使用多孔装置进行的多Z平面成像和分配
相关申请的交叉引用
依照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年7月21日提交的美国临时专利申请序列号62/365173的优先权；该申请的公开内容通过引用并入本文。
背景技术
遗传学家正在努力表征如癌症、自身免疫性疾病和神经障碍等复杂疾病的特征，但发现驱动这些疾病的潜在机制一直难以捉摸。体细胞突变，即一生中在细胞中积累的自发变体，是驱动疾病发作和复发的主要因素。随着细胞积累新的突变，它们形成与正常细胞共存的多克隆细胞群。对大量细胞群进行测序可能掩盖这些独特的稀有细胞类型的潜在异质性，这使其难以与正常的种系突变区分开来。揭示这些差异并使克隆结构可视化的最佳方法是对群体中的单独细胞进行测序。
发明内容
提供了用于分配到多孔装置的孔中并从多个Z平面对这些孔进行成像的方法、装置、组合件和系统。本方法和系统的多Z平面成像可以允许检测包含期望数量的细胞的多孔装置的孔。还提供了用于处理通过使用多Z平面成像识别出的多孔装置的含细胞的孔的方法、装置、组合件和系统。
在某些实施方案中，本文提供的系统包括：a)分配和成像组合件，其包括：i)液体分配部件，和ii)能够在多孔装置上方的不同z平面处聚焦并产生图像的图像采集部件；和b)移动部件，其被配置用于移动所述分配和成像组合件。在其他实施方案中，提供了用于对孔进行成像的系统和方法，其包括：i)从多孔装置上方的不同z平面(例如，10个……30个……或更多个)捕获多个图像，ii)确定为产生合成图像所需的不同z平面的最小数量(例如，2个至15个)，所述合成图像提供孔中存在的所有细胞的对焦清晰图像。
在一些实施方案中，本文提供了对多孔芯片的孔进行成像的方法，其包括：a)提供：i)第一多孔装置，其包括含有第一体积水溶液的多个孔，其中多个孔的至少1％……5％……20％……30％……40％……50％……或60％含有仅一个或仅两个细胞(例如，至少35％的孔含有单个细胞)，和ii)能够在不同z平面聚焦并产生图像的图像采集系统，以及iii)任选的第二多孔装置(例如，与第一装置相同的装置，其包括相同的孔几何形状)，其包括含有第一体积水溶液的多个孔，其中多个孔的至少1％……5％……20％……30％……40％……50％……或60％含有仅一个或仅两个细胞；b)使用配置有第一组成像参数的图像采集系统在多孔装置的多个孔的第一部分(例如，100孔装置或5000孔装置的8个孔)上方从不同z平面捕获多个图像(例如，3个……10个……100个……1000个或多于1000个图像)；c)从不同的z平面中确定Zmax平面和Zmin平面，其中Zmax平面是包含至少一个对焦清晰的细胞、距离多孔装置最远的平面，且其中Zmin平面是包含至少一个对焦清晰的细胞、距离多孔装置最近的平面；d)确定为产生合成图像而捕获图像所需的不同z平面的最小数量(例如，2个或3个或4个……10个……15个……或更多个)，所述合成图像提供多个孔的第一部分中存在的所有细胞的对焦清晰图像，其中不同z平面的最小数量包括至少Zmax和Zmin平面；以及e)进行以下步骤的至少一个：i)利用图像采集系统并仅使用最小数量的不同z平面对多孔装置的多个孔中的第二部分(例如，100孔装置的92个孔)进行成像；和/或ii)用配置有第一组成像参数的图像采集系统对第二多孔装置的至少一部分成像，其中仅使用最小数量的不同z平面进行成像。通常，多孔装置的孔越深，需要采用越多的z平面(除Zmax和Zmin之外)来产生图像。
在某些实施方案中，该方法还包括，在步骤e)中由在最小数量的不同z平面处拍摄的图像生成合成图像。在其他实施方案中，该方法包括在步骤e)之后确定第一多孔装置的第二部分中的每个孔中存在的细胞数量，和/或确定第二多孔装置的一部分中的每个孔中存在的细胞数量。在其他实施方案中，最小数量的不同z平面还包括Zmax平面和Zmin平面之间的一个、两个、三个或四个z平面。在另外的实施方案中，最小数量的不同z平面仅包括Zmax平面和Zmin平面。在特定实施方案中，最小数量的不同z平面仅包括Zmax平面、Zmin平面以及Zmax平面与Zmin平面之间的另一个平面(仅一个其他平面)。在某些实施方案中，更深的孔需要除Zmax平面和Zmin平面之外的至少两个以上平面(例如，恰好两个以上平面)。
在一些实施方案中，成像参数包括第一放大倍数(例如，2x、3x、4x……15x……50x……100x……250x……或更大)。在某些实施方案中，成像参数包括第一数值孔径。在其他实施方案中，图像采集系统还包括光源(例如，UV光、激光或用于激发荧光染料的其他光)。在特定的实施方案中，用一种或多于一种荧光染色剂对细胞进行染色。在一些实施方案中，通过使用结合于细胞膜的荧光缀合抗体对细胞进行荧光标记。在特定的实施方案中，荧光染料选自Hoechst染色剂和碘化丙啶。
在某些实施方案中，图像采集系统还包括液体分配部件，其被配置用于将水溶液添加到多个孔中。在其他实施方案中，液体分配部件被配置用于将分配体积的水溶液分配到多个孔的每一个中，其中水溶液包含存在于水溶液中的细胞，所述细胞的浓度为使得分配体积中存在平均X个细胞。在特定实施方案中，X为1、2、3、4、5或多于5。
在一些实施方案中，第一和/或第二多孔装置中的多个孔是至少95个……100个……200个……500个……1000个……3000个……5000个……10000个或多于10000个孔(例如，纳米孔或微米孔)。在某些实施方案中，不提供第二多孔装置。在其他实施方案中，生成分配图，其指示哪些孔仅包含单个细胞(例如，单个活细胞或单个死细胞)，以及哪些孔含有零个或多于一个活细胞或死细胞。在特定实施方案中，水溶液的第一体积为25nl至2μl。在其他实施方案中，每个孔的体积为25nl至2μl。在进一步的实施方案中，每个孔的体积为50nl至500nl。
在一些实施方案中，本文提供了多用途系统，其包括：a)固定多孔装置的部件，其被配置用于将多孔装置固定在固定的位置，其中多孔装置包括多个孔；b)分配和成像组合件，其包括：i)液体分配部件，其被配置用于将液体分配到多孔装置的孔中，和ii)图像采集部件，其能够在多孔装置上方的不同z平面处聚焦并生成图像，其中图像采集部件连接至液体分配部件或与液体分配部件相邻；以及c)移动部件，其被配置成使分配和成像组合件相对于多孔装置移动，使得当多孔装置处于固定位置时，多孔装置中的多个孔的大部分或全部：i)能够从液体分配部件接收液体，且ii)能够通过图像采集部件成像。
在某些实施方案中，液体分配部件被配置用于将分配体积的液体分配到多个孔的每一个中，其中液体包含存在于液体中的细胞，所述细胞的浓度为使得分配体积中存在平均X个细胞。在特定实施方案中，X为0.01、0.02、0.1、0.5、1、2、3、4、5或多于5。在一些实施方案中，该系统还包括多孔装置。在某些实施方案中，第一多孔装置中的多个孔是至少100个孔(例如，100个……500个……1000个……5000个或多于5000个)。在进一步的实施方案中，图像采集部件还包括光源。在特定实施方案中，多个孔中的每一个的体积为25nl至2μl。在其他实施方案中，多个孔中的每一个的体积为50nl至500nl。在进一步的实施方案中，移动部件包括：第一轨道，其用于使分配和成像组合件沿X方向移动；以及第二轨道，其用于使分配和成像组合件沿Y方向移动。在其他实施方案中，该系统还包括计算机部件，该计算机部件包括计算机存储器和计算机处理器，其中计算机存储器上的指令控制：i)移动部件的移动，ii)分配部件的液体分配，以及iii)图像采集部件的图像捕获。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括：a)提供：i)包括多个孔的多孔装置，和ii)固定多孔装置的部件，其被配置用于将多孔装置固定在固定的位置，其中多孔装置包括多个孔，iii)多用途系统，其包括：A)分配和成像组合件，其包括：I)被配置用于将液体分配到多孔装置的孔中的液体分配部件，和II)能够在多孔装置上方的不同z平面处聚焦并产生图像的图像采集部件，其中图像采集部件连接至液体分配部件或与液体分配部件相邻，和B)移动部件，其被配置成使分配和成像组合件相对于多孔装置移动；b)将多孔装置放置在固定部件中使得多孔装置位于固定位置；和c)激活分配和成像组合件使得多孔装置中的多个孔中的大部分或全部：i)从液体分配部件接收含有细胞的液体，使得多个孔的至少1％……5％……20％……30％……50％包含仅一个细胞或仅两个细胞，且ii)通过图像采集部件在多孔装置底部上方的多个z平面处成像，从而产生多个来自不同z平面的图像。
在特定实施方案中，该方法还包括：d)从不同的z平面中确定Zmax平面和Zmin平面，其中Zmax平面是包含至少一个对焦清晰的细胞、距离多孔装置最远的平面，且其中Zmin平面是包含至少一个对焦清晰的细胞、距离多孔装置最近的平面。在某些实施方案中，该方法还包括：e)确定为产生合成图像而捕获图像所需的不同z平面的最小数量(例如，2个至15个)，所述合成图像提供多个孔中存在的所有细胞的对焦清晰图像，其中最小数量的不同z平面包括至少Zmax和Zmin平面。
在某些实施方案中，多孔装置包括至少50个孔(例如，50个……100个……150个……400个……689个……900个……或更多个)。在其他实施方案中，多孔装置包括至少1000个孔(例如，1000个……1500个……2500个……5000个……5184个……10000个……20000……或更多个)。在其他实施方案中，多孔装置包括多孔芯片。
在特定实施方案中，所述方法还包括在步骤中的分配之前和/或之后用第一和/或第二可检测标记来标记至少一些细胞。在某些实施方案中，第一或第二可检测标记对于循环癌细胞和/或肿瘤干细胞是特异性的。在其他实施方案中，第一或第二可检测标记包括抗体或抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，从肿瘤组织中纯化细胞悬浮液中的细胞。在其他实施方案中，分配体积为25nl至500nl或500nl至1μl。在其他实施方案中，细胞的标记在分配之前进行。在其他实施方案中，细胞的标记在分配之后进行。
附图说明
图1A显示了不采用组合式分配和成像组合件的示例性工作流程，而图1B显示了采用组合式分配和成像组合件的类似示例性工作流程。图1B中的工作流程表明，在本方法的一些实施方案中可以避免某些步骤，例如离心和冷冻。
图2显示了示例性组合式分配和成像组合件，其保持在移动部件上，所述移动部件在该实施方案中显示为两个轨道。
图3A显示了扩展焦深算法的示意图，其描绘了如何拍摄然后组合不同深度的多个图像以提供所有细胞对焦清晰的合成图像。图3B显示了芯片中的16个孔的第一图像，其中一些细胞对焦清晰，以及相同的16个孔的第二图像，其对焦平面高200微米(不同的Z平面)以使其他细胞对焦清晰。第三图像是前两个图像的合成图像，其显示了孔中对焦清晰的所有单细胞和双细胞。
图4显示了单个孔的不同z平面图像(平面1、平面2和平面3)，然后是将三个图像组合起来的合成图像(最终图像)。
图5提供了多孔装置的多个孔的多z平面图像。
图6描绘了根据图像处理算法加权的图5的多z平面图像。
图7提供了由图6的加权多z平面图像生成的合成(即，平面)图像。
图8描绘了在多孔芯片离心和不离心的情况下使用各种分配体积的候选孔定量的结果。
图9提供了由图8中所进行的候选孔定量所计算的泊松百分比。
图10描绘了通过在混合物种实验中进行测序比对所确定的相对多重孔比率，其来自不离心的情况下进行孔识别的结果。
图11描绘了通过在混合物种实验中进行测序比对所确定的相对多重孔比率，其来自离心的情况下进行孔识别的结果。
具体实施方式
提供了用于分配到多孔装置的孔中并从多个Z平面对这些孔进行成像的方法、装置、组合件和系统。本方法和系统的多Z平面成像可以允许检测包含期望数量的细胞的多孔装置的孔。还提供了用于处理通过使用多Z平面成像识别的多孔装置的含细胞孔的方法、装置、组合件和系统。
在某些实施方案中，本文提供的系统包括：a)分配和图像组合件，其包括：i)液体分配部件，和ii)能够在多孔装置上方的不同z平面处聚焦并产生图像的图像采集部件，和b)被配置用于移动所述分配和图像组合件的移动部件。在其他实施方案中，提供了用于对孔进行成像的系统和方法，其包括：i)从多孔装置上方的不同z平面(例如，10个……30个……或更多个)处捕获多个图像，ii)确定为产生合成图像所需的不同z平面的最小数量(例如，2个至15个)，该合成图像提供孔中存在的所有细胞的对焦清晰图像。
在某些实施方案中，本文提供了集成系统，例如通过提供具有分配和成像能力的组合件将成像和分配步骤组合起来从而显著简化单细胞工作流程。将分配器和成像系统置于相同的仪器上可以显著减少操作员处理多孔装置(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SMARTCHIPTM多孔装置)的需要。另外，在一些实施方案中，在多孔装置上方采集多个z平面图像具有一些优点。例如，多z平面成像可以允许更精确地检测包含期望数量的细胞的多孔装置的候选孔，或简化样品处理，包括例如去除一个或多于一个处理步骤，包括例如去除离心步骤。
图1中显示了简化过程的实例。图1A显示了不采用组合式分配和成像组合件的示例性工作流程，而图1B显示了采用组合式分配和成像组合件的类似示例性工作流程。图1B中的工作流程表明，在本文所述方法的一些实施方案中可以避免某些步骤，例如离心和冷冻。
示例性工作流程
当使用集成的分配器和成像组合件(例如，具有多Z能力的组合件)时，在示例性实施方案中采用以下工作流程步骤。首先，将荧光染色的细胞预加载到384孔板中。在该示例性实施方案中，可以将八个样品分配到多孔装置(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SMARTCHIPTM多孔装置，其包含5184个孔)中。图2显示了可以分配细胞并对细胞进行成像的示例性集成系统，以及使集成系统在多孔装置上方自动移动的移动部件。图2中描绘的系统包括两个移动部件(“轨道”)和一个集成的成像和分配系统(插入物)，其中分配系统包括多个分配端头。成像部件与分配部件的集成可以使得使用成像系统进行的含候选细胞的孔的检测与使用分配系统进行的将细胞分配到孔中并随后添加处理试剂(如果适用)相协调。
在本公开内容的实施方案开发期间进行的工作中，使用包括K562细胞在内的多个细胞系，并且使用WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的多样品纳米分配器(MSND+)进行50nL量级的体积分配。当在根据这些实施方案的主题多孔系统中分配细胞悬浮液时，细胞溶液的浓度可以被配置成使得平均每个孔仅分配一个细胞。
在本主题实施方案中，在分配之后，使用一种或多于一种波长的光(包括使用一种或多于一种波长的光，所述光对应于存在于细胞中、与细胞一起存在或附着于细胞的特定荧光染料或含荧光团分子的激发波长)和多个Z平面对多孔芯片进行成像。在该示例性工作流程中使用的仪器具有在不同z平面处进行聚焦的能力。在示例性实施方案中，存在三个可用于扫描的滤波器组，并且存在一些实例，其提供了在采用两个滤波器的本公开内容实施方案开发期间进行的工作。在这些情况下，一个滤波器用于识别细胞(例如，基于核染色)，另一个用于评估细胞膜的健康状况(例如，基于不能被活细胞不可渗透的DNA嵌入染料染色)。
接下来，通过集成的分配和成像组合件对细胞进行成像。细胞的成像通常需要放大，这导致了景深dtot的减小。下述等式以数学方式对其进行表示。该等式还表明，高数值孔径使景深dtot减小。然而，通常期望更高的数值孔径，因更高的数值孔径使灵敏度增加。
其中：
dtot：景深，
λ0：波长，
