一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒。
背景技术
遗传性出凝血疾病(inherited bleeding,thrombotic,and platelet disorders，BPD)是一组造成出血、血栓或血小板异常的疾病，主要可分为凝血因子紊乱、血栓性疾病和血小板异常这三大类。而每个种类下面还可以进行细分，如出血性疾病下的凝血因子V和因子VII缺乏症，纤维蛋白原缺乏症和血友病等；血栓性疾病下的抗凝血酶缺乏症和蛋白C缺乏症等；血小板异常下的血小板减少症，先天性无巨核细胞血小板减少症，灰色血小板综合征，May-Hegglin及其他MYH9相关异常，巨大血小板综合征和Wiskott-Aldrich综合征等。这些疾病大概影响万分之三的新生儿。
遗传性出凝血疾病在临床上的明确诊断主要依据一系列实验室检验方法，而实验指标的选择可能与其血栓或出血的性质相关。比如，对于易栓症来说，应先做遗传表型测定(蛋白分子活性及其抗原水平)，后做基因分析，但对于某些缺乏遗传表型指标的疾病来说，可直接进行基因分析，如凝血酶原G20210A。此外，其检测结果可能受到多种因素的影响。比如，针对易栓症分型的抗凝血酶，蛋白C和S的检测均受到患者自身治疗和急性血栓事件的影响，从而需要在发病或治疗结束后一段时间进行；此外，还要尽量避免在妊娠、口服避孕药或雌激素替代治疗期间采集样本。但是，基因检测就完全不受外界诸多因素的干扰，可以直接给出准确的结果，如针对凝血因子V Leiden突变及凝血酶原G20210A。
F5(coagulation factor V)该基因编码凝血级联的重要辅助因子。该因子在血浆中循环，并通过凝血酶释放激活肽而转化为活性形式。这就产生了一条重链和一条轻链，它们由钙离子连接在一起。活化蛋白是与活化凝血因子X共同参与凝血酶原到凝血酶的辅因子。该基因缺陷可导致常染色体隐性出血性素质或常染色体显性血栓形成。
F7(coagulation factor VII)该基因编码凝血因子VII，这是一种维生素k依赖因子必不可少的止血。该因子以酶原形式在血液中循环，通过IXa因子、Xa因子、XIIa因子或少量蛋白水解凝血酶将其转化为活性形式。当因子VII被激活时，一个含有催化结构域的重链和一个含有2个类似egf结构域的轻链被生成，两个链被一个二硫化键连接在一起。在因子III和钙离子的存在下，活化因子通过将因子IX转化为因子IXa和/或因子X转化为因子Xa进一步激活凝血级联。该基因的缺陷可导致凝血功能障碍。
F8(coagulation factor VIII)该基因编码参与凝血内源性通路的凝血因子VIII；因子VIII是因子IXa的辅因子，IXa在有Ca2+和磷脂的情况下，将因子X转化为活化的Xa。这个基因产生两个交替剪接的转录本。转录变体1编码一个大糖蛋白，亚型a，在血浆中循环，并与非共价复合物中的von Willebrand因子结合。这种蛋白质经历多次分裂事件。转录变体2编码一个假定的小蛋白，亚型b，它主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。这种结合域对于凝血活性至关重要。该基因缺陷导致血友病A，一种常见的隐性x连锁凝血障碍。
F9(coagulation factor IX)该基因编码维生素k依赖性凝血因子IX，它作为一种不活跃的酶原在血液中循环。这个因子被XIa因子转化为一种活性形式，它切除了激活肽，从而产生一个重链和一个轻链，由一个或多个二硫键连接在一起。激活因子IX在凝血级联中的作用是通过与Ca2+离子、膜磷脂和因子VIII的相互作用将因子X激活到其活性状态。这种基因的改变，包括点突变，插入和删除，导致因子IX缺乏，这是一种隐性的x连锁疾病，也被称为血友病B
FGA(fibrinogen alpha chain)该基因编码凝血因子纤维蛋白原的亚基，纤维蛋白原是血凝块的组成部分。血管损伤后，在纤维蛋白原转化为纤维蛋白的过程中，凝血酶对编码的前原蛋白进行蛋白水解。该基因的突变导致多种疾病，包括纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症、非纤维蛋白原血症和肾淀粉样变性。
VWF(von Willebrand factor)该基因编码参与止血的糖蛋白。编码的前原蛋白在组装成大型多分子配合物后被蛋白水解。这些复合物在血小板与血管损伤部位的粘附和血液中各种蛋白质的运输中起作用。这种基因的突变导致了冯·威尔布兰德病，一种遗传性出血疾病。
CYCS(cytochrome c,somatic)该基因编码一种小血红素蛋白，作为线粒体电子传递链的中心组成部分。编码蛋白与线粒体的内膜结合，在那里它接受细胞色素b的电子并将其转移到细胞色素氧化酶复合体。这种蛋白也参与了细胞凋亡的启动。该基因突变与常染色体显性非综合征血小板减少有关。
TUBB1(tubulin beta 1class VI)该基因编码β微管蛋白家族的成员。管蛋白是两个核心蛋白家族(α和β管蛋白)之一，它们异二聚并组合成微管。该蛋白在血小板和巨核细胞中特异性表达，可能参与血小板生成和血小板释放。该基因的突变与常染色体显性巨血小板减少有关。
MPL(MPL proto-oncogene,thrombopoietin receptor)c-mpl编码了一种与造血受体超家族成员同源的蛋白。c-mpl的反义寡脱氧核苷酸的存在抑制了巨核细胞集落的形成。1994年克隆了c-mpl的配体，血小板生成素。血小板生成素是巨核细胞生成和血小板形成的主要调节因子。由c-mpl基因CD110编码的蛋白是一个635氨基酸跨膜结构域，有两个细胞外细胞因子受体域和两个细胞内细胞因子受体盒基序。TPO-R缺陷小鼠血小板减少严重，强调CD110和血小板生成素在巨核细胞和血小板形成中的重要作用。当血栓生成素CD110结合后，非受体酪氨酸激酶的JAK家族，以及STAT家族、MAPK家族、转导蛋白Shc和受体本身都被磷酸化酪氨酸。
ITGA2B(integrin subunit alpha 2b)这个基因编码整合素链家族的一个成员蛋白质。编码前原蛋白经蛋白水解生成轻而重的链，通过二硫键结合形成alpha-IIb/beta-3整合素细胞粘附受体的亚基。这种受体通过介导血小板聚集在血液凝固系统中起着至关重要的作用。这种基因的突变与血小板型出血疾病有关，这种疾病的特征是血小板聚集失败，包括Glanzmann血小板减少症。
ITGB3(integrin subunit beta 3)ITGB3蛋白产物是整合素β链β3。整合素是由一个链和一个链组成的完整的细胞表面蛋白质。一个给定的链可能与多个伙伴结合，导致不同的整合素。在血小板中，整合素β3和αIIb链一起被发现。整合素已知参与细胞粘附以及细胞表面介导的信号传递。
NBEAL2(neurobeachin like 2)该基因编码的蛋白包含beige and Chediak-Higashi(BEACH)构域和多个WD40结构域，可能参与巨核细胞-颗粒生物发生。这种基因的突变是导致灰色血小板综合征的原因之一。
MYH9(myosin heavy chain 9)该基因编码常规非肌肉肌球蛋白；这种蛋白不应该与非传统的肌球蛋白9a或9b(肌球蛋白9a或肌球蛋白9b)混淆。编码蛋白是一种肌球蛋白IIA重链，包含一个IQ域和一个肌球蛋白头状域，参与细胞分裂、细胞运动和维持细胞形态等重要功能。该基因缺陷与非综合征感音神经性聋常染色体显性17型、爱泼斯坦综合征、阿尔波特综合征伴大血小板减少症、塞巴斯蒂安综合征、费特纳综合征和大血小板减少症伴进行性感音神经性聋有关。
