一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒。
背景技术
鼻腔内数以亿计的微生物在人体健康及疾病中有重要作用，研究表明，鼻窦炎、过敏性鼻炎、嗅觉减退、甚至阿兹海默症等疾病都与鼻腔菌群失调有关。鼻腔菌群主要从两个方面影响人体健康，一方面少数致病菌可以直接引发急性炎症，危害人体健康，另一方面，整个鼻腔共生细菌形成相对稳定的生态位，在帮助人体抵御病原体的入侵的同时，通过调节粘膜免疫，增强免疫耐受，避免过敏性疾病的发生。16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区和10个保守区。16S rDNA测序一般通过对一个或多个可变区进行扩增，然后利用高通量测序和序列分析对菌群进行属分类分析。该方法可突破传统微生物不可培养的缺点，快速获得大量菌群信息。
16S rDNA扩增子测序不对细菌全基因组序列进行分析，只对保守区序列分析的技术特点赋予了它成本经济、分析方便、快速属水平分类的优点，近年来，在环境微生物、人体微生物等研究领域受到广泛应用。
由于受目前高通量测序读长所限，很少采用16S rDNA的9个可变区全部测序的策略，一般选择1-3个可变区作为扩增片段。由于菌群的结构复杂，不同的可变区的区域对于菌群的分辨能力不同，利用不同可变区域进行分析时，菌群的覆盖度、结构分析的准确性和稳定性会有差异。例如，研究16S rDNA不同V区对菌群的覆盖度时，发现在门纲目科属五个水平，V4区域都有最好的覆盖度，覆盖度最高的相邻双片段区域为V4-V5区段。研究对16S rDNA基因的差异性对原核生物多样性高估程度时，发现V4-V5区域显示了最低的高估程度(约为3.0％)，而V6区域的高估程度最高(约为13％)。因此在菌群的多样性的研究中，16S rDNA基因的V4-V5区域更适合作为测序的目的片段。但是，目前针对鼻腔菌群16S rDNA测序方案一般选择对较容易扩增的单一V区进行检测，而非选择效果最好的V4V5区段，主要原因是常用的V4V5区段扩增引物与人源18S rDNA序列同源性较高，在针对菌群含量较低，而人源gDNA含量相对较高的鼻腔拭子样本进行扩增时，会出现严重的非特异扩增现象。需要进行技术优化以便提高鼻腔微生物的扩增特异性及富集效率。
此外，目前的16S rDNA测序技术，常采用带有index的扩增引物进行16S rDNA扩增。该方法虽然简单，但是引物长度一般超过60nt，合成成本较高。同时，引物长度较长，扩增效率低。此外，扩增引物序列单一，高通量平行测序时容易因起始碱基不平衡性导致测序质量较差。也有先采用先进行16S rDNA扩增。然后通过连接方式添加测序接头。使得测序文库构建步骤繁琐，不利于大规模样本自动化建库。
发明内容
本发明一个目的是提供一种用于样本菌群检测的成套引物。
本发明提供的成套引物，包括扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物和扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物；所述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物组成。
上述成套引物中，所述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物由序列1所示的引物(FP1)、序列2所示的引物(RP1-1)和序列3所示的引物(RP1-2)组成。
上述成套引物中，所述试剂盒还包括用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物，
所述用于样本区分的上游引物由序列12所示的片段(illumina一个测序接头的另一部分，与上游引物中的测序接头区域形成illumina一个测序接头)、用于样本区分标签序列(index)和序列13所示的片段(与测序接头区段互补的区域)组成；在实施例中具体为FP3*；
所述用于样本区分的上游引物由序列14所示的片段(illumina另一个测序接头的另一部分，与下游引物中的测序接头区域形成illumina另一个测序接头)、用于样本区分另一种标签序列和序列15所示的片段(与另一测序接头区段互补的区域)组成；在实施例中具体为RP3*；
每个样本对应一种用于样本区分的标签序列和另一种标签用于样本区分的标签序列组成的组合。实施例中不同的标签序列由不同的8个碱基组成。
本发明的另一个目的是提供含有上述的成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述含有上述的成套引物的PCR试剂包括含有所述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物的PCR试剂、含有所述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物的PCR试剂和含有用于样本区分的引物的PCR试剂；
所述含有所述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物的PCR试剂中，所述序列1所示的引物、所述序列2所示的引物和所述序列3所示的引物的摩尔比为2:1:1；
