛋白在核苷酸降解中的应用，所述的核苷酸为双链DNA核苷酸；
本发明再一个方面提供RecJ蛋白在质粒消除中的应用，
本发明再一个方面还提供RecJ在构建突变体库中的应用，所涉突变体库的突变类型包括单核苷酸突变；插入缺失突变和结构变异突变；
本发明的RecJ蛋白在调节细胞形态和基因组编辑中的应用。
本发明提供的RecJ酶，包含有：
a)序列为SEQ ID NO:1的酶蛋白，
b)从海洋嗜碱菌中获得的，与序列为SEQ ID NO:1的酶蛋白具有55％或以上相似性的，具有核酸酶内切酶和外切酶功能的酶；
c)对序列为SEQ ID NO:1的酶蛋白的一个或多个氨基残基进行取代突变所获得的，具有核酸酶内切酶和外切酶功能的蛋白酶；
更进一步的，所述的b)中，是与序列为SEQ ID NO:1的酶蛋白具有55％及其以上相似性的蛋白酶；优选为相似性为65％及以上的蛋白酶；
本发明再一个方面提供用于编码RecJ酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明另一方面提供一种重组载体，该重组载体携带有用于表达本发明的核酸酶RecJ蛋白；
所述的重组表达载体为原核重组表达载体。
本发明使用从海洋嗜碱菌(Bacillus alcalophilus)克隆到的RecJ基因剪切超螺旋质粒成开环和线性化，直至将所作用的质粒彻底降解；该BaRecJ能够对表达宿主基因组同时进行多个位点的剪切，影响宿主的分裂；该酶能够消除宿主内携带该基因的质粒和宿主内的其他质粒。
附图说明
图1：BaRecJ的结构分析图；
图2：纯化的BaRecJ的SDS-PAGE分析电泳图；
图3：BaRecJ对大肠杆菌的存活率的影响图；
图4：BaRecJ蛋白在不同Mg2+对质粒的剪切和降解效率图；
图5：BaRecJ蛋白在不同Mn2+的质粒的剪切和降解效率图；
图6：BaRecJ蛋白在不同温度对质粒的剪切和降解效率图；
图7：不同含量BaRecJ蛋白对质粒的剪切和降解效率图。
具体实施方式
本发明用海洋嗜碱菌(Bacillus alcalophilus)克隆d的RecJ基因，构建了诱导型原核表达载体并研制了重组蛋白，该表达载体在大肠杆菌内表达稳定，重组蛋白在体外能够剪切超螺旋质粒成开环和线性，随着孵育时间的延长能够进一步彻底降解质粒；从而发现了RecJ基因降解双链DNA的新功能。
下面以嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)RecJ基因(命名为BaRecJ)的克隆、表达、内外切酶活性验证为例，结合附图，对本发明的实施方式进行详细说明。
实施例1嗜碱芽孢杆菌RecJ基因的克隆
通过分析嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)的基因组信息，确定了一种新型的RecJ基因，设计两对基因特异性引物(5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP1)。利用细菌DNA提取试剂盒提取嗜碱芽孢杆菌的DNA，
嗜碱芽孢杆菌DNA提取(根据索莱宝公司试剂盒)：
1、取细菌培养液1ml，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
2、向菌体中加入200ul溶液A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，向悬浮液中加入20ul的RNase A(10mg/ml)和50ul溶菌酶，充分颠倒混匀，室温放置30min-60min。
3、向管中加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混匀，55℃消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状。
4、向管中加入200ul溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。
5、向管中加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min。
6、12000rpm离心2min.弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul
经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。
通过PCR扩增获得RecJ基因的编码区。
引物序列如下：
5GSP1：ATAAACCGTGGAGCGAGACC
5GSP2：CCACCAGTTGCCAATAAGTC
3GSP1：ATGTTGAATCCAAAGGCAAG
3GSP1：TTATACCGTCTCCTTGATTG
将通过PCR扩增出来的BaRecJ产物，经纯化回收，连接到pMD19-T载体上，送上海生工进行序列测定。测序结果表明该基因ORF为2364bp(SEQ ID NO:2)，编码787个氨基酸(SEQID NO:1)。将获得的蛋白序列与目前已经报道的大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜碱菌(Thermus thermophiles)、耐辐射球菌(Deinoeoeeus radioduran)的RecJ进行序列比较，序列同源性低于50％。
BaRecJ除了具有DHH和DHHA1结构域外，还有一个未知功能的C末端结构域。这是该蛋白与目前已经报道的RecJ的重要差异。来自NCBI的数据显示，在C末端区域包含一个piwi-like的结构域(图1)；将RecJ基因的DHH结构域(1-241氨基酸)克隆到pET-28a(+)表达载体，构建原核表达载体，经诱导表达获得重组蛋白。