GP1BA(glycoprotein Ib platelet subunit alpha)糖蛋白Ib(GP Ib)是一种血小板表面膜糖蛋白，由一个异二聚体、一个链和一个链组成，由二硫键连接。Gp Ib是VWF因子的受体。Gp Ib参与血小板粘附血管损伤后血管内皮下膜,并启动信号事件中导致增强血小板活化的血小板,血栓和止血。这个基因编码阿尔法亚基。这种基因的突变导致贝纳尔-苏尔综合症和血小板型冯·威尔布兰德病。
RBM8A(RNA binding motif protein 8A)该基因以保守的rna结合基序编码蛋白质。这种蛋白质主要存在于细胞核中，但也存在于细胞质中。它优先与剪接产生的mrna相关，包括核mrna和新细胞质mrna。该蛋白仍然与剪接的mrna相关，作为标记来指示内含子存在的位置，从而耦合前和后mrna剪接事件。在此之前，认为有两个基因编码这种蛋白质，RBM8A和RBM8B；目前认为RBM8B基因座是假基因。这个基因有两个替代的翻译起始密码子，这导致了两种形式的蛋白质。该基因的等位基因突变和低频非编码单核苷酸多态性(SNP)导致血小板缺血半径(TAR)综合征。
WAS(Wiskott-Aldrich syndrome)该基因突变引起wiskottate–aldrich综合征。wiskott_aldrich综合征(WAS)蛋白家族具有相似的结构域，并且参与了从细胞表面受体到肌动蛋白细胞骨架的信号转导。许多不同的基序的存在表明它们受到许多不同刺激的调节，并与多种蛋白质相互作用。最近的研究表明，这些蛋白质直接或间接地与小的GTPase,Cdc42(已知可以调节肌动蛋白丝的形成)和细胞骨架组织复合体Arp2/3相联系。wiskottate-aldrich综合征是一种罕见的遗传性x连锁隐性疾病，以免疫失调和微血小板减少为特征。
GATA1(GATA binding protein 1)该基因编码一种属于GATA转录因子家族的蛋白质。该蛋白通过调节胎儿血红蛋白向成人血红蛋白的转换，在红细胞发育中发挥重要作用。该基因的突变与x线连接的异粒细胞性贫血和血小板减少有关。
SERPINC1(serpin family C member 1)该基因编码的蛋白质是一种血浆蛋白酶抑制剂和serpin超家族成员。该蛋白抑制凝血系统的凝血酶和其他活性丝氨酸蛋白酶。该蛋白包括两个功能域:成熟蛋白n端肝素结合域和c端活性位点域。肝素的存在增强了抑制活性。目前已经发现了120多种这种基因的突变，其中很多都能导致抗血栓素-III缺乏。
传统的Sanger测序技术在检测基因核苷酸变异应用中为常用检测手段，但对于检测F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性，表现在：检测通量受到限制，该方法仅适用于少数明确突变热点的检测，而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间，且对于待检测样本的基因组DNA消耗巨大，在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量DNA。因而在日常实践中难以采用Sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。
采用高通量基因测序技术检测F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1基因的突变，需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用基因组DNA片段化方法，则后续会存在DNA末端修复、加A尾等步骤，不仅过程繁复且对于基因组DNA的需求在100ng以上，对于福尔马林固定石蜡包埋样本会存在所提取DNA量不足问题。且DNA片段化需要借助DNA破碎仪，DNA片段化后需要利用磁珠富集DNA片段，需要投入仪器的维护产生了额外的操作及成本。
因此，有必要寻找一种新的检测遗传性出凝血相关基因突变的方法，以实现检测，降低劳动强度及检测成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，该方法建库步骤简便快速，有效降低成本，检测变异类型全面、检测准确率达到100％，且可同时对多个样本进行检测。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性出凝血的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性出凝血的基因检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性出凝血的基因检测文库，涉及目标区域为以上18基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。为保证目标区域全部覆盖，PCR扩增过程中所必须的引物组被分离为两个独立引物组，分别进行目标区域扩增，而后将PCR产物进行测序标签连接、文库洗脱及再扩增，扩增后纯化，得到测序用文库。
本发明的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；
(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；
(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；
(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；
(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；
(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。
本发明上述的遗传性出凝血的基因检测文库构建方法，所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、口腔拭子等，优选核酸样本为外周血白细胞、口腔黏膜脱落细胞。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:2ng。
步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。所用两个独立的引物组中每条引物为5’端磷酸化修饰引物。引物组氨基酸序列见表2。
进一步优选每个引物组反应体系为5-10μL，总体积为10-20μL。更优选每个引物组反应体系为5μL，总体积为10μL。
上述步骤(2)中所述的目标区域扩增反应体系按照下述体积比组成，PCR扩增预混液：引物组：DNA＝1:1:3；具体反应体系及反应条件见表1。
所述PCR扩增预混液为包含DNTP，DNA聚合酶，Tris-HCL，Mg2+按照现有技术配置成的混合液或购买获得。
表1目标区域扩增反应体系组分及反应条件表
表2引物组氨基酸序列(简称BPD引物组)
本发明步骤(3)中所述的连接预混液为含Tris-HCL的溶液，按照现有技术制备或购买获得。
本发明上述步骤(3)连接高通量半导体测序平台专用的测序标签(含区分样本的特异性标签序列)，在DNA连接酶的作用下，将测序标签与步骤2的产物连接。所述连接标签反应体系按照下述体积比组成，连接反应缓冲液：DNA连接酶：测序标签＝2:1:1。具体反应体系及反应条件见表3。
表3连接接头反应体系组分及反应条件表