n：折射率，
NA：数值孔径
M：物镜放大倍数
e：成像分辨率
当对可能位于不同Z平面的数千个离散对象或细胞进行成像时，使所有对象精确地成像十分重要。这对于其中仅识别单个细胞的单细胞应用尤为重要。因此，本文提供了用于提高识别在微孔或其他细胞捕获装置中的细胞的能力的方法和系统。在该示例性实施方案中，首先使用成像装置在多个焦点或Z平面处扫描多孔装置(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SMARTCHIPTM多孔装置)或其他细胞捕获装置的孔。然后，通过选择对焦更清晰的每个图像的像素来创建合成图像。这可以使用扩展聚焦算法来完成。一旦获得合成图像，所得到的图像可以由细胞计数软件处理，例如由CELLSELECTTM软件(WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售)处理以准确计数捕获装置(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SMARTCHIPTM多孔装置)中的所有细胞。此程序可用于使用任何成像模式如透射、反射、荧光等获得的图像。
扩展聚焦算法如何运作的实例在图3中示出。图3A显示了示例性扩展焦深算法的示意图，描绘了如何拍摄不同深度的多个图像然后组合起来以提供所有细胞对焦清晰的合成图像。图3B显示了芯片中的16个孔的第一图像，其中一些细胞对焦清晰；以及相同的16个孔的第二图像，其对焦平面高200微米(不同的Z平面)以使其他细胞对焦清晰。第三图像是前两个图像的合成图像，显示了孔中对焦清晰的所有单细胞和双细胞。在图3B中，左侧图像中的一些细胞略微离焦且用较暗的箭头表示，而其他细胞对焦清晰且用较亮的箭头表示。通过将显微镜物镜到样品的距离增加200微米来获得中心处的图像。在这种情况下，一些细胞对焦清晰但其他细胞变得离焦。第三图像显示了扩展景深算法的结果。该新图像是前两个图像的合成图像，并且可以观察到与原始图像相比所有细胞显示出良好的聚焦。
由于已经识别出对焦最清晰的细胞，因此可以使用细胞检测算法如CELLSELECTTM(WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司))来识别具有一个细胞、不具有细胞、具有两个细胞或具有其他数量细胞的孔。在这方面，可以由这样的软件生成分配图以指示哪些孔具有细胞或具有期望数量的细胞，例如单个细胞，以及哪些应该接收用于处理细胞的试剂(例如，用于裂解细胞、扩增核酸、和对核酸进行测序的试剂等)。
上述示例性工作流程的元素不必存在于所有实施方案中。这样，其他实施方案可以包括或排除上述示例性工作流程的一个或多于一个元素，并且可以修改示例性工作流程，例如，包括或替代地提供本文描述的一个或多于一个元素。
多Z平面成像
本文描述的方法、装置、组合件和系统的各方面可以利用多z平面成像。“多z平面成像”是指在与被成像的一个或多于一个对象的多个成像距离处进行的单个场的成像。这样的多个成像距离可以被称为z距离，并且每个z距离可以限定z平面。考虑到大多数显微物镜的浅景深，在不同z平面拍摄的图像通常会包含图像内对象的不同聚焦质量。例如，与物镜距离不同的两个对象的第一图像可以使两个对象中的第一个对象处于对焦清晰状态而两个对象中的第二个对象处于离焦状态。当以不同的z距离拍摄第二图像时，第一对象可能移动至离焦而第二对象可能移动至对焦。
多孔装置和物镜之间的距离可以通过任何方便的过程改变，这些过程包括但不限于例如通过移动物镜逐渐靠近多孔装置、通过移动物镜逐渐远离多孔装置、通过移动多孔装置逐渐靠近物镜、通过移动多孔装置逐渐远离物镜、移动多孔装置和物镜二者等。
与单z平面成像相比，多z平面成像可以增加获取成像场内所有、大多数或许多对象的充分对焦清晰图像的概率。例如，当理论上对象所在的z平面的范围大于成像中使用的物镜的景深时，可能就是这种情况。
在本公开内容实施方案的开发期间进行的工作试图评估多Z平面合成图像方法。“合成图像”通常是指由两个或多于两个图像构成的图像。多Z平面合成图像通常由在捕获多个图像的间隔时进行z距离调整(包括例如其中z距离调整是在捕获构成多Z平面合成图像的图像的间隔时改变的唯一成像参数)而拍摄的相同场的多个图像构成。可以采用各种方法将在多个z平面处捕获的多个图像组合成多Z平面合成图像，包括例如使用下面更详细描述的一个或多于一个图像处理方法描述的那些。
如果假设多Z平面图像或合成图像是细胞数量的最可靠测量，则可以使用该图像来评估利用其他图像获得的结果的准确性。特别地，感兴趣的是将多Z平面图像与用户在手动对样品进行聚焦时获得的单个Z平面图像进行比较。所进行的工作在不同z平面处拍摄了SMARTCHIPTM多孔装置的144个感兴趣区域(AOI)，计算合成图像，使用CELLSELECTTM(WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司))细胞计数软件并获得基于单Z图像获得的结果的灵敏度和特异性。在下表(表1)中，阳性结果被认为是包含单个细胞的孔。如果孔具有多于一个细胞或如果孔不具有细胞，那么该孔的结果被认为是阴性的。
表1
利用该信息，用户可以修改细胞分配以获得更高水平的特异性和灵敏度。可以使用各种算法来生成多Z平面图像，这些算法包括例如可在文献中获得的算法(例如，Microsc Res Tech.2004年9月；65(1-2):33-42.Complex wavelets for extended depth-of-field:a new method for the fusion of multichannel microscopy images.Forster B,Van De Ville D,Berent J,Sage D,Unser M.；Extended depth of field using shapelet-based image analysis.Meneses J,Suarez MA,Braga J,Gharbi T.Appl Opt.2008年1月10日；47(2):169-78；和Model-based 2.5-d deconvolution for extended depth of field in brightfield microscopy,Aguet F,Van De Ville D,Unser M，所有这些文献通过引入整体并入本文)。本文提供了另外的方法和算法，其允许采用识别包含期望数量的细胞的孔所需的最少数量的z平面图像。在许多情况下，这些方法和算法加速并简化了多孔样品处理。
图4提供了使用本文公开的方法和算法的原始图像和合成图像的示例性输出。特别地，图4显示了单个孔的不同z平面图像(“z平面1”、“z平面2”和“z平面3”)，还显示了由三个z平面图像生成的合成图像(“最终”图像)。在主题方法和系统中获得的和/或使用的用来识别候选孔的z平面图像的实际数量将会变化并且可取决于许多因素，包括例如多孔装置内孔中的流体体积、孔的大小、孔的数量等。z平面图像的有用数量可以包括但不限于例如2至10或更多，包括但不限于例如2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、5至10、5至9、5至8、5至7、6至10、6至9、6至8、7至10、7至9、8至10、10、9、8、7、6、5、4、3、2等。
除了在多z平面成像中使用的z平面数量之外，平面之间的z距离将会变化并且可取决于许多因素，包括例如所使用的z平面数量、多孔装置内孔中的流体体积、孔的大小、孔的数量、成像系统的景深等。在一些情况下，z平面之间的z距离可以为小于10μm至1mm或更大，包括但不限于例如10μm至1mm、10μm至900μm、10μm至800μm、10μm至700μm、10μm至600μm、10μm至500μm、10μm至400μm、10μm至300μm、10μm至200μm、10μm至100μm、10μm至50μm、100μm至1mm、100μm至900μm、100μm至800μm、100μm至700μm、100μm至600μm、100μm至500μm、100μm至400μm、100μm至300μm、100μm至200μm等。
可以在本文所述方法、装置、组合件和系统的各个方面中采用多z平面成像。例如，在一些情况下，可以采用多z平面成像来对多孔装置的所有孔进行成像，例如，以允许从多孔装置的所有孔中识别出候选孔(即，包含期望数量的细胞的孔)。多孔装置的孔可以单独成像(即，一次一个孔)，或者可以在单个视场内对多个孔进行成像(即，可以同时对多个孔进行成像)。当对多个孔进行成像时在单个视场中存在的孔的数量将会变化并且可以为2至100或更多，包括但不限于例如2至100、2至90、2至80、2至70、2至60、2至50、2至40、2至30、2至20、2至10、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、10至20等。在一些情况下，多孔装置的孔的批量成像可以表示成用于对装置的所有孔进行成像的成像场的数量，其中这样的数量将会变化并且可以为2到500或更多，包括但不限于例如2至500、2至400、2至300、2至200、2至100、2至50、2至25、2至10、100至500、100至400、100至300、100至200、200至500、200至400、200至300、10至100、10至50等。
在一些情况下，可以采用多z平面成像来确定在多孔装置成像中使用的z平面的数量。例如，可以利用一轮多z平面成像来收集多孔装置的孔的多个z平面图像，以确定足以检测出候选孔并具有期望灵敏度和特异性的z平面采样的程度。在用于识别候选孔的实际多z平面成像之前进行的这种多z平面成像在本文中可称为“先导成像(pilot imaging)”。先导成像可以涉及仅对多孔装置的孔的一部分或样品进行成像。然后可以使用先导成像期间针对装置的孔的一部分获得的多个z平面图像来确定针对多孔板的所有孔或其余孔存在多少个有待成像的z平面。在一些情况下，先导成像期间确定的参数可以应用于多个类似的多孔装置的成像。
与针对装置的所有孔进行的多z平面成像相比，可以以更高或更低水平的z采样进行先导成像。例如，在一些情况下，与随后的成像相比，在先导成像期间可以捕获更多数量的z平面。在一些情况下，与随后的成像相比，在先导成像期间可以捕获更少数量的z平面。在一些情况下，在先导成像期间可以捕获与随后的成像相同数量的z平面。在一些情况下，可以采用先导成像来确定和/或设置将在随后的多z平面成像中使用的z平面的水平。例如，可以采用先导成像来确定在随后的多z平面成像中使用的Zmax和/或Zmin z平面的位置。
在一个实施方案中，在先导成像期间，可以在多个z平面处对一个或多于一个孔进行成像，并且可以分析图像以确定包含对焦清晰细胞的多个z平面中的最低z平面和最高z平面。然后可以将这样的最低和最高z平面设置为Zmin和Zmax以用于随后的成像。在一些情况下，误差幅度可以并入Zmin和Zmax的设置中，包括例如，其中Zmin和Zmax被设置为与包含对焦清晰细胞的多个z平面中的最低z平面和最高z平面具有一定的z距离，包括例如距离上方或下方10μm或更小至100μm或更大等。在一些情况下，误差幅度可以被设置为是包含对焦清晰细胞的多个z平面中的最低z平面和最高z平面之间的总体z距离的某个分数或倍数，包括例如该距离的±10％、该距离的±20％、该距离的±30％、该距离的±40％、该距离的±50％、该距离的±100％、该距离的±200％等。在一些情况下，可以不引入误差幅度并且可以将Zmin和Zmax设置为先导成像期间捕获的图像的检测到的最高对焦清晰细胞和最低对焦清晰细胞的对应z距离。
多孔装置的孔的多z平面成像(即，非先导成像)可以包括或不包括经确定的Zmin平面和Zmax平面中的一个或多于一个。在一些情况下，多z平面成像可以包括Zmin平面和Zmax平面两者，包括其中Zmin平面和Zmax平面之间的额外平面不包括在内的情况。在一些情况下，多z平面成像可以排除Zmin平面和Zmax平面中的一个或两个，包括其中仅使用Zmin平面和Zmax平面之间的额外平面的情况。无论是否使用Zmin平面和Zmax平面，Zmin平面和Zmax平面之间所用的平面数量将会变化，并且可以为1到10或更多，包括但不限于例如1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、5至10、5至9、5至8、5至7、6至10、6至9、6至8、7至10、7至9、8至10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1等。
在主题方法和系统中描述和使用的各种z平面可以相对于彼此来定义和/或基于它们的绝对位置来定义，例如，相对于多孔板(包括例如，相对于多孔板的孔的底部)、相对于成像中使用的物镜等来定义。例如，具有对焦清晰细胞的Zmin平面可以处于多孔板的孔的底部或在其上方Xμm处并且第二z平面可以描述为在Zmin平面上方Yμm处等。
图像处理和采集
可以通过各种图像处理步骤和/或图像处理算法来处理生成的多z平面图像。在一些情况下，可以处理所生成的多z平面图像以识别多孔装置的候选孔。在一些情况下，多z平面图像的图像处理可以包括产生合成图像，从所产生的合成图像中可以识别出候选孔。在一些情况下，所生成的多z平面图像可以例如通过不产生合成图像的一个或多于一个图像处理步骤而用于在而不产生合成图像的情况下识别多孔板的候选孔，例如可以直接从所生成的多z平面图像中识别出候选孔。可以在一组多z平面图像的单独图像、由一组多z平面图像生成的合成图像、或两者中进行各种图像处理步骤。
有用的图像处理步骤可以包括但不限于例如数学图像(即，逐像素(pixel-wise))变换(即，逐像素加法、减法、除法、乘法等)、统计图像变换(例如，中值变换、标准偏差变换等)、平滑算法、模糊变换/滤波、形态膨胀、分割多通道图像的通道、生成一个或多于一个图像掩模(image mask)、空间填充或孔闭合、噪声滤波、分割等。在一些情况下，可以在特定的图像处理步骤中组合两个或多于两个图像，该图像处理步骤包括在数学上组合图像或其图像变换，包括例如求和、取平均、作差等。例如，在一些情况下，可以组合两个或多于两个图像或其变换以生成加权求和图像、加权图像的和、或两者等。在一些情况下，可以使用浮动图像来组合图像。在本方法和系统的背景下，通常“浮动”图像可以指来自多个z平面的像素值可以在无像素强度饱和的情况下与之组合(例如，相加、相减、相乘等)的图像，因此允许动态范围的增加(即，浮动图像的动态范围可以超过添加到浮动图像的各个图像的动态范围)。发现采用浮动图像的各种方法可用于本方法和系统。图像处理步骤可以在整个图像上全局应用，或者可以选择性地应用于图像的一个或多于一个感兴趣区域(ROI)。在一些情况下，主题算法中采用的图像处理步骤可以仅限于全局应用的图像处理步骤。
图像处理步骤通常包括数字图像的处理，所述数字图像可以变化并且可以是二进制格式(例如，黑色和白色)、灰度格式或彩色格式。根据需要，各种格式的图像可以通过合适的图像处理算法进一步在格式之间进行转换。例如，彩色图像可以“分割”成单独的颜色通道以针对每个颜色通道产生单独的灰度图像。例如，红色、绿色和蓝色(RGB)图像可以被分割成单独的红色、绿色和蓝色通道以产生红色通道的灰度图像、绿色通道的灰度图像和蓝色通道的灰度图像。彩色图像可以在颜色空间之间转换并分割成特定颜色空间的任何方便和适当的颜色通道，所述特定颜色空间包括但不限于例如RGB颜色空间、CMYK颜色空间、HSV颜色空间、CIE颜色空间、Lab颜色空间、CIELUV颜色空间、YCbCr颜色空间等。二进制图像和灰度图像可以应用于彩色图像的通道，并且例如，当多个二进制图像或灰度图像应用于彩色图像的多个通道时，彩色图像可以由二进制图像和/或灰度图像构造或“融合”。