所述含有所述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物的PCR试剂中，所述序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物的摩尔比为5:5:3:3:1:1:1:1；
所述含有用于样本区分的引物的PCR试剂中，所述用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物的摩尔比为1:1。
上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在制备检测样本菌群产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在构建样本菌群测序文库中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在制备构建样本菌群测序文库产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物在制备检测样本菌群产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物在构建样本菌群测序文库中的应用也是本发明保护的范围；
或上述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物在制备构建样本菌群测序文库产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种构建样本菌群测序文库的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)提取离体样本的DNA，
2)以所述DNA为模板，用上述的试剂盒中的扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物进行PCR扩增，得到16S rDNA的V1-V9片段；
3)以所述16S rDNA的V1-V9片段为模板，用上述的试剂盒中的扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物进行PCR扩增，得到16S rDNA的V4-V5片段；
4)将所述16S rDNA的V4-V5片段用上述成套引物中的用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物进行扩增(用于Index添加)，得到鼻腔菌群测序文库。
本发明还提供了一种提取离体样本的DNA的方法，包括如下步骤：
1)蛋白酶K裂解离体样本，得到裂解产物；
2)将所述裂解产物95℃孵育5min，弃去拭子，得到热处理裂解后产物；
3)将所述热处理裂解后产物进行氧化锆珠机械裂解，得到机械裂解后产物；
4)将所述机械裂解后产物纯化，实现离体样本的DNA提取。
上述中，样本源于鼻腔、口腔或粪便，可以为鼻腔拭子。
本发明用于扩增16S rDNA的V4-V5区域的引物具有以下特点：
(1)保守性好，覆盖度高。引物特异性序列为增加菌群覆盖度，在引物不同位置引入简并碱基，增加菌群的扩增灵敏度。
(2)在特异性序列之后具有不同长度的linker序列(连接illumina测序引物以及特异性引物之间的N)，同时序列包含illumina测序通用序列，这些linker序列可由2-6个随机碱基(即N)组成。在后续文库制备的过程中，将带有不同长度的linker序列与不带有linker序列的引物混合使用进行目的产物扩增。这样一方面测序开始的随机碱基的引入可以提高起始位置的碱基平衡性，从而提高测序起始信号的质量，另一方面将不同长度的linker序列与不带有linker序列的引物混合使用，使得目的序列与扩增起始位点的距离多样化，从而增加整体碱基平衡性。
总之，本发明具有如下优点：
1)针对鼻腔拭子样本中菌群基因组DNA含量过低的问题，设计扩增效率高、特异性强、人源同源性低的16S rDNA引物，针对16S V1-V9区域进行富集，进一步通过巢式PCR扩增目的片段，降低人源gDNA的干扰；
2)16S rDNA文库由于序列相似度较高，导致碱基平衡性较差影响测序质量，针对此，本发明在引物中通过随机碱基的引入来提高提高16S rDNA菌群测序质量。通过将含有linker序列和不含有linker序列引物组合使用的方式，提高起始测序信号的多样性，从而提高测序质量。
3)针对16S rDNA测序单高变区检测覆盖度低的问题，本发明针对文献报道覆盖度最高的双片段区域——V4V5区段进行检测。
4)针对连接法添加测序接头导致建库繁琐的问题，本发明将扩增引物与illumina测序原件相结合，通过PCR扩增即完成文库构建，简化16S rDNA菌群测序文库构建步骤，建立简单、高效的文库构建反应体系及方法，适合大规模16S rDNA菌群测序。
5)简化16S rDNA菌群测序文库构建步骤，建立简单、高效的文库构建反应体系及方法，适合大规模16S rDNA菌群测序。
总之，本发明先采用扩增效率高、特异性强、人源同源性低的V1-V9引物先对16S rDNA片段进行富集，然后利用巢式PCR扩增出目的区段V4V5双片段，这样克服了直接用V4V5区段扩增引物与人源基因组序列同源性较高，在针对人源gDNA含量较高的鼻腔拭子样本进行扩增时，会出现严重的非特异扩增现象的问题。
附图说明
图1为本发明鼻腔菌群16S rDNA测序文库制备流程图。
图2为实施例1中所制备V4-V5文库电泳图。
图3为实施例1中鼻腔菌群百分比热图。