本发明所述平台通用测序标签序列，A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG，P端CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。优选是Ion Torrent平台通用测序接头序列。
本发明所述的样本标签序列在测序接头序列A端，长度为10bp,其在测序模板序列的位置如下：A端接头序列+样本特异性标签+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG+CTAAGGTAAC+GAT+NNNNN+CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT+磁珠；其中GAT序列是固定序列，为了均衡测序接头的链接效率。所述NNNNN为文库序列。
所述样本特异性标签见下表4：
步骤(4)所述的纯化过程：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀，放置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后弃掉上清，采用70％乙醇清洗两遍磁珠，室温晾干磁珠。
步骤(4)中所述连接反应产物与纯化磁珠的体积比为1:1.5。
进一步优选，步骤(4)所述的纯化过程：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
步骤(5)所述的产物洗脱及扩增过程：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增。具体反应体系及反应条件见表5。
所述PCR引物的序列：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC，5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG
表5文库扩增反应条件
步骤(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠，混匀后置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液，在上清液中加入相应体积的磁珠混匀后置于磁力架上进行吸附，带溶液澄清后弃掉上清，采用70％乙醇清洗两遍磁珠，室温晾干磁珠，加入Tris-EDTA，上清液即为文库。
步骤(6)中PCR产物与纯化磁珠两轮纯化，其体积比为1:0.5:1.2。
进一步优选，步骤(6)所述的扩增产物纯化过程：在上述步骤5扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
步骤(7)所述文库质检过程：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
本发明上述步骤(3)、步骤(7)所述的高通量半导体为Ion Torrent。
本发明一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，包括如下步骤
(1)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，BPD引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。本发明的制备方法还包括步骤(8)-(10)。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion 510TM&Ion 520TM&Ion 530TMKit–Chef试剂盒操作规程利用Ion Chef进行测序模板。
(9)利用Ion GeneStudio S5基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性出凝血的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性出凝血的基因检测试剂盒，其包括文库构建试剂及序列。
所述的建库试剂包括但不限于PCR扩增预混液、连接反应缓冲液、DNA连接酶等。
所述的序列包括所述引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:294。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的文库采用高通量基因测序技术检测F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1的基因突变，不涉及基因组DNA片段化，DNA末端修复、加A尾等步骤，操作简单，对DNA需求量低。
2、本发明的文库避免了化学打断法，不依赖于酶切方法进行基因组DNA片段化，不容易造成污染等问题。
3、本发明的文库避免了物理打断法中DNA破碎仪的使用，无需投入DNA破碎仪，减少了仪器维护及操作产生的费用，节约了成本。
4、本发明提供一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒检测变异类型全面、准确率高达到100％、通量高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的外周血DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的方法构建的口腔拭子DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图3是根据本发明的文库构建及序列测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用10个外周血样本提取的基因组DNA进行文库构建，采用包含F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1共18基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域作为目标区域的引物组进行目标区域扩增反应，并结合高通量测序平台Ion GeneStudio S5进行测序，对于待检测样本进行单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)检测及分析。具体操作流程如下：
(3)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(4)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，BPD引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion 510TM&Ion 520TM&Ion 530TMKit–Chef试剂盒操作规程利用Ion Chef进行测序模板。
(9)利用Ion GeneStudio S5基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读，数据见下表6。
表6 10例样本的测序结果与Sanger证结果100％一致
实施例2