发现可以在所描述的方法中使用的其他数字图像处理变换包括但不限于例如点处理变换(例如，负变换、对数变换、反对数变换(inverse log transform)、n次方根变换、n次幂变换、γ校正、对比度变换、窗口中心校正、直方图均衡化等)、滤波(即近邻)变换(例如，均值滤波器、高斯滤波器、中值滤波器、图像梯度滤波器、拉普拉斯滤波器、归一化互相关(NCC)滤波器等)等。
在一些实施方案中，可以为每个z平面图像创建标准偏差图像，其中标准偏差图像的每个像素表示相邻像素例如原始图像中的5×5邻域的分组的标准偏差。在一些情况下，标准偏差图像变换可以类似于自动聚焦变换，不同之处在于单独地针对每个像素计算标准偏差变换。通常，在包含细胞的图像中，在细胞对焦清晰的区域中标准偏差较高而在其他对焦不清晰的地方标准偏差较低。因此，当针对所有z平面取像素的加权平均值时(其中权重为标准偏差)，具有最高标准偏差的平面将被加权最多。
在一些实施方案中，可以进行变换图像的放大，例如以增加z平面图像之间的小差异。例如，在一些实施方案中，可以放大标准偏差变换图像以增加z平面之间的标准偏差的差异。为了放大对焦清晰像素的权重，可以放大所有标准偏差权重，例如将其提高至四次幂。这种放大可能导致z权重的分布中大多数值接近0(即，任何z平面中没有对象)，并且如果在z平面的一部分中存在可见对象，则部分值将远大于0。数据放大可以不限于所描述的，并且同样可以变化。
在一些实施方案中，图像处理算法可以利用所产生的z平面图像，其中通常离焦像素比对焦像素更暗。因此，在一些情况下，所产生的加权图像(例如，标准偏差加权图像)可以乘以原始图像以放大明亮区域的强度，从而更大地增加明亮区域和背景之间的对比度。当将这种放大与标准偏差加权结合使用时，结果可以产生具有几个数量级的动态范围的加权图像。在任何z平面都不是细胞的一部分的背景像素通常具有对于所有平面相同或几乎相同的权重以及所有z平面中背景像素的最终平均值。当采用低浓度细胞分配时，所分析的绝大多数像素将具有背景像素的这些特征。
在一些情况下，图像处理算法可以包括图像平滑操作。在一些情况下，可以采用图像平滑化以防止例如在第一z平面中具有其大部分权重的第一像素与在不同z平面中具有其大部分权重的像素相邻。平滑化可能对以下情况是有益的：图像包含很少的细胞并且预期每个细胞最佳聚焦在一个或至多两个z平面，并且基本上没有真正延伸通过多于两个z平面的对象(即，细胞)。平滑化可以通过各种手段实现，包括例如通过使用一个或多于一个浮动图像。浮动图像可以存储在计算机存储器中并且可以将连续提供的z平面添加到浮动图像，或者以其他方式在数学上与浮动图像组合。可以采用各种浮动图像，包括例如加权求和浮动图像、权重浮动图像的和等。在一些情况下，算法可以包括保存在存储器中的两种浮动图像，包括例如加权求和图像和权重图像的和。当采用浮动图像进行平滑化处理时，可以针对提供给算法的每个z平面更新浮动图像。
可以使用各种图像处理方法生成合成图像，其中合成图像也称为z合成图像或平面图像。在一些情况下，可以采用包括产生浮动图像在内的图像处理算法，并且可以由浮动图像生成合成图像。在一些情况下，可以采用包括产生两种或多于两种浮动图像的图像处理算法，并且可以由浮动图像的组合生成合成图像。例如，在一些情况下，所生成的平面图像的像素可以是z平面像素的加权总和除以该像素的所有权重的和。因此，无论所有权重的实际总和是否从一个像素到下一个像素变化很大，给定像素坐标的相对z权重在整个合成图像上都清晰可辨，并且足以被细胞计数软件检测。
在示例性图像处理算法中，向算法提供多个z平面图像(图5)并且如上所述对这些图像进行加权(图6)。使用浮动图像来组合经加权的图像并且将浮动图像平面化以产生合成图像(图7)。细胞计数软件可以利用这种合成图像来识别具有期望数量的细胞的孔，并且可以生成指示多孔板的哪些孔将被进一步处理的图。
本文描述的方法中所使用的图像将是数字图像，其类型和获取可以变化。本文使用的“数字图像”通常是指二维图像的数字表示(例如，二进制表示)，其可以具有固定的或不固定的分辨率。固定分辨率图像在XY方向上具有固定数量的像素行和像素列。在一些情况下，数字图像可以是在XYZ方向上具有固定数量体素的三维图像。像素和体素以光栅图像或光栅图存储在计算机存储器中，其为以未压缩或压缩形式传输或存储的二维或三维小整数阵列。合适的数字图像文件格式包括但不限于例如BMP、BPG、CD5、DEEP、ECW、Exif、FITS、FLIF、GIF、HDR、HEIF、ILBM、ILBM、IMG、IMG、JPEG 2000、JPEG XR、JPEG/JFIF、分层图像文件格式(Layered Image File Format)、Nrrd、PAM、PBM、PCX、PGF、PGM、PLBM、PNG、PNM、PPM、SGI、SID、Sun Raster、TGA、TIFF、VICAR、WEBP等。
数字图像可以具有各种图像位深，这取决于例如所捕获的图像的特定类型(例如，颜色或灰度)以及数字相机或其他图像捕获装置的灵敏度，并且所述位深可以包括但不限于例如，8位(bit)、10位、12位、14位、16位、18位、24位、30位、36位、48位、64位等。在一些情况下，彩色图像的通道可以单独地是8位灰度图像或可以分割成单独的8位灰度图像。在一些情况下，彩色图像的通道可以单独地是16位灰度图像或可以分割成单独的16位灰度图像。在一些情况下，可以通过将单独捕获的灰度图像分配给单个图像的不同颜色通道从而由组合成单个图像的多个单独捕获的灰度图像生成数字彩色图像。在其他情况下，数字彩色图像的所有颜色是同时捕获的，例如通过使用具有分配至不同颜色的多个光检测器的图像捕获装置和用于将不同颜色的光引导至不同光检测器的一个或多于一个光学器件来进行捕获。
数字图像由数字图像捕获装置捕获。根据上下文，本公开内容的系统的数字图像捕获装置(即，数字成像器)可以获取彩色或单色(例如，灰度)图像。可以使用任何合适的可获取彩色或单色的图像捕获装置来捕获所获取的数字彩色或单色图像。合适的数字彩色或单色图像捕获装置将是独立的图像捕获单元或者可以是集成的图像捕获装置，该集成的图像捕获装置是包括例如集成图像和分配系统等在内的更大的集成系统的一部分。合适的数字彩色或单色图像捕获装置将在很大程度上根据特定的成像环境、图像捕获的目的以及整个装置或系统的相关部件而变化。
在最低限度上，用于所述方法中的合适的彩色或单色图像捕获装置将包括能够捕获数字彩色或单色图像的数字彩色或单色相机以及存储数字彩色或单色图像和/或将图像传送至附加的图像处理电路或传送至附加的存储装置以便后续传送到图像处理电路的装置。合适的数字彩色或单色相机将会变化并且通常包括具有足够高的分辨率和足够的彩色或单色捕获性能以捕获根据本文所述方法处理的图像的任何数字彩色或单色相机。
根据主题方法或系统中使用的特定特征，合适的数码相机可以包括单色或彩色相机，其分辨率为小于约30万像素至约1400万像素或更高，包括但不限于例如30万像素或更高、90万像素或更高、130万像素或更高、140万像素或更高、200万像素或更高、300万像素或更高、330万像素或更高、500万像素或更高、700万像素或更高、1000万像素或更高、1200万像素或更高、1400万像素或更高，等等。
合适的数码相机包括但不限于例如定制的数码相机、消费级数码相机(例如，转换为显微用途的消费级数码相机)和可从各大制造商购得的那些数码显微镜相机，所述制造商包括但不限于例如Dino-Eye、Dino-Lite、Jenoptik ProgRes、KoPa、Leica、Motic、Olympus、Omano、OptixCam、PixelLINK、Zeiss等。
在一些情况下，本系统的数码相机可以连接到被配置用于进行手动、自动或手动自动两用式显微镜检查的显微镜。发现任何合适的显微镜可用于所述系统，只要该显微镜配置有足够的光学器件并提供足够的放大倍数从而允许捕获可根据本文所述方法进行处理的数字图像。因此，本系统的显微镜部件包括例如由各个显微镜部件和市售单元组装而成的定制单元。
合适的显微镜包括但不限于例如可从各大制造商获得的显微镜，所述制造商包括例如Bruker Optics(www(.)brukeroptics(.)com)、Carl Zeiss(www(.)zeiss(.)com)、CRAIC(www(.)microspectra(.)com)、Edmund Optics(www(.)edmundoptics(.)com)、FEI(www(.)fei(.)com)、Hamamatsu(www(.)hamamatsu(.)com)、Hirox-USA(www(.)hirox-usa(.)com)、Hitachi High Technologies(www(.)hitachi-hta(.)com)、JEOL(www(.)jeol(.)com)、Keyence(www(.)keyence(.)com)、Kramer(www(.)kramerscientific(.)com)、Leica Microsystems(www(.)leica(.)com)、Meiji Techno America(www(.)meijitechno(.)com)、Motic Instruments(www(.)motic(.)com)、Nikon Instruments(www(.)nikoninstruments(.)com)、Ocean Optics(www(.)oceanoptics(.)com)、Olympus(www(.)olympusamerica(.)com)、OPTIKA Microscopes(www(.)optikamicroscopes(.)com)、Phenom-World(www(.)phenom-world(.)com)、Prior Scientific(www(.)prior(.)com)、Warner(www(.)warneronline(.)com)等。
本公开内容中采用的成像子系统可以包括固定的或可移动的部件(例如，固定或可移动成像台、固定或可移动物镜等)。可移动部件可以是计算机控制的，其具有与处理器电子通讯的一个或多于一个执行器或马达以用于根据从处理器接收的信号或指令来移动部件。合适的成像系统可以包括具有固定成像台和可移动物镜或物镜转台、固定物镜或物镜转台和可移动成像台等的成像系统。具有固定成像台和可移动成像子系统的集成系统的非限制性实例在图2中示出。
本公开内容的系统可以包括一个或多于一个防隙装置(backlash prevention device)。主题系统的可移动部件可以将振动和/或误差引入成像子系统中，因此，在某些情况下，由于“晃动的”图像而使图像捕获和/或图像处理变得复杂。在某些情况下，这种振动和误差可能是由于系统的驱动移动的部件(例如，驱动成像系统的可移动部件的齿轮)中存在的侧隙(backlash)或“间隙(play)”引起的。因此，系统的一个或多于一个部件可以包括在部件内或与部件连接的防隙器，所述防隙器防止和/或以其他方式使系统中的侧隙最小化。这种防隙器的非限制性实例包括例如与相对的弹簧连接的两个齿轮。齿轮防隙器可以并入本文所述系统的可移动部分的驱动部件中。
本文描述的方法和系统可以包括存储数字信息，数字信息包括数字图像和/或从数字图像提取的数据。这种数字信息可以以任何方便的方式存储，包括但不限于将信息存储在计算机存储器中和/或存储在一个或多于一个计算机可读介质上。例如，处理或未处理的数字图像可以通过有线或无线数据连接从图像捕获装置发送至计算机存储器或计算机处理器，所述计算机存储器或计算机处理器被配置用于将数据写入计算机存储器或其他计算机可读介质。在一些情况下，从一个或多于一个处理或未处理的数字图像提取的数据可以通过有线或无线数据连接从图像捕获装置发送至计算机存储器或计算机处理器，所述计算机存储器或计算机处理器被配置用于将数据写入计算机存储器或其他计算机可读介质。
用于执行本文所述方法的系统可以包括指定的图像处理电路，其具有存储在其上或存储在附加计算机存储器上的指令以用于执行一个或多于一个图像处理功能或算法。图像处理电路可以是或可以具有与附加电路的可操作连接，所述附加电路被配置用于执行一个或多于一个附加功能，包括但不限于例如从图像捕获装置接收数字图像、从存储器检索数字图像、从存储器检索参考值、将经处理的图像存储到存储器、将从经处理的图像获得的值存储到存储器、将结果存储到存储器、执行一个或多于一个细胞计数和/或孔识别功能等。
细胞计数和孔识别
本公开内容的方法、装置、组合件和系统可以包括一个或多于一个细胞计数和/或孔识别步骤。这些步骤可以通过细胞计数软件或细胞计数计算机应用程序来进行，这些细胞计数软件或计算机应用程序可用于各种显微镜和/或从用于图像处理的市售可自由获取的软件包中获得。如本文所用，“细胞计数”通常是指识别多孔装置的一个孔或多个孔中存在的细胞数量的过程。如本文所用，“孔识别”通常是指识别多孔装置的孔是否包含预定的期望数量的细胞。其中孔可以被识别出的期望数量的细胞可以变化并且可以包括例如存在或不存在一个或多于一个细胞、存在一个细胞、存在多于一个细胞(即，多个细胞)、存在特定的多个细胞(例如，存在2个细胞、存在3个细胞、存在4个细胞等)、不存在细胞(即，“空”孔)等。因此，在某些情况下，孔识别可以是二进制的，即孔是否包含期望数量的细胞。
在一些实施方案中，可以使用细胞计数软件对每个孔中的细胞数量进行计数。例如，CELLSELECTTM软件(WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司))可用于对细胞进行计数，并确定哪些孔含有零个、一个、两个或多于两个细胞。在一些情况下，可以对由多个单独的z平面图像产生的生成的合成图像进行细胞计数。在某些实施方案中，软件生成指示多孔装置中满足标准的所有孔，例如选择含有期望数量细胞如单个细胞的孔的表格(例如，过滤器文件)。单个细胞可以基于各种标准进行评估，例如有核(例如，通过Hoechst染色检测)、具有未受损的或完整的膜(例如，通过碘化丙啶检测)、或其他标准和/或其组合。例如，如使用细胞计数软件进行的细胞计数可以用于生成指示哪些孔含有期望数量的细胞且哪些孔将因此被进一步处理的图。指示哪些孔将被进一步处理的图可以包括例如分配图，其指示哪些孔将接收一种或多于一种分配的试剂以用于进一步处理。
在示例性实施方案中，一旦识别出特定的孔(例如，包含期望数量细胞的那些孔，包括例如包含单个细胞的孔)，仪器可以对由过滤器文件确定的孔进行额外的分配，所述过滤器文件即指示多孔装置中满足标准的孔，例如具有期望数量细胞的孔的表格或图。
在该实施方案中，将试剂预加载到384孔板中。通过将成像和分配能力集成到组合件中，多孔装置不需要移动或从系统移除(例如，多孔装置不需要移动或从将其锁定在靠近图像和分配组合件的位置(例如，在成像台上)处的部件上移除)。在一些情况下，多z平面方法可以确保以高精确度对细胞进行计数。例如，在一些情况下，该精确度可能足以使得系统可以在没有离心步骤的情况下运作，而离心步骤将会需要操作者将多孔装置从集成仪器中取出。然而，在某些实施方案中，使用集成系统并不排除多孔装置的离心。例如，在某些情况下，由于各种原因可以在细胞计数之前进行离心，原因包括例如用以增加与未进行离心的类似过程相比的细胞计数准确性。因此，在本文所述的方法中，离心可以是任选的或可以特别排除的。在许多实施方案中，一旦完成细胞计数、孔识别和/或初始流体分配，多孔装置即准备好进行额外的处理，例如热循环、样品提取、外切核酸酶的添加、文库制备、和/或最终测序。
应用