图4为实施例1中鼻腔菌群分布柱状图。
图5为实施例2中本发明方法与对照方法文库制备流程比较。
图6为实施例2中对照方法所制备V4-V5文库的2100检测结果。
图7为实施例2中本发明方法所制备V4-V5文库的2100检测结果。
图8为实施例3中实验组与对照组所制备文库Q20数据百分比。
图9为实施例3中实验组与对照组所制备文库有效数据百分比。
具体实施方式
以下结合具体的实施案例，对本发明的技术方案及优点进行进一步详细说明。显然，本发明并不仅限于以下实施案例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施例中所用样本均来自健康人，被采集者事先知晓样本用途并同意采集。
下述实施例中所用引物工作液，如无特殊说明，浓度均为10μM。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于鼻腔菌群检测的试剂盒制备及其应用
一、引物的设计及检测试剂盒的制备
1、扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物
根据细菌16S rDNA的V1-V9区域设计如下3条引物：
上游引物FP1：序列表中序列1：5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’(序列1)
下游引物RP1-1：序列表中序列2:5'-TACAGYTACCWTGTTACGACTTNN-3’(序列2)
下游引物RP2-1：序列表中序列3:5'-GGYTACCTTGTDACGACTTNN-3’(序列3)
2、扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物
由于测序产物单一，在进行illumina平台测序时，由于PCR产物的5端为同一序列，导致测序开始信号单一，引起测序质量严重下降。本发明通过在测序接头序列与V4V5特异性扩增序列之间引入linker序列，并通过将含有linker序列和不含有linker序列引物组合使用的方式，提高起始测序信号的多样性，从而提高测序质量。
其中，V4V5特异性扩增序列可设有简并性碱基，linker序列可为2-6个随机碱基(2-6N)，本实施例以2N的为例进行说明，N为ATCG中任一种。
本发明中，
扩增V4-V5区域上游引物由上游引物FP2-1和上游引物FP2-2这2种引物组成：
上游引物FP2-1：序列表中序列4；
5'-CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAGCAGCCGCGGTAAH-3’(其中，斜体为测序接头区域，加粗的为上游特异引物区段)；
上游引物FP2-2：序列表中序列5：
5'-CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNCCAGCAGCTGCGGTAAD-3’(其中，斜体为测序接头区域；下划线为linker序列，由2-6个随机碱基N组成的序列；加粗的为上游特异引物区段)；
扩增V4-V5区域下游引物由下游引物A和下游引物B这2种引物组成：
下游引物RP2-1：序列表中序列6：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTCAATTCVTTTAAGT-3’(其中，斜体为另一测序接头区域，加粗的为下游特异引物区段)；
下游引物RP2-2：序列表中序列7：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNCCGTCAATTCHTTTGAGT-3’(其中，斜体为另一测序接头区域；下划线为linker序列，由2-6个随机碱基N组成的序列；加粗的为下游特异引物区段)；
下游引物RP2-3：序列表中序列8：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTCAATTTCTTTGAGTM-3’
(其中，斜体为另一测序接头区域，加粗的为下游特异引物区段)
下游引物RP2-4：序列表中序列9：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNCCGTCAATTTCTTTGAGTK-3’(其中，斜体为另一测序接头区域；下划线为linker序列，由2-6个随机碱基N组成的序列；加粗的为下游特异引物区段；)；
下游引物RP2-5：序列表中序列10：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTCTATTCCTTTGABT-3’(其中，斜体为另一测序接头区域，加粗的为下游特异引物区段)；
下游引物RP2-6：序列表中序列11：
5'-GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNCCGTCTATTCCTTTGAVT-3’(其中，斜体为另一测序接头区域；下划线为linker序列，由2-6个随机碱基N组成的序列；加粗的为下游特异引物区段)。
3、检测试剂盒
检测试剂盒包括上述扩增细菌16S rDNA的V1-V9区域的引物和上述扩增细菌16S rDNA的V4-V5区域的引物；
检测试剂盒还包括用于样本区分的引物，其由用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物组成；