采用20个口腔拭子样本提取的基因组DNA进行文库构建，采用包含F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1共18基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域作为目标区域的引物组进行目标区域扩增反应，并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行测序，对于待检测样本进行单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)检测及分析。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，BPD引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion PI Hi-QTMview OT2Kit试剂盒操作规程利用One Touch 2系统进行测序模板制备。反应体系见7
表7 One Touch 2系统模板制备反应体系：
(9)利用Ion Proton基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读，数据见下表8。
表8 20例样本的测序结果与Sanger证结果100％一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒
<160> 288
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 1
taagtctgcc ctttcttcct tcttc 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 2
cgccaataag aacaaaggta agagtca 27
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 3
cctaacatgt tctagccaga agaaattct 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
caatattaat tggttccagc gaaagcttat 30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
ccaatcattc aagtaatctt tcctcctct 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
gaatggttta aggaagataa tgctgttcag 30
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
ggagagttgc agcagacctt ta 22
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
aggtataatt agacacatgc ccttttgtt 29
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
cccttgagag ctgtgaactt aca 23
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
ccttccacaa gttgatttaa aggatatgc 29
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
gacctgagga ctttggaaga gtc 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
ggaactgcaa ggttgtgagg taa 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
tcctcactga ccatgtggtg 20
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
agaacatgta ctccgtgata tttggg 26
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
cggtctccga ggcactg 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
ctgggctcac cgtcctc 17
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
agaggatggg tgtttctgaa tctttc 26
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
ccttccagag ctgttgttca ca 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
gggacaacag tctagaaatg cg 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
gccctgatga ggtgcaaaga g 21
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
ctccttctca ttgtagtcta tctgtgtg 28
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
gctccagtac ttcaagattt taggtcatt 29
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
aggtgaagga acacaaatgc taact 25
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
acttgacatg tttctttgag tgtacagt 28
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
cagctggaga aaggaccaac ata 23
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
ccaaggaaca atttcatgaa aagaccaaat 30
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
agtgtctgct aggatttagc acaaa 25
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
ggtttaatcc tggactactg gaaaca 26
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
agtacacaaa gaccatttct tttaaaccaa 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
ccctaaggac cttaagatcc tagaagatta 30
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
gctccatgcc ctaaagagaa attg 24
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
