一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法。
背景技术
第二代测序技术(NGS)已经越来越多地应用于人类T细胞受体(TCR，T cell receptor)免疫组库的研究。不过，在利用传统方法生成TCR NGS测序文库时，或者只包含TCR可变区的一部分，或者需要用到复杂的多重PCR，会偏好性地扩增某个区域。因此如何完整并且无偏好地捕获并扩增TCR转录本中完整的V(D)J可变区，对免疫组库的研究具有重大意义。
Takara旗下Clontech的HumanTCR a/b Profiling试剂盒利用SMART技术和类似5’RACE的策略，可以捕获和无偏好扩增TCR-α和TCR-β转录本中完整的V(D)J可变区。大致步骤如下：1、获得总RNA或纯化的T细胞；2、利用TCR dT Primer和v4 Oligonucleotide进行First-strand cDNA合成；3、PCR1扩增TCR-α和TCR-β整个可变区和绝大部分恒定区cDNA序列；4、PCR2利用半巢式引物扩增整个可变区和部分恒定区并加接头；5、纯化分选然而。该技术利用dT Primer进行RT，只能与具有Poly A尾的RNA进行RT，对低丰度的转录本有局限性，同时没有单分子标签纠错措施，故该方法有待优化。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，在已有TCR免疫组库建库方法的基础上，利用单分子标签技术，目的是最大程度消除扩增或测序过程中产生的碱基错误，从而还原原始样本中分子数目以及表达丰度；同时本发明使用特异性引物扩增RNA样本中TCR-α和TCR-β基因全长，能够全面分析这两个基因的重排和表达信息。
本发明的单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，按照以下步骤进行：
(1)提取样本总RNA；
(2)以总RNA为原料合成First-strand cDNA，同时进行模板转换；
(3)在步骤(2)后加入PCR1反应体系，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域；
(4)在步骤(3)后进行产物纯化；
(5)在步骤(4)后加入PCR2反应体系，进行接头连接反应和扩增；
(6)在步骤(5)扩增产物后加入磁珠进行产物分选纯化，纯化后的产物即为TCR免疫组库文库。
其中，所述的样本是人源血液、组织或细胞。
所述的合成First-strand cDNA是利用TCRαand/orβ特异性RT引物进行合成。
所述的模板转换是利用带单分子标签的TS-3G引物进行模板转换，其中单分子标签是1-20个的兼并碱基，兼并碱基是原始碱基或修饰碱基，所述的修饰包括硫代、甲基化、LNA和次黄嘌呤。
所述的合成和模板转换反应条件是25-50℃，反应时间是30-90min。
所述的PCR1反应体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs，特异性PCR引物和P5接头引物；其中特异性PCR引物为TCRαand/orβ特异性半巢式PCR引物，引物是原始碱基组成或者由修饰碱基组成，所述的修饰包括硫代、甲基化、LNA和次黄嘌呤；所述的P5接头引物3’端部分碱基与带单分子标签的TS-3G引物模板转换后的接头互补，5’端包含P5结合序列和Read 1测序序列。
所述的PCR2反应体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs，P7接头引物和P5接头引物；其中P7接头引物包含P7结合序列，Index序列i7和Read2阅读序列；所述的P5接头引物与步骤(3)的PCR1反应体系中接头引物相同，或者为包含P5结合序列，Index序列i5和Read 1测序序列的接头。
所述的TCR免疫组库文库大小为500-1000bp。
所述的TCR免疫组库文库用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
(1)本发明提供了一种TCR免疫组库文库构建方法，利用SMART技术和特异性引物，能够特异性捕获并无偏好扩增人源RNA中低丰度TCR-α和TCR-β转录本的整个V(D)J可变区域(可以单独捕获扩增TCR-α或TCR-β，也可以同时捕获扩增TCR-α和TCR-β)。
(2)本发明建库过程中，控制反应各试剂组分的用量以及反应温度和时间，并采取一种简单高效的方式对其进行高通量测序文库的构建，所带的单分子标签能够纠错，可以使数据分析更加准确，从而进行TCRαand/orβ免疫组库分析。
(3)本发明采用2轮PCR扩增，更准确，更简便。
(4)本发明提供的建库方法，可以用于不同的测序平台，适用性广，易于推广。
附图说明
图1是本发明的构建单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的原理图；
图2是本发明的建立单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的流程图；
图3是2％琼脂糖凝胶电泳检测文库图；
其中：M:100bp DNAladder(宝生物工程(大连)有限公司)；1:TCRα/β免疫组库文库。
具体实施方式
现以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
本实施例的构建单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的方法，首先进行引物设计：
TCRα/β特异性RT引物序列为：
TCRα(TAC-RT1)：5'-GTCTAGCACAGTTTTGTC-3’
TCRβ(TBC-RT1)：5'-GTATCTGGAGTCATTGA-3；
带单分子标签的TS-3G引物序列为：
TS-3G：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNX-3'；
TCRα/β特异性PCR引物序列为：
TCRα(TAC-RT2)：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCACTGGATTTAGAGTC-3’；
TCRβ(TBC-RT2)：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTTCTGATGGCTCAAAC AC-3’；
P5接头引物(TS-Primer1)序列为：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3'；
P7接头引物(TS-Index)序列为：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Index-I7]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3'。
具体采用人总RNA进行TCR-α和TCR-β免疫组库文库构建按照以下步骤进行：
(1)提取样本总RNA；
按照血液/组织/细胞总RNA提取试剂盒提取步骤进行总RNA的提取；
然后进行RT预处理：
按表1配制反应体系，混匀，置PCR仪上72℃处理3min，反应后立即置冰上；
表1RNA预处理体系
(2)以总RNA为原料合成First-strand cDNA，同时进行模板转换；
将步骤(1)预处理的9μl反应物按表2加入RT反应试剂进行First-strand cDNA合成和模板转换；
表2First-strand cDNA合成和模板转换体系
混匀瞬离后，PCR仪上25-50℃反应30-90min；
(3)在步骤(2)后加入PCR1反应体系，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域；按表3配制PCR1反应体系：
表3PCR1反应体系
按照下表，执行PCR扩增程序：
(4)在步骤(3)后进行产物纯化；
PCR结束后使用AMPure XP beads纯化，用24μL NF-水进行洗脱；
(5)在步骤(4)后加入PCR2反应体系，进行接头连接反应和扩增；
按表4配制PCR2反应体系：
表4PCR2反应体系
按照下表，执行PCR扩增程序：
(6)PCR2结束后使用AMPure XP beads片段大小分选纯化，用27μL NF-水进行洗脱，纯化后的产物即为TCR免疫组库文库。
对TCR免疫组库文库进行质检：
(1)取其中5μL纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测：
文库电泳检测分析结果见图3，文库在500bp-1000bp之间，在600bp左右和900bp左右出现主要条带，条带明亮清晰，与预期结果一致。
(2)取2μL纯化产物进行Qubit定量：
结果显示构建的文库达到上机要求浓度，可用于上机测序。
(3)上机测序：按照MiSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
上机数据统计见下表：
同时，所用到的单分子标签校正了类似下表数据，避免了误读，使结果更加准确。
如上表数据所示，核酸序列中，其中一条链的一个碱基由C变成了碱基G，导致氨基酸编码由D变成了E，如果没有分子标签，我们会认为上表数据由两条链组成，导致结果误读。但是因为有分子标签，而同一分子标签的数据来自同一条链，我们可以知道来自同一分子标签“AACGTG”的4条链，有3条在那个位置的碱基是C，只有1条链的碱基是G，所以我们可以排除G的结果，避免了结果误读。