1、通过PCR扩增获得RecJ基因的编码区，引物序列如下：
(f：CTTTAAGAAGGAGATATACCATGTTGAATCCAAAGGCAAG R：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCTAATAAACGATTTTCGT)
2、将PCR产物构建到pET-28a(+)载体，进行诱导表达
3、将诱导表达产物与质粒按照一定比例混合，在37℃孵育2个小时
4、1％琼脂糖凝胶电泳检测该结构域蛋白对质粒的降解情况。
基于体外实验表明，DHH结构域能剪切超螺旋质粒成开环，最终彻底降解(图7)。
实施例2嗜碱芽孢杆菌RecJ对大肠杆菌形态的影响
将RecJ基因的全长构建到pACYCDuet-1，构建表达载体。诱导表达发现该基因对大肠杆菌的形态产生了深刻的影响，显微镜下观察到细胞呈很多细丝状，表面细胞的分裂收到了抑制，表现为细胞数量减少(图2)
实施例3嗜碱芽孢杆菌RecJ基因的诱导表达
采用的载体是pET-28a(+)载体，该载体的优点是：可以用IPTG进行诱导，能够快速，高效的产生大量蛋白，重组蛋白的N端带有6个His标签，方便分离纯化。
将RecJ基因的编码区克隆到pET-28a(+)表达载体，构建嗜碱芽孢杆菌RecJ基因的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行体外重组表达。经过His-tag亲和层析柱纯化，获得嗜碱芽孢杆菌RecJ基因重组蛋白，PAGE电泳进行检测(图3)。
RecJ诱导表达：
1、挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,250rpm震荡培养过夜；
2.将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5；
3.加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃,250rpm震荡培养2-3h；
4.4℃,4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10min；
5.进行冰浴超声破碎5-10min(10-20sec/次)，至菌液较为澄清；
6.加入10％TritonX-100至终浓度为0.5％,4℃震荡15min；
7.4℃,12000rpm离心10min后，取上清；
8.用相同体积的1xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色；
9.电泳结果显示该蛋白的分子大小符合预测的分子量。
实施例4 BaRecJ的理化性质
1)BaReaJ对离子依赖的浓度实验
BaReaJ蛋白的活性各种离子的影响，其中影响显著的分别是镁离子、锰离子和钴离子。BaReaJ在镁离子浓度为50mM下活性较高，在锰离子浓度为10mM下活性较高(图4，图5)。
2)BaReaJ蛋白温度活性验证
BaReaJ蛋白的活性受温度的影响，23℃几乎没有活性，37℃活性最大，44℃和50℃活性显著降低，可能是蛋白在高温下失活。(图6)
实施例5 BaRecJ通过对质粒进行内切断裂将其消除
将含有pACYCBaRJ质粒的转化子涂布到含有IPTG诱导剂的平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落分别接种到LB培养基和含有相应抗生素的液体培养基。随机挑取的20个单菌落，在LB培养基上全部生长，在含有氯霉素的培养基上11个没有生长，9个生长。对11个在抗生素培养基上没有生长的11个克隆进行PCR鉴定，有5个有
扩增条带，6个没有扩增条带，说明这6个克隆质粒被彻底消除(表1)。对含有pACYCBaRJ和pET-23b(+)两个质粒的转化子，质粒消除的检测方法依据单质粒的方法进行，最终的结果显示：在挑取的20个克隆中，8个克隆pACYCBaRJ质粒被消除，2个克隆pET-23b(+)质粒被消除，总计有2个克隆中的pACYCBaRJ和pET-23b(+)质粒被彻底消除(表2)。
表1：6个克隆质粒消除数据表
备注：pACYCBaRJ构建自原核表达载体pACYCDuet-1，氯霉素抗性，在多克隆位点插入BaRecJ基因，pET-23b(+)，原核表达载体，氨苄青霉素抗性。
表2：pACYCBaRJ和pET-23b(+)质粒被消除数据表
实施例6BaRecJ对基因组断裂引起宿主的突变
将含有BaRecJ质粒的转化子经IPTG诱导，直至转接到第10代，并基于第二代测序技术进行重测序；步骤如下：
1、含有pACYCBaRJ质粒的转化子涂布在含有相应抗生素和IPTG诱导剂的LB平板，37℃过夜培养；挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min震荡过夜培养，
2、1％的接种量进一步转接到LB液体培养基中，37℃连续
振摇培养，每隔16h转管，每传1次记为1代，直到转接到第10代。
3、心收集样品，通过第二代测序技术进行高通量测序，检测BaRecJ引起的基因组的突变。
结果表明，BaRecJ的诱导表达使基因组产生了深刻的突变，在检测的样品中，平均每个样品产生了133个单核苷酸突变，2插入/删除和6个结构变异等突变类型(表3)
表3：结构变异等突变类型统计表
[0001] 序列表
[0002] <110>国家海洋局第一海洋研究所
[0003]青岛大学
[0004] <120>一种具有核酸内切酶活性的RecJ蛋白及在基因编辑中的应用
[0005] <160>2
[0006] <170>SIPOSequenceListing 1.0
[0007] <210>1
[0008] <211>577