在某些实施方案中，本文提供的方法、系统和组合件与多孔装置中的单细胞分析一起使用。细胞异质性通常是生物组织和细胞的一般特征。遗传学家正在努力表征复杂疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和神经障碍。然而，确定驱动这些疾病的潜在机制仍然难以捉摸。随着细胞积累新的突变，它们可以形成与正常细胞共存的多克隆细胞群。因此，对大量细胞群体进行测序可能掩盖这些独特稀有细胞类型的潜在异质性，这使得在大量细胞群体找出独特的稀有细胞类型如同大海捞针。揭示群体内/细胞间差异的替代方法是评估来自群体的选定单独细胞的核酸序列。已经使用单细胞分析来确定具有不同DNA和RNA表达谱的亚群。总之，普遍认为单细胞分析可以揭示复杂疾病的先前“隐藏”的机制。
单细胞领域的核心要求是清楚且明确地检测仅包含单个细胞的被评估样品。传统的单细胞分离方法包括：FACS仪器、微流体捕获、和有限且广泛分散的细胞稀释方法，这些方法过于昂贵、劳动强度大、需要大量样品输入并且难以扩展到标准分子生物学工作流程内更多细胞的需求。另一方面，细胞的随机沉积可能是不可预测的/随机分布的，这使得细胞分布变得难以预测。
在本公开内容的实施方案中采用的替代方法是将细胞分配到反应孔中，使得对许多这样的分配的平均产生被分配的单个细胞。这种现象的统计描述称为泊松分布。理论上，每孔分配单个细胞(n为正好1个细胞，而不是0个、2个、3个、4个、5个、6个等细胞)受限于θ理论最大值为36.8％的孔将包含正好1个细胞。然而，可以利用泊松分布将输入的细胞浓度改变为非常宽的占用率范围。对每孔期望细胞数量(即1个细胞/孔)进行优化出现折衷。更具体地，优化以获得期望的含有单个细胞的孔的比率(10:1比率，其中λ接近0.185)可导致不令人满意的不具有任何细胞的孔的百分比(>82％)。最近报道了一种尝试特定靶向每孔1个细胞并尝试尺寸分离方法的类似方法。然而，在那种情况下，可能由于所采用的细胞捕获装置中的物理限制，而仅有10％的孔含有单个细胞。无论如何，该方法很复杂且需要专门的试剂。
用于选择单细胞的基于乳液的方法包括将细胞置于油包水乳液中。此类系统具有隔绝交叉污染的优点。然而，难以操作这些经油分离的隔室。此外，这种乳液通常需要涡旋振荡以实现克隆性，这取决于标准的未经筛选的泊松统计。然而，这些方法仅产生小部分占用的隔室和大量未占用的隔室。因此，乳液在微流体系统中产生，这增加了成本并且具有明显的缺点，即一旦形成乳液，就难以以受控的方式在孔中交换其他材料。此外，任选地使用不易推广的条件进行乳液PCR。
没有昂贵和复杂的设备，很难分离单个细胞。而且，此类系统通常不能捕获超过384个单细胞。本文提供了与组合式分配和可视化显微镜、以及细胞可视化显微镜相结合的统计方法，以使微流体芯片(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的那些)中的细胞可视化。在某些实施方案中，使用泊松统计稀释细胞以使每个分配体积平均分配1个细胞。
在某些实施方案中，当孔被识别为已经接收到零个细胞时，可以采用第二(和第三)任选的递归泊松分布(RPD)步骤以规避泊松分布的统计限制，从而将芯片上的单细胞占用率从理论最大值37％提高到>50％。本公开内容中的RPD是指迭代循环以下步骤：(a)将含有细胞的溶液分配到芯片中的反应容器(孔、室等)中，(b)使单独孔中的芯片上细胞可视化，(c)通过软件辅助显微镜检查来识别单独孔中的芯片上细胞计数(等于0、等于1、以及大于1)，和(d)将含有细胞的溶液额外分配循环至在前一循环中特定识别的细胞计数为零的单独孔中。RPD的目的是使包含单细胞(或一些其他期望数量的细胞)的被占用反应容器(孔、室等)的数量最大化以超过单次分配的泊松分布理论限制。本公开内容不对迭代循环的数量加以限制。
在一些实施方案中，本公开内容描述了分离单独细胞并将它们转移到微流体孔的单独孔(例如，由WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SMARTCHIPTM多孔装置的孔)中的方法。例如，在一些实施方案中，首先用常用的可获得的体外活体染料Hoechst 33342对细胞进行染色，当所述染料与DNA结合时发出强烈的蓝色荧光。对细胞进行计数，将细胞稀释至每个分配体积含有1个细胞，添加到源容器(例如384孔板)中并使用自动微液体分配器(例如，由WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的多样品纳米分配器(MSND))将细胞直接分配到深孔芯片中。然后通过自动显微镜检查和图像分析使每个孔可视化，以直接确定每个孔中是否分配有0个、1个、2个、3个或4个细胞。该质量控制步骤既重要又独特，因为它快速且明确地识别芯片中每个孔中的孔内容物。
本公开内容不受所采用的细胞类型的限制。本方法可以包括将一定体积的细胞悬浮液分配到多孔装置的孔中。可以使用含有任何来源的任何细胞的基本上任何细胞悬浮液。感兴趣的细胞可以包括来自任何生物体的细胞(例如细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物细胞、植物细胞、藻类细胞、来自多细胞生物的细胞、来自无脊椎动物(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物的细胞、来自啮齿动物的细胞(例如，小鼠细胞、大鼠细胞等)、来自人的细胞、来自非人灵长类动物的细胞等)。
任何类型的细胞可以是感兴趣的细胞，例如多能祖细胞，干细胞，例如胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、生殖细胞；体细胞(例如，中胚层谱系的体细胞，内胚层谱系的体细胞，外胚层谱系的体细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞、上皮细胞等)，祖细胞(例如，中胚层谱系的祖细胞、内胚层谱系的祖细胞、外胚层谱系的祖细胞)，胚外谱系的细胞；任何阶段(例如1细胞期、2细胞期、4细胞期、8细胞期等)胚胎(例如，线虫胚胎、苍蝇胚胎、非洲爪蟾胚胎、斑马鱼胚胎、小鼠胚胎、大鼠胚胎、非人类灵长类动物胚胎等)的体外或体内胚胎细胞，免疫细胞(例如，原代免疫细胞或祖细胞衍生的免疫细胞，例如淋巴细胞(T细胞(表达CD3的免疫细胞，包括辅助性T细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)和γ-δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)和髓系衍生细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞))等。感兴趣的细胞还是经修饰的细胞，例如遗传修饰细胞，包括但不限于例如遗传修饰干细胞、遗传修饰免疫细胞(例如，工程化免疫细胞，例如用于抗体的产生/筛选、工程化免疫受体(例如，TCR)的产生/筛选、过继免疫疗法(例如，表达免疫细胞的嵌合抗原受体)等的免疫细胞)等。
细胞可以来自已建立的细胞系或者它们可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”、和“原代培养物”在本文中可互换使用，用以指代来自对象并且能够在体外进行有限次的传代培养即分裂的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物是可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但还不足以进入危机阶段的培养物。通常，原代细胞系在体外维持少于10次的传代。在许多情况下，不培养原代细胞，而是可以例如在分离和/或解离后，即在不经历细胞培养的情况下以本公开内容的方法直接利用原代细胞。
可以通过任何方便的方法从个体收获原代细胞。例如，可以通过单采血液成分术(apheresis)、白细胞去除术、密度梯度分离等方法方便地收获白细胞，而通过活组织检查方便地收获来自例如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃等组织的细胞。合适的溶液可用于所收获细胞的分散、解离和/或悬浮。这类溶液可以是具有或没有补充血清(如胎牛血清)或其他天然存在的因子的平衡盐溶液，例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液等，并且配合低浓度的可接受缓冲液(例如，5mM至25mM)使用。方便的缓冲液包括HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。可以立即使用细胞，或者可以将其储存、冷冻一段时间，解冻，并且能够重复使用。在这些情况下，细胞可以在冷冻培养基或本领域常用的一些其它此类溶液中冷冻，以在这样的冷冻温度下保存细胞，并以任何方便的解冻冷冻细胞的方式进行解冻，所述冷冻培养基包含例如10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基。
在一些情况下，感兴趣的细胞可以包括多能祖细胞。如本文所用的术语“多能祖细胞”、“多能干细胞”等是指能够分化成两种或多于两种不同细胞类型并且能够增殖的细胞。多能前体细胞的非限制性实例包括但不限于胚胎干细胞、囊胚衍生的干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞、外胚层衍生的干细胞、内胚层衍生的干细胞、中胚层衍生的干细胞、神经嵴细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、成体干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、骨髓基质干细胞、造血干细胞、淋巴祖细胞、骨髓祖细胞、间充质干细胞、上皮干细胞、脂肪衍生的干细胞、骨骼肌干细胞、肌肉卫星细胞、侧群细胞、肠干细胞、胰腺干细胞、肝脏干细胞、肝细胞干细胞、内皮祖细胞、成血管细胞、性腺干细胞、种系干细胞等。多能祖细胞可以从公共来源或商业来源获得或者可以是新衍生的。
在某些实施方案中，使用癌细胞、循环癌细胞、干细胞和肿瘤干细胞。术语“癌细胞”可以包括原代癌细胞(即，衍生自原代来源，例如癌症或肿瘤活组织检查的癌细胞)以及培养的癌细胞(即癌细胞系，包括例如永生化癌细胞系，例如3T3细胞、A549细胞、F11细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、Jurkat细胞、Vero细胞等)。感兴趣的癌细胞包括从个体的癌症(例如，癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、混合细胞类型的癌症)中分离的原代癌细胞，包括但不限于例如从以下任何癌症中分离的癌细胞：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症(例如卡波西肉瘤、淋巴瘤等)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌(肝外)、膀胱癌、骨癌(例如尤文肉瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤等)、脑干胶质瘤、脑肿瘤(如星形细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤等)、乳腺癌(例如女性乳腺癌、男性乳腺癌、儿童乳腺癌等)、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤(例如儿童期、胃肠道等)、未知原发癌、心脏肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如非典型畸胎样/横纹肌样瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤等)、宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管(如胆管、肝外等)癌、原位导管癌(DCIS)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤等)、骨纤维组织细胞瘤(例如恶性骨肉瘤等)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如颅外、性腺外、卵巢、睾丸等)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增生症(里如朗格汉斯细胞等)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤(例如，胰腺神经内分泌肿瘤等)、卡波西肉瘤、肾癌(例如、肾细胞瘤、肾母细胞瘤、儿童肾脏肿瘤等)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病(例如、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病等)、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、淋巴瘤(例如、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发中枢神经系统(CNS)淋巴瘤等)、巨球蛋白血症(例如、巨球蛋白血症等)、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑素瘤、梅尔克细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、涉及NUT基因的中线癌、口癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、髓性白血病(例如慢性(CML)等)、骨髓性白血病(例如急性(AML)等)、骨髓增生性肿瘤(例如慢性等)、鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌(例如唇癌等)、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如上皮细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤、低恶性潜在肿瘤等)、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头瘤病、副神经节瘤、鼻窦鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞肿瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管癌、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤等)、Sézary综合征、皮肤癌(例如，童年期皮肤癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌、非黑素瘤等)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、颈部鳞状癌(例如原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌等)、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌(例如子宫内膜癌等)、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