其中用于样本区分的上游引物(如下面表1所示的FP3*)依次由illumina一个测序接头的另一部分(与上游引物中的测序接头区域形成illumina一个测序接头)、用于样本区分的index序列和与测序接头区段互补的区域；
其中用于样本区分的下游引物(如下面表1所示的RP3*)依次由illumina另一个测序接头的另一部分(与下游引物中的测序接头区域形成illumina另一个测序接头)、用于样本区分的index序列和与另一测序接头区段互补的区域。
二、试剂盒的应用
所用材料为采集自一个健康男性和一个健康女性左右鼻腔的植绒拭子样本，其样本编号分别为(CBNC180015(健康男性左鼻腔)、CBNC180016(健康男性右鼻腔)、CBNC180020(健康女性左鼻腔)、CBNC180021(健康女性右鼻腔)。
1、鼻腔拭子样本采集
(1)取出一支无菌植绒拭子，自下而上插入鼻中道；
(2)逆时针缓缓旋转拭子，持续30sec。
(3)缓慢从鼻腔内抽出拭子，放置在1.5mL离心管中。
(4)折断拭子，扣紧管盖，注明采样信息。
2、鼻腔样本gDNA提取
本实施案例采用改良版的磁珠法口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司DP703-01)进行鼻腔拭子gDNA提取，并针对鼻腔菌群进行条件优化，其优化条件包括：①增加一步95℃热裂解过程，以保证绝大多数细菌的细胞壁得以被破坏；②增加一步氧化锆珠机械裂解，使细胞壁较难被破坏的革兰氏阳性菌的细胞壁也能充分被破坏。具体实验步骤为：
(1)在装有拭子样本的1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液GHA。
(2)在上述离心管中加入10μL Proteinase K,涡旋震荡10sec，65℃孵育30min。
(3)95℃孵育5min，弃去拭子。
(4)加入250μL 0.2mm氧化锆珠(亚速旺，YTZ-0.2)，手持振荡10min。
(5)短暂离心，吸取上清转移到新的2mL离心管中。
(6)加入600μL缓冲液GHC，震荡混匀。弃掉拭子。
(7)加入15μL磁珠悬浮液G，震荡混匀12min(。放置于磁力架上静置30sec，弃去上清。
(8)加入900μL去蛋白液PD，震荡混匀3min，放置于磁力架上静置30sec，去除液体。
(9)重复上述步骤一次。
(10)加入900μL漂洗液PWD，震荡混匀3min，放置于磁力架上静置30sec，去除液体。将离心管放置于磁力架上，室温晾干10～15min。
(11)将离心管从磁力架上取下，加入50μL EB Buffer，震荡混匀，56℃孵育10min。
(12)将离心管放置于磁力架上静置2min，后将溶液转移至收集管中。
(13)在上述溶液中，加入RnaseA(天根生化科技有限公司RT405-02)2μL，混匀后置入37℃恒温金属浴中孵育30min。
(14)采用Qubit 2.0对DNA浓度进行测定，提取的DNA浓度均>20ng/μL。
3、测序文库构建
对上述提取的鼻腔gDNA样本进行16S测序文库构建，其过程如图1包括三步PCR反应，分别为，①16S rDNA V1-V9区富集，其产物片段约1470bp；②16S rDNA V4-V5片段巢式扩增，其产物片段约480bp；③illumina测序接头连接，其产物片段约560bp。
根据上述一设计的引物如表1所示
表1
注：*[index1][index2]为用于样本区分的标签序列(4个样本即有4种标签序列组合)，本实施例中4个样本所用标签序列如下表2：
表2
上述引物FP3和引物RP3也可包含在试剂盒中。
上述3步PCR反应具体如下：
第1步：16S rDNA V1-V9区富集
(1)将DNA模板用Nuclease-free water(Thermo Fisher，AM9930)稀释至4ng/μL，按下表配制第一轮PCR扩增体系：
表3
注：*上述正反向引物mix为FP1、RP1-1和RP1-2的混合物，其摩尔混合比例为2:1:1,混合引物终浓度为10μM。
(2)将上述扩增体系，按照下列表4反应条件进行PCR扩增：
表4
(3)取20μL PCR产物，加入15μL的Agencourt AMPure XP Beads(Beckman，A63881)，按照厂家标准操作流程进行目的片段的纯化与回收。
第2步：16S rDNA V4-V5区富集
(4)取2.5μL步骤(3)中PCR纯化产物，按下表5配制第二轮PCR反应体系：
表5
注：*上述正反向引物mix为FP2-1、FP2-2、RP2-1、RP2-2、RP2-3、RP2-4、RP2-5、RP2-6的混合物，其混摩尔混合比例为5:5:3:3:1:1:1:1，混合引物终浓度为10μM。
(5)将上述扩增体系，按照下列表6反应条件进行PCR扩增：
表6
(6)取20μL PCR产物，加入15μL的Agencourt AMPure XP Beads(Beckman，A63881)，按照厂家标准操作流程进行目的片段的纯化与回收。
第3步：illumina测序接头连接
(7)取2.5μL步骤(6)中PCR产物，按下表7配制第3轮PCR反应体系：
表7
注：*上述正反向引物mix为FP3与RP3的混合物，其混合比例均为1:1，混合引物终浓度为10μM。
(8)将上述扩增体系，按照下列表8反应条件进行PCR扩增，得到测序文库：
表8