[0009] <212>PRT
[0010] <213>海洋嗜碱菌(Bacillus alcalophilus)
[0011] <400>1
[0012] Met Lys Gln Gln Ile Gln Leu Arg Arg Arg Glu Val Asp Glu Thr Ala
[0013] 151015
[0014] Asp Leu Pro Ala Glu Leu Pro Pro Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Ala Ser
[0015]2025 30
[0016] Arg Gly Val Arg Ser Ala Gln Glu Leu Glu Arg Ser Val Lys Gly Met
[0017]3540 45
[0018] Leu Pro Trp Gln Gln Leu Ser Gly Val Glu Lys Ala Val Glu Ile Leu
[0019] 505560
[0020] Tyr Asn Ala Phe Arg Glu Gly Thr Arg Ile Ile Val Val Gly Asp Phe
[0021] 65 70 7580
[0022] Asp Ala Asp Gly Ala Thr Ser Thr Ala Leu Ser Val Leu Ala Met Arg
[0023] 859095
[0024] Ser Leu Gly Cys Ser Asn Ile Asp Tyr Leu Val Pro Asn Arg Phe Glu
[0025] 100 105110
[0026] Asp Gly Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Val Val Asp Gln Ala His Ala Arg
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[0028] Gly Ala Gln Leu Ile Val Thr Val Asp Asn Gly Ile Ser Ser His Ala
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[0030] Gly Val Glu His Ala Arg Ser Leu Gly Ile Pro Val Ile Val Thr Asp
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[0032] His His Leu Pro Gly Asp Thr Leu Pro Ala Ala Glu Ala Ile Ile Asn
[0033]165170 175
[0034] Pro Asn Leu Arg Asp Cys Asn Phe Pro Ser Lys Ser Leu Ala Gly Val
[0035] 180 185190
[0036] Gly Val Ala Phe Tyr Leu Met Leu Ala Leu Arg Thr Phe Leu Arg Asp
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[0038] Gln Gly Trp Phe Asp Glu Arg Gly Ile Ala Ile Pro Asn Leu Ala Glu
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[0040] Leu Leu Asp Leu Val Ala Leu Gly Thr Val Ala Asp Val Val Pro Leu
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[0042] Asp Ala Asn Asn Arg Ile Leu Thr Trp Gln Gly Met Ser Arg Ile Arg
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[0044] Ala Gly Lys Cys Arg Pro Gly Ile Lys Ala Leu Leu Glu Val Ala Asn
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[0070] Glu Val Val Ser Asp Gly Pro Leu Ser Pro Ala Glu Met Thr Met Glu
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[0073] 485 490 495
[0074] Glu Pro Leu Phe Asp Gly His Phe Arg Leu Leu Gln Gln Arg Leu Val
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[0082] Phe Arg Gly Asn Arg Ser Leu Gln Ile Ile Ile Asp Asn Ile Trp Pro
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[0084] Ile
[0085] <210>2
[0086] <211>1735
[0087] <212>DNA
[0088] <213>海洋嗜碱菌(Bacillus alcalophilus)
[0089] <400>2
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