大多数癌症死亡似乎是由循环肿瘤细胞在远端器官转移扩散和生长引起的。循环肿瘤细胞(CTC)、CTC簇(两个或多于两个单独的CTC结合在一起)、和肿瘤干细胞(CSC)可以被最初定位、全身潜伏或在辅助治疗后耗尽。因此，在正常非癌细胞的大背景下，CTC和相关干细胞经常以低数量存在。这些细胞的低频率产生复杂的“大海捞针”分析问题，即在强“噪声”背景中检测所需的癌细胞信号。癌细胞特异性细胞表面标志物的检测和这些细胞的分析与理解转移性扩散的生物学密切相关。本文提供的方法和系统允许分离和分析这些重要的癌细胞。
基于抗原/表型细胞表面标志物或细胞内标志物的存在，单细胞、多细胞和细胞簇最初可以从细胞或组织环境或群体中富集或耗尽，所述标志物包括但不限于：蛋白质、脂质、碳水化合物(即糖基化)、这些部分的翻译后修饰、核酸及其修饰、或这些部分的不同组合。可以用本文描述的方法和系统检测单细胞(包括癌细胞)的细胞表面标志物并将这些细胞转移到多孔装置的离散的单独孔中(例如，WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的SmartChipTM的孔)。在其他实施方案中，标记的细胞可以直接分配到孔中并且使用各种可广泛获得的荧光滤波器通过标准或自动显微镜检查直接在芯片中检测抗原部分。
可以采用任何方便的细胞标记和/或检测方法。例如，在一些情况下，细胞标志物(包括细胞内标志物和细胞表面标志物)可以被可检测的特异性结合成员结合。可检测的特异性结合成员可以是直接可检测的(例如，与可检测部分如荧光分子偶联)或可以是间接可检测的(例如，与结合位点(例如，生物素、链霉亲和素、免疫球蛋白结构域、亲和标签等)偶联，所述结合位点被可检测的第二特异性结合成员(例如，荧光二抗)结合)。特异性结合成员还包括核酸，包括但不限于例如与特定靶标(例如蛋白质或核酸靶标)结合或杂交的适配体、寡核苷酸探针(例如，RNA探针、DNA探针、LNA探针等)。特异性结合核酸的成员可以是直接可检测的(例如，与荧光团缀合)或间接可检测的(例如，通过第二特异性结合成员的结合)。
细胞的标记可以在活细胞或固定细胞上进行(例如，通过使特异性结合成员与细胞表面标志物结合)，其中可以采用或不采用透化，这取决于主题标志物在细胞表面还是在细胞内。有用的标记方法包括免疫组织化学、原位杂交等。在一些情况下，细胞可以用表达的可检测分子如表达的荧光蛋白、表达的生物发光蛋白等进行标记。在使用固定和/或透化细胞的情况下，可以采用任何方便的固定和/或透化方法，包括交联固定剂和非交联固定剂，包括但不限于例如甲醛、多聚甲醛、甲醛/丙酮、甲醇/丙酮、乙醇、甲醇、卡诺氏固定液等。可以通过任何方便的方法促进透化，这些方法包括例如一种或多于一种化学或酶促方法，包括例如蛋白酶消化、暴露于温和洗涤剂(例如Triton X-100、NP-40、皂苷等)。在一些情况下，细胞可能是未经固定的。
在一些情况下，细胞可以用一种或多于一种核酸或细胞质染料和/或活性染料进行标记，这些染料包括但不限于例如DNA染料、DNA嵌入染料、活体染料、碘化丙锭、钙黄绿素、Hoechst染料等。用于检测活细胞和/或死细胞的活性染料的限制性实例包括例如碘化丙啶(PI)；7-氨基-放线菌素D(7-AAD)；和可从商业分销商购得的染料，例如可固定活性染料eFluor 455UV/450/506/520/660/780(Affymetrix eBioscience，San Diego，CA)、LIVEDEAD Fixable Blue/Violet/Aqua/Yellow染色试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)、Zombie Aqua/Green/NIR/RED/UV/Violet/Yellow(BioLegend，San Diego，CA)等。核酸染料的非限制性实例包括例如Hoechst 33342(2'-(4-乙氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,1'H-2,5'-二苯并咪唑三盐酸盐)和Hoechst33258(4-[6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1',3'-二氢-1H,2'H-2,5'-二苯并咪唑-2'-亚基]-2,5-环己二烯-1-酮三盐酸盐)和Hoechst系列的其他产品；SYTO 40、SYTO11、SYTO12、SYTO13、SYTO14、SYTO15、SYTO16、SYTO20、SYTO21、SYTO22、SYTO23、SYTO24、SYTO25(绿色)；SYTO17、SYTO59(红色)、DAPI、DRAQ5TM(对双链DNA具有高亲和力的蒽醌染料)、YOYO-1、碘化丙啶、YO-PRO-3、TO-PRO-3、YOYO-3和TOTO-3、SYTOX Green、SYTOX、甲基绿、吖啶同源二聚体、7-氨基放线菌素D、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶等。
作为非限制性实例，富集和可视化循环肿瘤细胞(CTC)的方法是本领域已知的，并且可用于产生(和随后可视化)可以本文所述方法和系统中使用的初始细胞悬浮液。例如，表1的Krebs等人的Nat Rev Clin Oncol.2014年3月；11(3):129-44(通过引用并入本文，具体参考表1)。可用于富集和可视化CTC的标志物的实例包括但不限于：CD45、EpCAM、MUC1和HER2。可以使用针对此类标志物的抗体来标记和可视化这些细胞。可以采用任何类型的合适方法来分离和富集CTC，例如流式细胞术、柱结合等。
在一些情况下，衍生出细胞的样品可以是活检或拭子样品，例如，被收集用来诊断、监测或以其他方式评估对象，例如，诊断对象的细胞缺陷或疾病如癌症的活检或拭子样品。在一些情况下，衍生出细胞的样品可以是先前收集和储存的样品，例如来自待治疗对象的储存的组织样品，包括但不限于例如储存的心脏组织或细胞、储存的肌肉骨骼组织或细胞、储存的生殖组织或细胞、储存的皮肤组织或细胞、储存的骨组织或细胞、储存的骨髓组织或细胞、储存的血管组织或细胞、储存的脐带血组织或细胞等。在某些情况下，衍生出细胞的样品是新鲜的，即先前未经储存或冷冻。
在收集细胞或组织或器官样品或活检或拭子样品后，可以对细胞进行处理。例如，在固体和/或半固体组织(例如，实体瘤、皮肤组织、脑组织、肌肉组织、肝组织、脂肪组织等)的情况下，组织可以解离成单细胞悬浮液。可以使用任何方便的细胞解离方法，包括例如酶促(例如蛋白酶)解离、非酶促(例如化学或物理)解离等。可以对经解离的固体或半固体组织样品的细胞进行进一步处理，包括例如通过分级分离、富集、分选、染色等，或者可以不进行进一步处理。可以对液体细胞样品(例如，血液、羊水等)的细胞进行处理，包括例如通过分级分离、富集、分选、染色等，或者可以不进行处理。可以采用任何方便的技术或装置来辅助这样的处理步骤，这些技术或装置包括但不限于例如密度梯度、离心机、组织培养皿/瓶、过滤器、注射器、血液分离管、FACS等。
无论是否涉及解离和/或一个或多于一个处理步骤(例如，如上所述)，制备的细胞悬浮液可以制备或转移到合适的容器中用于细胞分配。用于细胞分配的合适容器在本文中可称为“源容器”或“源装置”，其可具有一个或多于一个“源隔室”或“源装置孔”。合适的源容器包括但不限于例如管、烧瓶、皿、瓶、槽、多孔装置(例如多孔板，包括例如6孔板、12孔板、24孔板、36孔板、48孔板、96孔板、384孔板和1536孔板等)。在一些情况下，主题源容器可以被配置成使得分配端头可与源容器中存在的细胞悬浮液接触，例如用于从源容器中取出细胞悬浮液。在一些情况下，源容器可以例如通过管或其他液体转移装置连接到分配器，以便于例如通过回填分配端头来填充分配端头。源容器的配置可以变化，并且可以包括其中源容器和分配端头被配置为可兼容的情况。
本公开内容不受所采用的多孔测试装置(例如，板或芯片)的类型的限制。通常，这类装置具有多个孔，这些孔含有液体或者其尺寸适于容纳液体(例如，液体被限制在孔中使得单独的重力不能使液体从孔中流出)。一种示例性芯片是由WAFERGEN(WaferGen Bio-systems股份有限公司)出售的5184孔SMARTCHIPTM多孔装置。其他示例性芯片在美国专利8252581、7833709和7547556中提供，它们全部通过引用而整体并入本文，包括例如其中使用的芯片、孔、热循环条件和相关试剂的教导都并入本文。其他示例性芯片包括在QUANTSTUDIOTM实时PCR系统(由Thermo Fisher Scientific股份有限公司出售)中使用的OPENARRAYTM板。另一种示例性多孔装置是96孔板或384孔板。
多孔装置的整体尺寸可以变化，并且其范围可以是例如，厚度为几微米至几厘米，宽度或长度为几毫米至50厘米。在一些情况下，整个装置的尺寸为约10mm至约200mm的宽度和/或长度和约1mm至约10mm的厚度。在一些实施方案中，芯片的宽度为约40mm，长度为40mm，厚度为3mm。
多孔装置上的孔(例如纳米孔)的总数量可以根据有待使用主题芯片的具体应用而变化。芯片表面上的孔的密度可以根据具体应用而变化。孔的密度以及孔的大小和体积可以根据所需的应用和例如本公开内容的方法所针对的生物体的物种这类因素而变化。
本公开内容不受多孔装置中孔的数量或多孔源装置中孔的数量的限制。可以将大量的孔并入到装置中。在各种实施方案中，装置上孔的总数为约100至约200000、或约5000至约10000。在其他实施方案中，装置包括较小的芯片，每个芯片包括约5000至约20000个孔。例如，方形芯片可以包括125×125个直径为0.1mm的纳米孔。
有用的源装置，即被配置用于容纳用于分配的源流体(例如，细胞悬浮液)的装置将会变化并且可以包括单容器装置以及多孔装置。例如，在一些情况下，主题源装置可以包括被配置用于容纳源液体以转移到分配器中的单个孔、槽、管、瓶、烧瓶、皿、碗等。在一些情况下，主题源装置可以包括被配置用于容纳源液体以转移到分配器中的多个孔或阵列管。源装置可以被特定地配置成与具有一个或多个分配端头的分配器对准。例如，多孔源装置可以包括间隔开的孔，这些孔与多端头分配器的分配器端头之间的间隔相对应，使得多于一个(包括所有)分配器端头可以分别同时插入到多孔源装置的孔中。因此，多孔源装置可以被配置成与多端头分配器的分配端头兼容，包括其中多孔源装置的孔数量与分配器端头的数量相等的情况或者其中孔的数量和分配器端头的数量不相等的情况。
多孔装置中的孔(例如，纳米孔)可以制造成任何适宜的尺寸、形状或体积。孔的长度可以为约100μm至约1mm，宽度可以为约100μm至约1mm，深度可以为约100μm至约1mm。孔的长度、宽度(或直径)和高度可以变化，并且可以为小于50μm至大于5mm，包括但不限于例如50μm至5mm、75μm至5mm、100μm至5mm、200μm至5mm、300μm至5mm、400μm至5mm、500μm至5mm、600μm至5mm、700μm至5mm、800μm至5mm、900μm至5mm、1mm至5mm、2mm至5mm、3mm至5mm、4mm至5mm、50μm至2mm、75μm至2mm、100μm至2mm、200μm至2mm、300μm至2mm、400μm至2mm、500μm至2mm、600μm至2mm、700μm至2mm、800μm至2mm、900μm至2mm、1mm至2mm、50μm至1mm、75μm至1mm、100μm至1mm、200μm至1mm、300μm至1mm、400μm至1mm、500μm至1mm、50μm至500mm、75μm至500mm、100μm至500mm、200μm至500mm、300μm至500mm、400μm至500mm等。在各种实施方案中，每个纳米孔的深宽比(深度与宽度的比率)为约1至约4，包括例如1至4、1至3、1至2、1、2至4、2至3、2、3至4、3和4。在一些实施方案中，每个纳米孔的深宽比为约2。横截面可以是圆形、椭圆形、卵形、圆锥形、矩形、三角形、多边形或任何其他形状。孔的任何给定深度处的横截面也可以在尺寸和形状上变化。
在一些实施方案中，孔的体积为约0.1nl至约1μl。纳米孔的体积可以小于1μl，在一些情况下小于500nl。体积可以小于200nl，或小于100nl。在一些实施方案中，纳米孔的体积为约100nl。在一些实施方案中，纳米孔的体积为约150nl。多孔装置的孔的体积可以变化，并且可以为小于0.1nl至100μl或更大，包括但不限于例如0.1nl至100μl、0.1nl至90μl、0.1nl至80μl、0.1nl至70μl、0.1nl至60μl、0.1nl至50μl、0.1nl至40μl、0.1nl至30μl、0.1nl至20μl、0.1nl至15μl、0.1nl至10μl、0.1n1至5μl、0.1nl至1μl、0.1nl至900μl、0.1nl至800μl、0.1nl至700μl、0.1nl至600μl、0.1nl至500μl、0.1nl至450μl、0.1nl至400μl、0.1nl至350μl、0.1nl至300μl、0.1nl至250μl、0.1nl至200μl、0.1nl至150μl、0.1nl至100μl、0.1nl至50μl等。如果需要，纳米孔可以被制造成增加表面积与体积比，从而促进通过该单元的热传递以减少热循环的斜坡时间(ramp time)。每个孔(例如纳米孔)的腔可以采用各种配置。例如，孔内的腔可以被线性或弯曲的壁分开以形成独立但相邻的隔室，或者被圆形壁分开以形成内环形隔室和外环形隔室。在一些情况下，如果需要，可以用材料涂覆具有高内表面与体积比的孔，以降低孔中包含的反应物可能与孔的内表面相互作用的可能性。如果不希望试剂易于与内表面相互作用或黏附于内表面上，则涂层是特别有用的。根据反应物的性质，可以选择疏水或亲水涂层。在一些情况下，主题方法和系统可以采用具有相对疏水的顶面和/或相对亲水的孔的多孔装置，例如，如PCT申请号US2017/034568中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。各种合适的涂层材料是本领域可获得的。一些材料可以共价黏附到表面，其他材料可以通过非共价相互作用黏附到表面。涂层材料的非限制性实例包括硅烷化试剂，例如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚马来酰亚胺，和硅化试剂例如氧化硅、AQUASILTM和SURFASTM(由Thermo Fisher Scientific股份有限公司出售)。其他合适的涂层材料是阻隔剂例如氨基酸，或聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚腺苷酸和聚马来酰亚胺。某些涂层材料可通过加热、辐照和经化学反应与表面交联。本领域技术人员知道用于涂覆多孔装置的纳米孔的其他合适的手段，或者能够确定这样的手段，而无需过多的实验。
示例性多孔装置(例如芯片)的厚度可以为约0.625mm，其中孔的长度和宽度为约0.25mm(250μm)。纳米孔深度可以为约0.525mm(525μm)，在给定孔的下方为芯片留出约0.1mm。纳米孔开口可以包括任何形状，例如圆形、正方形、矩形或任何其他期望的几何形状。举例来说，纳米孔的直径或宽度可以为约100μm至约1mm，间距或长度为约150μm至约1mm，深度为约10μm至约1mm。每个孔的腔可以采用各种配置。例如，纳米孔内的腔可以被线性或弯曲的壁分开以形成独立但相邻的隔室。