(9)取20μL PCR产物，加入15μL的Agencourt AMPure XP Beads(Beckman，A63881)，按照厂家标准操作流程进行目的片段的纯化与回收；得到纯化后的测序文库。
(10)采用Qubit 2.0对DNA文库浓度进行测定，四个样本浓度均>40ng/μL。采用1％琼脂糖凝胶电泳，文库条带单一，大小约500bp左右(图2)。
测序：
(11)取纯化后的文库各20ng进行混合后，采用Illumina miseq测序平台进行PE 300bp测序。
对本实施例16S rDNA测序得到的结果，通过使用QIIME软件进行操作单元分类得到操作分类单元(OTU)根据Greengene database分类OTU的代表序列，得到样本中微生物界、门、纲、目、科、属的分布情况。
根据得到的结果制了图3鼻腔菌属百分比热图和图4鼻腔菌属丰度柱状图。根据图3可以明显观察到不同个体以及同一个体左右鼻腔菌属的差异情况。根据图4可以清晰看到每个各体鼻腔内前20种优势菌属的占比情况，其中，包含已发表综述(Diana M.Proctor and David A.Relma,Cell Host&Microbe,2017；IF＝17.9)中提到的鼻腔内6种常见菌属：葡萄球菌属(g__Staphylococcus)、棒状杆菌属(g__Corynebacterium)、莫拉氏菌属(g__Moraxella)、差异球菌属(g__Alloiococcus)、嗜血杆菌属(g__Haemophilus)链球菌属(g__Streptococcus)。在本实施例检测到的376种菌中，上述6种菌属的平均丰度排名分别为第3位、第1位、第4位、第2位、第16位、第9位，丰度之和均超过50％。
实施例2、巢式扩增与常规扩增文库比较
为验证巢式扩增方法对鼻腔gDNA样本中微生物扩增效率的影响，选取Qubit定量浓度在10-100ng/μL之间的鼻腔gDNA样本9份，各取10ng混匀后，均分为两份用于后续建库。
实验组：将上述2份混匀鼻腔gDNA样本按照实施例1中二的3的测序文库构建方法进行建库，包括3步PCR扩增；
对照组：与实验组不同的是，不进行第1步的V1-V9区域富集PCR扩增，直接进行第2步V4-V5区域富集PCR扩增，具体如下：将上述2份混匀鼻腔gDNA样本按照实施例1中二的3的测序文库构建方法中的三步PCR反应中的第2步和第3步PCR进行建库，不进行第1步PCR扩增(V1-V9的扩增)和纯化(简易流程见图5)。
采用Agilent High Sensitivity DNA Kit(Agilent，5067-4626)，对文库片段大小分布情况进行检测。
对照组和实验组的结果分别见图6和图7，可以看出，实验组(本发明的方法)可以显著减少人源基因组对V4V5文库的干扰。
实施例3、本方案中所用菌群特异性扩增引物组与常规16S rDNA扩增引物组测序质量比较
在进行illumina平台测序时，由于PCR产物的5’端为同一序列，测序产物单一，会导致测序开始信号单一，引起测序质量较低。本发明通过在特异性引物5’端添加不2-6个随机N的方法，增加了测序起始位点的多样性，然后将带有不同长度的linker序列的引物混合，错开测序起始位置，进一步增加整个扩增文库的多样性，从而提高整体测序质量。
本实施案例中，以肠道菌群的样本为例，显示了2种引物组的测试结果。
首先采用不含随机linker序列的引物V4V5_orign组(对照组)扩增了40例肠道菌群样品，并进行测序；之后，采用含随机linker序列的引物V4V5_Mix引物组(实验组)共140个肠道样品进行测序。
本实验所用的特异性引物序列如下表9：
表9
具体实验步骤如下：
1、肠道菌群核酸样品的提取
每份粪便样品取200mg进行核酸提取，核酸提取采用天根生化科技(北京)有限公司的粪便基因组提取试剂盒(DP328)进行，按照参考说明书进行提取，使用Qubit进行核酸定量。
2、测序文库制备流程
(1)按照Qubit定量结果将粪便DNA稀释至4ng/μL备用。按下表10配制反应Mix。
表10
注：*对于实验组而言上述正反向引物mix为FP2-1、FP2-2、RP2-1、RP2-2、RP2-3、RP2-4、RP2-5、RP2-6的混合物，其混摩尔混合比例为5:5:3:3:1:1:1:1，其混合引物终浓度为10μM。对于对照组而言上述正反向引物mix为FP2-1、RP2-1、RP2-3、RP2-5的混合物，其混摩尔混合比例为5:3:1:1，其混合引物终浓度为10μM。
(2)将PCR反应板置于PCR扩增仪中，按表11中的热循环程序进行PCR扩增反应。
表11
注：*括号内表示升/降温速率
(3)取20μL PCR产物，加入15μL的Agencourt AMPure XP Beads(Beckman，A63881)，按照厂家标准操作流程进行目的片段的纯化与回收。
(4)取1μL步骤(3)PCR产物，用无菌水稀释10倍。按照表12配制第二步PCR扩增Mix。
表12
注：*上述正反向引物mix为FP3与RP3的混合物，其混合比例为1:1，混合引物终浓度为10μM。
(5)将PCR管置于PCR扩增仪中，按表13中的热循环程序进行PCR扩增反应。
表13
(6)取20μL PCR产物，加入15μL的Agencourt AMPure XP Beads(Beckman，A63881)，按照厂家标准操作流程进行目的片段的纯化与回收。
(7)采用Qubit 2.0对DNA文库浓度进行测定，180个样本浓度均>10ng/μL。
