一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法
技术领域
本发明涉及淋巴细胞技术领域，具体为一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法。
背景技术
T淋巴细胞占外周血单核细胞的75％，其在感染、肿瘤以及自身免疫性疾病中发挥重要的调节作用，T细胞表面膜受体(TCR)β和δCDR3区域是T细胞识别抗原的关键区域，利用多重PCR技术构建CDR3文库，再结合高通量测序分析技术，能够深入了解CDR3基因序列构成规律，全面评估机体免疫系统的多样性，挖掘CDR3基因重排与疾病关系。
目前，CDR3文库扩增效率低、扩增序列片段长以及测序费用高、操作复杂，这些都是实际存在而又急需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法，本发明能够高效的扩增TCRβ和TCRδCDR3区域，巢式PCR的方法扩增效率高达90％，可高效构建CDR3文库，解决样本中TCR模板量少的问题；利用特异性的PCR扩增酶，克服多重PCR扩增效率不均衡的现象，还原模板中CDR3的真实组成情况；利用此方法扩增的CDR3文库大小主要集中在100bp-300bp之间，能够通过二代测序将其条带测通，有效降低其测序成本，从而了解CDR3序列的排列情况，准确评估CDR3序列的重排情况，为进一步的市场开发应用提供可能性。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法，包括以下步骤：
a.实验试剂：RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR扩增酶的准备；
b.利用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞样本RNA；
c.利用cDNA合成试剂盒将提取出的RNA样本反转录为cDNA；
d.将合成的cDNA样本通过多重PCR和巢式PCR扩增，多重PCR引物为；
e.对扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、测定其浓度。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤a中：使用TIANGEN的RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，严格按照说明书中的操作步骤进行淋巴细胞中RNA的提取。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤b中：需对提取出的RNA进行浓度检测。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤c中：利用Roche公司cDNA合成试剂盒将提取出的200ngRNA样本反转录为cDNA；
反转录体系为：
RNA 200ng
试剂盒中5或6二选一2μL
ddH2O 补齐到13μL
在PCR仪中设定65℃×10分钟+4℃×2分钟；
将PCR产物取出，再依次加入：
在反应管中将试剂小心混匀，轻度离心后，在PCR仪中设定55℃×30分钟+85℃×5分钟。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤d中：将完成的cDNA样本通过多重PCR和巢式PCR扩增；
1)PCR外套体系：
在PCR仪中设定95℃/15分钟+(94℃/30秒+55℃/30秒+72℃/90秒)×30次+72℃/10分钟；
2)PCR内套体系：
在PCR仪中设定95℃/15分钟+(94℃/30秒+62℃/30秒+72℃/60秒)×30次+72℃/10分钟。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤e中：对扩增后的PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶，在90V、100mA的电泳条件下跑电泳30分钟进行鉴定、测定其浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明能够高效的扩增TCRβ和TCRδCDR3区域，巢式PCR的方法扩增效率高达90％，可高效构建CDR3文库，解决样本中TCR模板量少的问题；利用特异性的PCR扩增酶，克服多重PCR扩增效率不均衡的现象，还原模板中CDR3的真实组成情况；利用此方法扩增的CDR3文库大小主要集中在100bp-300bp之间，能够通过二代测序将其条带测通，有效降低其测序成本，从而了解CDR3序列的排列情况，准确评估CDR3序列的重排情况，为进一步的市场开发应用提供可能性。
具体实施方式
本发明提供一种技术方案：一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法，包括以下步骤：
a.实验试剂：RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR扩增酶的准备；
b.利用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞样本RNA；
c.利用cDNA合成试剂盒将提取出的RNA样本反转录为cDNA；
d.将合成的cDNA样本通过多重PCR和巢式PCR扩增，多重PCR引物为；
e.对扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、测定其浓度。
所述步骤a中：使用TIANGEN的RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，严格按照说明书中的操作步骤进行淋巴细胞中RNA的提取；
所述步骤b中：需对提取出的RNA进行浓度检测。
所述步骤c中：利用Roche公司cDNA合成试剂盒将提取出的200ngRNA样本反转录为cDNA；
反转录体系为：
RNA200ng
试剂盒中5或6二选一 2μL
ddH2O补齐到13μL
在PCR仪中设定65℃×10分钟+4℃×2分钟；
将PCR产物取出，再依次加入：
在反应管中将试剂小心混匀，轻度离心后，在PCR仪中设定55℃×30分钟+85℃×5分钟。
所述步骤d中：将完成的cDNA样本通过多重PCR和巢式PCR扩增；
1)PCR外套体系：
在PCR仪中设定95℃/15分钟+(94℃/30秒+55℃/30秒+72℃/90秒)×30次+72℃/10分钟；
2)PCR内套体系：
在PCR仪中设定95℃/15分钟+(94℃/30秒+62℃/30秒+72℃/60秒)×30次+72℃/10分钟。
所述步骤e中：对扩增后的PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶，在90V、100mA的电泳条件下跑电泳30分钟进行鉴定、测定其浓度。
在一种构建人T淋巴细胞受体β链互补决定区CDR3文库的PCR引物和方法中，首先通过能够高效的扩增TCRβ和TCRδCDR3区域，巢式PCR的方法扩增效率高达90％，可高效构建CDR3文库，解决样本中TCR模板量少的问题；利用特异性的PCR扩增酶，克服多重PCR扩增效率不均衡的现象，还原模板中CDR3的真实组成情况；利用此方法扩增的CDR3文库大小主要集中在100bp-300bp之间，能够通过二代测序将其条带测通，有效降低其测序成本，从而了解CDR3序列的排列情况，准确评估CDR3序列的重排情况，为进一步的市场开发应用提供可能性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