可以使用例如公知的光刻技术形成多孔装置的孔(例如纳米孔)。可以使用湿KOH蚀刻技术、各向异性干蚀刻技术、机械钻孔、注射成型和/或热成型(例如，热压花)来形成纳米孔。
可以将试剂预先分配到多孔装置的孔中或者在将一个或多于一个细胞添加到孔中之后添加试剂，或进行两者。包含在多孔装置内的液体中的试剂(无论是在细胞分配之前、期间还是之后添加)取决于与沉积到每个孔中的单个细胞(或多于一个细胞)进行的反应。在一些实施方案中，孔含有用于进行核酸扩增反应的试剂。试剂可以是用于免疫测定的试剂，核酸制备、分析和检测测定(包括但不限于核酸扩增，例如PCR(包括例如序列特异性PCR、随机引物PCR、qPCR、多重PCR等)、全基因组扩增(WGA)、文库制备、逆转录、cDNA制备、模板转换、Tagmentation、下一代测序(NGS)、文库制备(例如用于NGS)等)的试剂。试剂可以在芯片单元中处于干燥状态或液体状态。
可以添加到和/或已经存在于多孔装置的孔中的试剂的非限制性实例包括但不限于例如寡核苷酸(包括例如引物和探针，包括DNA、RNA和核苷酸类似物寡核苷酸引物和探针，模板转换寡核苷酸等)、含有条码的核酸、含有测序衔接子的核酸、模板核酸(例如DNA模板、RNA模板等)、转座子核酸、酶(例如聚合酶(例如逆转录酶、RNA聚合酶等)、转座酶、核酸酶(例如内切核酸酶(例如，限制性内切核酸酶)、外切酶核酸、Cas9核酸酶等)、连接酶、DNA修复酶(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶、核酸内切酶III、核酸内切酶IV、核酸内切酶V、核酸内切酶VIII等)、甲基转移酶、磷酸酶、硫酸化酶、重组酶、激酶、核酸酶抑制剂(例如RNA酶抑制剂)等)、dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP和/或dUTP)、染料(例如DNA结合染料(例如DAPI、Hoechst、Green等)、活性染料等)、盐、金属辅因子、酶稳定组分(例如DTT)等。
在一些实施方案中，孔含有至少一种下列试剂：探针、聚合酶和dNTP。在其他实施方案中，孔含有包含探针、引物和聚合酶的溶液。在各种实施方案中，每个孔包含(1)所述标准基因组内的多核苷酸靶标的引物，以及(2)与所述引物相关联的探针，如果引物与所述靶标结合，则所述探针发出浓度依赖性信号。在各种实施方案中，每个孔包含基因组内的多核苷酸靶标的引物和与引物相关联的探针，如果引物与靶标结合，则该探针发出浓度依赖性信号。在另一个实施方案中，芯片的至少一个孔含有溶液，该溶液包含正向PCR引物、反向PCR引物和至少一个FAM标记的MGB猝灭的PCR探针。在一些实施方案中，将引物对分配到孔中，然后进行干燥例如通过冷冻进行干燥。然后，用户可以选择性地分配(例如纳米级分配)样品、探针和/或聚合酶。
在本公开内容的其他实施方案中，孔可以包含干燥(例如冻干)形式的任何上述溶液。在该实施方案中，该干燥形式可以涂覆到孔中或者被导入孔的底部。在分析之前，用户可以将水和所捕获细胞的混合物添加到每个孔中。在这些实施方案中，包含干燥的反应混合物的芯片可以用衬里密封，并储存或运输至另一个位置。
在每个孔中具有单个细胞的多孔装置可用于基因型分型、基因表达或通过PCR进行的其他DNA测定。在平板中进行的测定不限于DNA测定，例如TAQMAN、TAQMAN金、SYBR金和SYBR绿，还包括其他测定，例如受体结合、酶、和其他高通量筛选测定。
在一些实施方案中，细胞经受(例如，在裂解和/或其他处理步骤之后)扩增和/或测序分析。进行的一种或多于一种扩增反应可以包括一种或多于一种基于PCR的扩增、基于非PCR的扩增、或其组合。核酸扩增技术的说明性非限制性实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、巢式PCR、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、实时SDA、滚环扩增、环对环扩增转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增之前将RNA逆转录成DNA(例如RT-PCR)，而其他扩增技术直接扩增RNA(例如TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链反应(美国专利申请第4683195号、第4683202号、第4800159号和第4965188号，其各自通过引用整体并入本文)使用变性、引物对与相反链退火和引物延伸的多轮循环，以使目标核酸的拷贝数指数增加。在称为RT-PCR的变型中，使用逆转录酶(RT)从RNA制备互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。对于PCR的其他各种排列，参见例如美国专利第4683195号、第4683202号和第4800159号；Mullis等人,Meth.Enzymol.155:335(1987)；以及Murakawa等人，DNA 7:287(1988)，其各自通过引用整体并入本文。
通常称为TMA的转录介导的扩增(美国专利第5480784号和第5399491号，其各自通过引用整体并入本文)在基本上恒定的温度、离子强度和pH条件下自催化地合成目标核酸序列的多个拷贝，其中目标序列的多个RNA拷贝自催化地产生另外的拷贝。参见，例如美国专利第5399491号和第5824518号，其各自通过引用整体并入本文。在美国专利公开第20060046265号(通过引用整体并入本文)描述的变型中，TMA任选地包括使用阻断部分、终止部分和其他修饰部分以改善TMA过程的灵敏度和精确度。
通常称为LCR的连接酶链反应(Weiss,R.,Science 254:1292(1991)，通过引用整体并入本文)使用与目标核酸的邻近区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物。
通常称为SDA的链置换扩增(Walker,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992)；美国专利第5270184号和第5455166号，其各自通过引用整体并入本文)使用如下循环：引物序列对与目标序列的相反链退火，在dNTPαS的存在下引物延伸以产生双链半硫代磷酸化引物延伸产物，核酸内切酶介导切割半修饰的限制性核酸内切酶识别位点，以及聚合酶介导从切口的3'端开始引物延伸以置换现有链并产生用于下一轮引物退火、切割和链置换的链，从而导致产物的几何形式扩增。嗜热SDA(tSDA)以基本相同的方法在较高温度下使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利第0684315号)。
其他扩增方法包括，例如：基于核酸序列的扩增(美国专利第5130238号，其通过引用整体并入本文)，其通常称为NASBA；使用通常称为Qβ复制酶的RNA复制酶来扩增探针分子本身的扩增方法(Lizardi等人,BioTechnol.6:1197(1988)，其通过引用整体并入本文)；基于转录的扩增方法(Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989))；以及自我持续序列复制(Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874(1990)，其各自通过引用整体并入本文)。关于已知扩增方法的进一步讨论参见Persing,David H.,Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications中的“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques”(Persing等人编),第51页至第87页(American Society for Microbiology,Washington,DC(1993))。
在一些实施方案中，利用核酸测序方法(例如用于检测扩增的核酸)。在一些实施方案中，本文提供的技术可用于第二代测序技术(也称为下一代测序技术)、第三代测序技术(也称为下下一代测序技术)或第四代测序技术(也称为N3-Gen)，包括但不限于焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成序列(SBS)、半导体测序、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时技术、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics,92:255(2008)中提供了一些这样的技术综述，其通过引用整体并入本文。本领域普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中较不稳定并且更容易被核酸酶攻击，因此在测序之前RNA通常被逆转录为DNA。
许多DNA测序技术是合适的，包括基于荧光的测序方法(参见，例如Birren等人，Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.；其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，该技术可用于该领域中所理解的自动测序技术。在一些实施方案中，本技术可用于分段扩增子的平行测序(Kevin McKernan等人的PCT公开号WO2006084132，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，该技术可用于通过平行寡核苷酸延伸进行的DNA测序(参见例如Macevicz等人的美国专利第5750341号和Macevicz等人的美国专利第6306597号，两者通过引用整体并入本文)。使用该技术的测序技术的其他实例包括Church polony技术(Mitra等人,2003,Analytical Biochemistry 320,55-65；Shendure等人,2005Science 309,1728-1732；美国专利第6432360号、美国专利第6485944号、美国专利第6511803号；其通过引用整体并入本文)、454皮克级滴定焦磷酸测序技术(Margulies等人,2005Nature 437,376-380；US 20050130173；其通过引用整体并入本文)、Solexa单碱加成技术(Bennett等人,2005,Pharmacogenomics,6,373-382；美国专利第6787308号；美国专利第6833246号；其通过引用整体并入本文)、Lynx大规模平行特征测序技术(Brenner等人(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；美国专利第5695934号；美国专利第5714330号；其通过引用整体并入本文)、以及Adessi菌落PCR技术(Adessi 等人(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；WO 00018957；其通过引用整体并入本文)。
下一代测序(NGS)方法具有大规模并行、高通量策略的共同特征，与旧的测序方法相比，其目标是降低成本(参见，例如，Voelkerding等人，Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；各自通过引用整体并入本文)。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由Roche商业化的焦磷酸测序作为454技术平台(例如GS 20和GS FLX)、Life Technologies/Ion Torrent、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio和由Applied Biosystems商业化的支持的寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增方法，也称为单分子测序，例如由Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台和由VisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd.和Pacific Biosciences分别商业化的新兴平台。
在焦磷酸测序中(Voelkerding等人，Clinical Chem.，55:641-658,2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.，7:287-296；美国专利第6210891号；美国专利第6258568号，其各自通过引用整体并入本文)，将每个模板DNA片段化、末端修复、连接至衔接子，并通过用携带与衔接子互补的寡核苷酸的珠子捕获单一模板分子进行原位克隆扩增。将携带单一模板类型的每个珠子分隔成油包水微囊泡，并使用称为乳液PCR的技术克隆扩增模板。扩增后乳液被破坏，并且在测序反应期间珠子沉积到用作流动池的皮克级滴定板的各个孔中。在测序酶和发光报告分子如萤光素酶存在的情况下将四种dNTP试剂的每一种有序、迭代地添加到流动池中。如果将合适的dNTP添加到测序引物的3'端，则所产生的ATP导致孔内发光的突发，这使用CCD相机进行记录。有可能实现大于或等于400个碱基的读取长度，并且可以实现106的序列读取，从而产生最多为5亿个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台中(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第6833246号；美国专利第7115400号；美国专利第6969488号；其各自通过引用整体并入本文)，以较短长度读取的形式产生测序数据。在该方法中，对单链片段化DNA进行末端修复以产生5'-磷酸化的平末端，然后进行Klenow介导的单个A碱基向片段3'端的添加。添加A有助于添加T-突出端衔接子头寡核苷酸，其随后用于捕获流动池表面上镶嵌有寡核苷酸锚定物的模板-衔接子分子。锚定物用作PCR引物，但由于模板的长度及其接近其他邻近的锚定寡核苷酸，因此通过PCR延伸导致了分子的“拱形弯曲”，这使得其与相邻的锚定寡核苷酸杂交以形成流动池表面的桥型结构。将这些DNA环变性并切割。然后用可逆染料终止剂对正向链进行测序。并入的核苷酸序列通过检测并入后的荧光来确定，并在下一个dNTP添加循环之前除去每种荧光剂和阻断剂。序列读取长度为36个核苷酸至超过250个核苷酸，同时每次分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术对核酸分子进行测序(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第5912148号；美国专利第6130073号；其各自通过引用整体并入本文)还涉及模板的片段化、与寡核苷酸衔接子连接、与珠子附着、以及通过乳液PCR进行克隆扩增。在此之后，将携带模板的珠子固定在玻璃流动池的衍生化表面上，并且使与衔接子寡核苷酸互补的引物退火。然而，该引物并非用于3'延伸，而是用于提供5'磷酸基团以供连接至含有其后为6个简并碱基的两个探针特异性碱基和四个荧光标记之一的询问探针。在SOLiD系统中，询问探针在每个探针的3'端具有16种可能的两个碱基的组合，并且在5'端具有4种荧光剂中的一种。荧光颜色和每个探针的特性对应于特定的颜色空间编码方案。多轮(通常是7轮)探针退火、连接和荧光检测之后进行变性，然后使用相对于初始引物偏移一个碱基的引物进行第二轮测序。以这种方式，可以在计算上重构模板序列并且询问两次模板碱基，这使得准确性提高。序列读独长度平均为35个核苷酸，并且每次测序运行的总输出超过40亿个碱基。