(8)根据文库Qubit定量每个文库取20ng混合，采用illumina Miseq进行PE 300bp进行测序。
(9)实验结果
V4V5_Mix引物set无论在测序质量Q20(图8)，还是在有效clean_reads率上都比V4V5_orign都有较大的提高(图9)。V4V5_Mix组引物set组平均Q20比率为98％，clean_reads比率为90.26％。而V4V5_orign引物组平均Q20为60.99％，clean_reads率为54.30％。专利方法比普通的方法在Q20比率和clean_reads比率分别提高约30％和40％。
在本发明的实施例3中，对本实施例16S rDNA测序得到的质控结果进行整理，绘制如图8Q20数据比率及clean read比率分布图，可以看出，本发明所采用方法可以显著提高V4V5文库的测序数据质量。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> r= g或a
<222> (7)..(11)
<223> y= t/u或c
<222> (12)
<223> m= a或c
<400> 1
agrgttygat ymtggctcag 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 2
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> y= t/u或c
<222> (11)
<223> w= a或t/u
<222> (23) ..(24)
<223> n= a, c, g, or t
<400> 2
tacagytacc wtgttacgac ttnn 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 3
<220>
<222> (3)
<223> y= t/u或c
<222> (20) ..(21)
<223> n= a, c, g, or t
<400> 3
ggytaccttg tdacgacttn n 21
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> (45)
<223> h= a或c或t/u
<400> 4
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc agcagccgcg gtaah 45
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<222> (47)
<223> d= a或g或t/u
<400> 5
ctttccctac acgacgctct tccgatctnn ccagcagctg cggtaad 47
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> v= a或g 或c
<400> 6
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcc gtcaattcvt ttaagt 46
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<222> (41)
<223> h=a或c或t/u
<400> 人工序列
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctnn ccgtcaattc htttgagt 48
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> m= a或c
<400> 8
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcc gtcaatttct ttgagtm 47
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<222> (49)
<223> k= g或t/u
<400> 9
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctnn ccgtcaattt ctttgagtk 49
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> b= g或c或t/u
<400> 10
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcc gtctattcct ttgabt 46
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<222> (47)
<223> v= a或g 或c
<400> 11
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctnn ccgtctattc ctttgavt 48
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 13
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 15
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