在某些实施方案中，该技术用于纳米孔测序(参见，例如，Astier等人,J.Am.Chem.Soc.2006年2月8日；128(5):1705-10，其通过引用并入本文)。纳米孔测序背后的理论与导电流体浸入纳米孔并在其上施加电势(电压)时所发生的情况有关。在这些条件下，可以观察到由于离子通过纳米孔的传导而产生的微小电流，并且电流量对纳米孔的尺寸极其敏感。当核酸的每个碱基穿过纳米孔时，这导致通过纳米孔的电流大小产生变化，该变化对于四种碱基的每一种是截然不同的，从而能够测定出DNA分子的序列。
在一些实施方案中，该技术用于HelicS BioSciences的HeliScope(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第7169560号；美国专利第7282337号；美国专利第7482120号；美国专利第7501245号；美国专利第6818395号；美国专利第6911345号；美国专利第7501245号；其各自通过引用整体并入本文)。模板DNA被片段化并在3'端被多聚腺苷酸化，同时最终的腺苷携带荧光标记。将变性的多聚腺苷酸化模板片段连接至流动池表面上的聚(dT)寡核苷酸。通过CCD相机记录所捕获的模板分子的初始物理位置，然后将标记切除并洗掉。通过添加聚合酶和连续添加荧光标记的dNTP试剂来实现测序。并入事件导致了与dNTP相对应的荧光信号，并且在每轮dNTP添加之前由CCD相机捕获信号。序列读取长度为25个至50个核苷酸，并且每次分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
在一些实施方案中，采用Ion Torrent技术。Ion Torrent技术是基于检测DNA聚合过程中释放的氢离子的DNA测序方法(参见，例如，Science 327(5970):1190(2010)；美国专利申请公开第20090026082号、第20090127589号、第20100301398号、第20100197507号、第20100188073号和第20100137143号，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。微孔含有待测序的模板DNA链。在微孔层下面是高度灵敏的ISFET离子传感器。所有层包含在CMOS半导体芯片内，所述CMOS半导体芯片类似于电子工业中所使用的半导体芯片。当dNTP并入正在生长的互补链中时，氢离子被释放，这触发了高度灵敏的离子传感器。如果模板序列中存在均聚物重复，则将在单个循环中并入多个dNTP分子。这导致了相应数量的释放的氢和比例更高的电子信号。该技术与其他测序技术的不同之处在于未使用经修饰的核苷酸或光学器件。对于50个碱基的读取，Ion Torrent测序仪的每个碱基准确度为约99.6％，并且每次运行产生约100Mb至100Gb。读取长度为100个至300个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度为约98％。离子半导体测序的好处在于快速的测序速度和低前期成本及运营成本。
该技术可用于由Stratos Genomics有限公司开发的另一种核酸测序方法，并涉及Xpandomer的使用。该测序过程通常包括提供通过模板指导的合成所产生的子链。子链通常包括在对应于目标核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中偶联的多个亚单位，其中各个亚单位包含系链(tether)、至少一个探针或核碱基残基、以及至少一个可选择性切割的键。可选择性切割的键被切割以产生长度比子链的多个亚单位更长的Xpandomer。Xpandomer通常包括系链和报告元件，以用于在对应于目标核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中解析遗传信息。然后检测Xpandomer的报告元件。关于基于Xpandomer的方法的其他细节描述于例如，2008年6月19日提交的名称为“High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion”的美国专利公开第20090035777号，其整体并入本文。
其他单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成进行实时测序(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641–58,2009；美国专利第7329492号；美国专利申请序列第11/671956号；美国专利申请序列第11/781166号；其各自通过引用整体并入本文)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子对固定的、经引发的DNA模板进行链延伸，从而在核苷酸添加后产生可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
可以将用于任何合适类型测定的试剂添加到多孔芯片的孔中(例如，使用多孔分配器，例如由WAFERGEN(WaferGen Bio-systems有限公司)出售的那些)。可以在细胞(例如，单个细胞)加入孔中之前或之后将这些试剂加入孔中。在某些实施方案中，将蛋白质检测测定组分(例如，基于抗体的测定)加入孔中。在其他实施方案中，将SNP检测测定组分加入孔中。在其他实施方案中，将核酸测序测定组分加入孔中。在某些实施方案中，采用核酸序列测定组分，其使用条码来标记单独的mRNA分子，和/或标记细胞/孔来源(例如，如果在测序分析之前将孔合并)，和/或标记特定的多孔芯片(例如，如果在测序之前将来自两个或多于两个多孔芯片的孔合并)。这种条码化方法和试剂的实例可参见专利公开US2007/0020640、专利公开第2012/0010091号、美国专利第8835358号、美国专利第8481292号、Qiu等人(Plant.Physiol.,133,475-481,2003)、Parameswaran等人(Nucleic Acids Res.2007年10月；35(19):e130)、Craig等人参考文献(Nat.Methods,2008年10月,5(10):887-893)、Bontoux等人(Lab Chip,2008,8:443-450)、Esumi等人(Neuro.Res.,2008,60:439-451)、Hug等人,J.Theor.,Biol.,2003,221:615-624)、Sutcliffe等人(PNAS,97(5):1976-1981；2000)、Hollas和Schuler(Lecture Notes in Computer Science Volume 2812,2003,第55页至第62页)和WO201420127；所有这些文献通过引用整体并入本文，包括与核酸的条码化和测序相关的反应条件和试剂。
在一些实施方案中，使用WO2014201272的条码标记和测序方法(“SCRB-seq”方法)。将SCRB-seq方法(例如，用于小体积所必需的修饰)的必要试剂添加到多孔芯片的孔中(例如，孔中的单个细胞已被裂解)。简而言之，SCRB-seq方法从多孔板中的单个细胞扩增初始mRNA样品(如上所述)，其中每个孔具有单个细胞。初始cDNA合成使用第一引物，其具有：i)用于细胞/孔识别的N6或N11，ii)用于特定分子识别的N10，iii)用于结合mRNA的多聚T片段，和iv)产生将与第二模板转换引物杂交的区域的区域。第二引物是具有多聚G的3'端和具有异碱基的5'端的模板转换引物。cDNA扩增后，合并标记的cDNA单细胞/孔样品。然后用两种不同的引物进行全长cDNA合成，并纯化全长cDNA。接下来，使用i7引物(添加12种i7标签中的一种以识别特定的多孔板)和P5NEXTPT5来制备NEXTERA测序文库，从而为NEXTERA测序添加P5标签(P7标签添加到NEXTERA的另一端)。在凝胶上纯化文库，然后进行NEXTERA测序。作为非限制性实例，采用12种i7平板标签和384个细胞/孔特异性条码嫩够一次完成总共4608个单细胞转录组。该方法允许对单个细胞中的mRNA转录物进行定量，并允许用户计算每个细胞的转录物分子的绝对数量以从标准化中除去任何变量。
在进一步的实施方案中，通过单次或多次添加用于检测和/或分离核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂的组合，动态和/或静态选择芯片内的图像和芯片映射孔用于进一步分析。
计算机相关实施方案
如上所述，主题系统的部件和主题方法中使用的部件，例如，分配器部件及其组件、成像部件及其组件等，可以是计算机控制的(即，自动的)。因此，主题方法和系统可以采用连接到系统的一个或多于一个电子部件或以其他方式与系统的一个或多于一个电子部件通信的处理器，用以控制部件的一个或多于一个行动。
在一些情况下，图像处理电路被具体地配置或编程用于根据本文所述的方法行使功能，包括图像处理功能、合成图像生成功能、多孔装置图生成功能等，并且可以包括至少一个用于行使数据相关功能的数据处理单元。
本文使用的“数据处理单元”是指将行使其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文的任何数据处理单元可以是可编程数字微处理器，例如以电子控制器、主机、服务器或个人计算机(台式或便携式)形式提供的可编程数字微处理器。在数据处理单元是可编程的情况下，合适的程序可以从远程位置传送到数据处理单元，或者预先保存在计算机程序产品(例如便携式或固定的基于磁性装置、光学装置或固态装置的计算机可读存储介质)中。
在一些情况下，如本文所述的系统的部件可以通过有线数据连接进行连接。任何合适且适当的有线数据连接可用于连接所述系统的部件，例如，如本文所述，包括但不限于例如可商够获得的电缆，例如USB电缆、同轴电缆、串行电缆、C2G或Cat2电缆、Cat5/Cat5e/Cat6/Cat6a电缆、令牌环电缆(Cat4)、VGA电缆、HDMI电缆、RCA电缆、光纤电缆等。在一些情况下，可以采用无线数据连接，包括但不限于例如射频连接(例如，PAN/LAN/MAN/WAN无线网络、UHF无线电连接等)、红外数据传输连接、无线光学数据连接等。
如上所述，本公开内容的装置和系统还可以包括“存储器”，其能够存储信息，使得计算机可以在以后访问并检索该信息。任何期望的信息可以存储在这样的存储器上，包括但不限于例如用于执行方法的一个或多于一个步骤的指令等。可以基于用来访问存储信息的装置来选择任何方便的数据存储结构。在某些方面，信息可以存储在“永久存储器”(即，不会因对计算机或处理器的供电终止而被清除的存储器)或“非永久存储器”中。计算机硬盘、CD-ROM、软盘、便携式闪存驱动器和DVD都是永久存储器的实例。随机存取存储器(RAM)是非永久存储器的实例。永久存储器中的文件可以是可编辑和可重写的。
基本上任何电路都可以配置成用于进行本文公开的方法的装置和系统内的功能布局。本领域技术人员公知的是这种电路的硬件架构，包括例如专门配置的计算机，并且该硬件架构可以包括硬件部件，所述硬件部件包括一个或多于一个处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动器)。这种电路还可以包括一个或多于一个图形板，用于处理图形信息并将图形信息输出到显示装置。例如在专用计算机内，上述部件可以通过电路内的总线适当地互连。该电路还可以包括合适的用户界面，用于与例如监测器、键盘、鼠标、网络等的通用外部部件进行通信。在一些实施方案中，该电路能够进行并行处理或者可以是被配置用于进行并行或分布式计算的网络的一部分，以增加本方法和程序的处理能力。在一些实施方案中，从存储介质读出的程序代码可以写入插入电路的扩展板或连接到电路的扩展单元中所提供的存储器中，并且扩展板或扩展单元中所提供的CPU等实际上可以根据编程的指令进行部分或全部操作，以实现所描述的功能。
本公开内容包括计算机可读介质，其包括非暂时性计算机可读介质并且存储本文所述方法或其部分的指令。本公开内容的各方面包括存储指令的计算机可读介质，所述指令在由计算装置执行时，使计算装置执行如本文所述方法的一个或多于一个步骤。
在某些实施方案中，根据本文所述方法的指令可以以“编程”的形式被编码到计算机可读介质上，其中本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和/或数据以供执行和/或处理的任何存储或传输介质。存储介质的实例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光盘、固态硬盘和网络附加存储(NAS)，且与此类装置在计算机内部还是外部无关。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，使得计算机可以在以后访问并检索该信息。
本文描述的计算机实现的方法可以使用编程来执行，所述编程可以以任何数量的计算机编程语言中的一种或多于一种进行编写。这些语言包括例如Java(Sun Microsystems有限公司，Santa Clara，CA)、Visual Basic(微软公司，Redmond，WA)和C++(AT&T公司，Bedminster，NJ)、以及许多的任何其他语言。
以下实施例以说明而非限制的方式提供。
实施例
实施例1：离心、z平面采样和细胞分配体积对候选孔识别的影响
研究了离心对识别的候选孔数量的影响。具体而言，将细胞悬浮液泊松分配到1mm(150nl)和1.6mm(250nl)多孔芯片中并在多孔芯片离心之前和之后进行候选孔识别(即，识别具有期望细胞数量的孔，在这种情况下为“1”)。在离心前和离心后在三个z焦平面(Z1至Z3)处成像，对所得候选孔的数量进行定量。表2和表3分别提供了1mm和1.6mm芯片的定量结果，并且包括使用Olympus显微镜产生的对照候选孔定量结果。
表2：1mm(150nl)常规芯片
表3：1.6mm(250nl)深芯片
还研究了在离心和不离心的情况下，z平面采样对识别的候选孔数量的影响。在离心之前或之后，以不同水平的z平面采样在1mm(150nl)芯片上进行候选孔识别。具体地，使用芯片z轴上的一个焦平面(Z1)、两个焦平面(Z1+Z2)、三个焦平面(Z1+Z2+Z3)、四个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4)或五个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5)进行采样。表4中提供了各种采样水平下候选孔定量的结果。
表4：1mm(150nl)常规芯片
在1.6mm(250nl)深芯片中使用更高水平的采样进一步评估z平面采样对识别的候选孔数量的影响。具体而言，在离心后，以不同水平的z平面采样进行候选孔识别，包括芯片z轴上的一个焦平面(Z1)、两个焦平面(Z1+Z2)、三个焦平面(Z1+Z2+Z3)、四个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4)、五个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5)、六个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5+Z6)或七个焦平面(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5+Z6+Z7)。表5中提供了各种采样水平下候选孔定量的结果。
表5：1.6mm(250nl)深芯片
上述结果表明，在一些情况下，可以采用离心来增强候选孔的识别，即含有期望数量细胞的孔的识别，在以上评估的情况下，孔限于仅含有单个细胞的孔。在一些情况下，与不经离心而进行的类似候选孔识别相比，分配后离心可以重新识别20％至25％的更多候选孔。另外，在一些情况下，当不采用离心时，被识别为含有单个细胞的候选孔的一些孔实际上可能被错误识别并且实际上含有两个细胞。此外，在该实施例中采用的分配体积中，离心有助于去除在细胞分配后引入的气泡。
上述结果还表明，超过一个或两个Z轴焦平面的z平面采样水平改善了候选孔识别。而最高水平的z平面采样使更多的候选孔被识别(例如，Z5和Z7)，随着z平面采样增加，反而被识别的候选孔数量的增加削弱，并且结果显示，在许多情况下较少的z平面采样，例如三个z平面采样可以提供足够的灵敏度和特异性。
为了同时测试离心和细胞分配体积对候选孔识别的影响，在多孔装置离心之前和之后均使用一系列细胞分配体积(30nl、35nl和50nl)在多z系统(“Pong”)上进行候选孔识别。作为参考，还使用MSND+系统以50nl的细胞分配体积进行离心后候选孔识别。图8提供了候选孔定量的结果并且图9提供了在每种测试条件下相应的泊松分布百分比。
这些结果再次证实，在一些情况下，离心可用于增强候选孔的识别。例如，在提供的数据中，离心后候选孔的数量增加了5％至9％。结果还表明，候选孔的数量和泊松百分比随着分配体积的减少而增加。具体而言，在该实施例中，30nl分配体积在候选孔数量和泊松百分比方面表现出最佳性能。
实施例2离心可以减少多重孔的出现
使用混合物种测序实验来评估离心对被识别为含有单个细胞的候选孔中多重孔(即，含有多于一个细胞的孔)出现的影响。具体地，将以相等比例混合的人K-562细胞和小鼠3T3细胞(每50nl 1个细胞)分配到多孔芯片中，在预先离心和没有预先离心的情况下识别含有单个细胞的候选孔，并且对候选孔进行处理以用于RT-PCR并随后测序。将测序读取与小鼠及人类基因组进行比对并且回顾性地将各个孔识别为含有仅与小鼠比对、仅与人比对或与两者比对的读取。含有与小鼠和人比对的读取的孔被确定为含有多重孔。提供了离心前(图10)样品和离心后(图11)样品的测序读取比对数据。离心前情况下的多重孔比率为5.8％，而离心后的多重孔比率更低，为3.5％。这些数据表明，在一些情况下，可以采用离心来减少识别的单细胞候选孔中多重孔的出现。
尽管存在所附的权利要求，但本公开内容还由以下条款限定：
1.一种处理多孔芯片的含细胞的孔的方法，所述方法包括：
a)将一定体积的细胞悬浮液分配到多孔芯片的孔中；
b)对多孔芯片进行成像，以在多个z平面处获取孔的多个图像；
c)基于所获取的多个图像生成多孔芯片的图，所述多孔芯片的图识别出多孔芯片的空孔和含细胞的孔；和
d)仅处理识别出的多孔芯片的含细胞的孔。
2.根据条款1所述的方法，其中生成所述图包括组合所获取的多个图像以产生具有扩展的焦深的合成图像。
3.根据条款1或2所述的方法，其中所述多个图像包括至少三个z平面。
4.根据条款3所述的方法，其中所述多个图像包括三个至七个z平面。
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对多孔芯片的一部分孔进行先导成像，以推导出成像中使用的多个z平面。
6.根据条款5所述的方法，其中所述先导成像包括确定Zmax平面和Zmin平面。
7.根据条款6所述的方法，其中所述多个z平面包括Zmax平面和Zmin平面。
8.根据条款6或7所述的方法，其中所述多个z平面包括Zmax平面和Zmin平面之间的一个至六个z平面。
9.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述成像包括对多个孔同时进行成像。
10.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述多孔芯片的图进一步识别出含细胞的孔包含单个细胞还是多个细胞。
11.根据条款10所述的方法，其中所述方法包括仅处理被识别为含有单个细胞的含细胞的孔。
12.根据条款10或11所述的方法，其中所述多孔芯片的图还识别出每个多重孔中存在的细胞的数量。
13.根据条款12所述的方法，其中所述方法包括处理被识别为含有两个细胞的含多个细胞的孔。
14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在分配之后和成像之前对多孔芯片进行离心。
15.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在分配之后和成像之前对多孔芯片进行离心。
16.根据前述条款中任一项所述的方法，其中细胞悬浮液的体积为30nl至100nl。
17.根据前述条款16所述的方法，其中所述细胞悬浮液的体积为30nl至50nl。
18.根据前述条款中任一项所述的方法，其中多孔芯片中存在的孔数量为100个或多于100个。
19.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述多孔芯片的孔具有250nl或小于250nl的最大体积。
20.根据前述条款中任一项所述的方法，其中在分配之后，多孔芯片的至少1％的孔是空的。
21.根据前述条款中任一项所述的方法，其中在分配之后，多孔芯片的至少1％的孔包含至少一个细胞。
22.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述处理包括将至少一种试剂分配到识别出的含细胞的孔中。
23.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述处理包括在至少一部分识别出的含细胞的孔中进行核酸扩增反应。
24.根据条款23所述的方法，其中所述处理包括对从至少一部分识别出的含细胞的孔中扩增的核酸进行测序。
25.根据前述条款中任一项所述的方法，其中分配和成像由分配和成像系统组合件执行，所述分配和成像系统组合件包括与图像采集部件集成的液体分配部件。
26.一种系统，其包括：
a)分配和成像系统组合件，其包括液体分配部件和图像采集部件；和
b)与分配和成像系统组合件通信的处理器以及存储指令的计算机存储器，当指令由处理器执行时，使得分配和成像系统组合件执行以下步骤：
i)将一定体积的细胞悬浮液分配到多孔芯片的孔中；
ii)对多孔芯片成像，以在多个z平面处获取孔的多个图像；和
iii)基于所获取的多个图像生成多孔芯片的图，该多孔芯片的图识别出多孔芯片的空孔和含细胞的孔。
27.根据条款26所述的系统，其中计算机存储器还包括通过组合所获取的多个图像以产生具有扩展的焦深的合成图像来生成图的指令。
28.根据条款26或27所述的系统，其中计算机存储器还包括用于对多孔芯片的一部分孔进行先导成像以推导出成像中使用的多个z平面的指令。
29.根据条款26至28中任一项所述的系统，其中所述多孔芯片的图还识别出含细胞的孔包含单个细胞还是多个细胞。
30.根据条款29所述的系统，其中所述多孔芯片的图还识别出每个多重孔中存在的细胞的数量。
31.根据条款26至30中任一项所述的系统，其中所述计算机存储器还包括将生成的图存储在计算机存储器中的指令。
32.根据条款26至31中任一项所述的系统，其中所述系统还包括与处理器和计算机存储器通信的用户界面。
33.根据条款32所述的系统，其中所述计算机存储器还包括用以经由用户界面向用户提供所生成的图的指令。
34.根据条款32或33所述的系统，其中所述用户界面允许用户指示系统处理识别出的含细胞的孔或其一部分。
35.根据条款26至34中任一项所述的系统，其中所述计算机存储器还包括指令，当该指令由处理器执行时，使得系统仅进一步处理识别出的多孔芯片的含细胞的孔。
36.根据条款35所述的系统，其中仅进一步处理识别出的多孔芯片的含细胞的孔的指令包括使用液体分配部件将至少一种试剂仅分配到识别出的含细胞的孔中的指令。
37.一种用于对多孔芯片的孔进行成像的方法，其包括：
a)提供：
i)第一多孔装置，其包括含有第一体积水溶液的多个孔，其中所述多个孔的至少1％含有仅一个或两个细胞，和
ii)能够在不同z平面聚焦并生成图像的图像采集系统，和
iii)任选的第二多孔装置，其包括含有所述第一体积水溶液的多个孔，其中所述多个孔的至少1％含有仅一个或仅两个细胞；
b)使用配置有第一组成像参数的所述图像采集系统，从所述多孔装置的所述多个孔的第一部分上方的不同z平面捕获多个图像；
c)从所述不同z平面确定Zmax平面和Zmin平面，其中所述Zmax平面是包含至少一个聚焦清晰的细胞、距离所述多孔装置最远的平面，且其中所述Zmin平面是包含至少一个聚焦清晰的细胞、距离所述多孔装置最近的平面；
d)确定为产生合成图像而捕获图像所需的所述不同z平面的最小数量，所述合成图像提供所述多个孔的所述第一部分中存在的所有细胞的聚焦清晰图像，其中所述最小数量的所述不同z平面包括至少所述Zmax平面和所述Zmin平面；和
e)至少进行以下步骤中的至少一个：
i)利用所述图像采集系统，仅使用所述最小数量的不同z平面对所述多孔装置的所述多个孔的第二部分进行成像；和/或
ii)利用配置有所述第一组成像参数的图像采集系统对所述第二多孔装置的至少一部分成像，其中所述成像仅使用所述最小数量的不同z平面。
38.根据条款37所述的方法，其还包括在步骤e)中，由在所述最小数量的不同z平面处拍摄的图像生成合成图像。
39.根据条款37或38所述的方法，其还包括在步骤e)之后，确定所述第一多孔装置的所述第二部分中的每个所述孔中存在的细胞数量，和/或确定所述第二多孔装置的所述部分中的每个所述孔中存在的细胞数量。
40.根据条款37至39中任一项所述的方法，其中所述最小数量的不同z平面还包括在所述Zmax平面和Zmin平面之间的一个、两个、三个、或四个z平面。
41.根据条款37至39中任一项所述的方法，其中所述最小数量的不同z平面仅包括所述Zmax平面和所述Zmin平面。
42.根据条款37至39中任一项所述的方法，其中所述最小数量的不同z平面仅包括所述Zmax平面、所述Zmin平面、以及所述Zmax平面和Zmin平面之间的另一个平面。
43.根据条款37至42中任一项所述的方法，其中所述成像参数包括第一放大倍数。
44.根据条款37至43中任一项所述的方法，其中所述成像参数包括第一数值孔径。
45.根据条款37至44中任一项所述的方法，其中所述图像采集系统还包括光源。
46.根据条款37至45中任一项所述的方法，其中所述细胞用一种或多于一种荧光染料进行染色。
47.根据条款46所述的方法，其中所述荧光染料选自Hoechst染色剂和碘化丙啶。
48.根据条款37至47中任一项所述的方法，其中所述图像采集系统还包括液体分配部件，所述液体分配部件被配置用于将水溶液添加到所述多个孔中。
49.根据条款48所述的方法，其中所述液体分配部件被配置用于将分配体积的所述水溶液分配到所述多个孔的每个孔中，其中所述水溶液包含存在于所述水溶液中的细胞，所述细胞的浓度为使得所述分配体积中存在平均X个细胞。
50.根据条款49所述的方法，其中X为0.02或1。
51.根据条款37至50中任一项所述的方法，其中所述第一多孔装置和/或第二多孔装置中的所述多个孔是至少100个孔。
52.根据条款37至51中任一项所述的方法，其中不提供所述第二多孔装置。
53.根据条款37至52中任一项所述的方法，其中生成分配图，所述分配图指示哪些孔仅包含单个细胞，以及哪些孔含有零个或多于一个细胞。
54.根据条款37至53中任一项所述的方法，其中水溶液的第一体积为25nl至2μl。
55.根据条款37至54中任一项所述的方法，其中每个所述孔的体积为25nl至2μl。
56.根据条款55所述的方法，其中每个所述孔的体积为50nl至500nl。
57.一种多用途系统，其包括：
a)固定多孔装置的部件，其被配置用于将多孔装置固定在固定的位置，其中所述多孔装置包括多个孔；
b)分配和成像系统组合件，其包括：
i)液体分配部件，其被配置用于将液体分配到多孔装置的孔中，和
ii)图像采集部件，其能够在所述多孔装置上方的不同z平面处聚焦并生成图像，
其中所述图像采集部件连接至所述液体分配部件或与所述液体分配部件相邻，和
c)移动部件，其被配置为使所述分配和成像组合件相对于所述多孔装置移动，当所述多孔装置处于所述固定位置时，所述多孔装置中的所述多个孔中的大部分或全部：
i)能够从所述液体分配部件接收液体，和
ii)能够由所述图像采集部件成像。
58.根据条款57所述的系统，其中所述液体分配部件被配置用于将分配体积的液体分配到所述多个孔的每个孔中，其中所述液体包含存在于所述液体中的细胞，所述细胞的浓度为使得所述分配体积中存在平均X个细胞。
59.根据条款58所述的方法，其中X为0.02至1。
60.根据条款57至59中任一项所述的系统，其还包括所述多孔装置，并且其中所述第一多孔装置中的所述多个孔是至少100个孔。
61.根据条款57至60中任一项所述的系统，其中所述图像采集部件还包括光源。
62.根据条款57至61中任一项所述的系统，其中所述多个孔的每一个的体积为25nl至2μl。
63.根据条款62所述的系统，其中所述多个孔的每一个的体积为50nl至500nl。
64.根据条款57至63中任一项所述的系统，其中所述移动部件包括：第一轨道，其用于沿X方向移动所述分配和成像组合件；以及第二轨道，其用于沿Y方向移动所述分配和成像组合件。
65.根据条款57至64中任一项所述的系统，其还包括计算机存储器和计算机处理器，其中所述计算机存储器上的指令控制：i)所述移动部件的移动，ii)分配部件的液体分配，以及iii)图像采集部件的图像捕获。
66.根据条款57至65中任一项所述的系统，其中所述多个孔包括至少1000个孔。
67.一种方法，其包括：
a)提供：
i)多孔装置，其包括多个孔，和
ii)固定多孔装置的部件，其被配置用于将多孔装置固定在固定的位置，其中所述多孔装置包括多个孔，
iii)多用途系统，其包括：
A)分配和成像组合件，其包括：I)被配置用于将液体分配到多孔装置的孔中的液体分配部件，和II)能够在所述多孔装置上方的不同z平面处聚焦并生成图像的图像采集部件，其中所述图像采集部件连接至所述液体分配部件或与所述液体分配组分相邻，和
B)移动部件，其被配置为使所述分配和成像组合件相对于所述多孔装置移动；
b)将所述多孔装置放置在所述固定部件中，使得所述多孔装置位于所述固定位置；和
c)激活所述分配和成像组合件，使得所述多孔装置中的所述多个孔中的大部分或全部：
i)从所述液体分配部件接收含细胞的液体，使得所述多个孔的至少1％仅包含一个或两个细胞，和
ii)由所述图像采集部件在所述多孔装置上方的多个z平面处成像，从而产生来自不同的z平面的多个图像。
68.根据条款67所述的方法，其还包括：d)从所述不同的z平面确定Zmax平面和Zmin平面，其中所述Zmax平面是包含至少一个聚焦清晰的细胞、距离所述多孔装置最远的平面，且其中所述Zmin平面是包含至少一个聚焦清晰的细胞、距离所述多孔装置最近的平面；
69.根据条款68所述的方法，其还包括：e)确定为产生合成图像而捕获图像所需的所述不同z平面的最小数量，所述合成图像提供所述多个孔中存在的所有细胞的聚焦清晰图像，其中所述最小数量的所述不同z平面包括至少所述Zmax平面和所述Zmin平面。
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