cttcaaaact acacttttct tccatacatt ctc 33
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
aaaagtttct gggaccaatc aggt 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
tgtgagagtg ccatctcttc ct 22
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
tgtatttgtg aagatgccag attctgag 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
tggtcacttc taaaggagat aaagagct 28
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
gaagtgatat tctgcataag cttcattcc 29
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
tgagaataac ttcttccaac cagcttaatt 30
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
ctcacagcct caggattcct tg 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
gccttggtag agatgggcag ta 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
caggatccag gaagcatcca at 22
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
ctctgtcttc aaagtctcca ggaa 24
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
aggttcgctt cccactttcc 20
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
caacccccaa ctagattcca atagg 25
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
cacctcctgc cttttgcttt tc 22
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
gtcaccttca tcaccaaggg t 21
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
tgccacaagc ctgatcactc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
ctcagcagca ggatgaggac 20
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
acctcacccc taaaatctgg ttattc 26
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
cagaccttcc aagggagctt aaat 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
gactggctgg attttgaggt tttc 24
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
gacttccggg acaagctgag 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
catctctcct tgactccctg tg 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
tcaccagcct gaggtttgag 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
ggcatttcta gctggaggca 20
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
cagccacttc ctttctgtta ctcc 24
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
tgagactagg gctaggaaag gg 22
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
gggaactgag acttcagaat atttcatgg 29
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
gggtgctgga agtctggaat 20
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
gctcctggcg gctattattt ctta 24
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
tcttttctag gacgttccag tgc 23
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
cttcttgtgc cttccaggtg a 21
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
actgcaatcc cccaaagtaa acc 23
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
tgacgatgct tcccctcag 19
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
cgccttccca ggtctttctt 20
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
tgagcgggtc ctcagaact 19
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
cgtgcttgtg tttttgcttt gc 22
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
caaaggtccc attgccattg tt 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
cccgtacctt cctccaatct tc 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
agaaggctgc atcccttcta ga 22
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
tttccttcaa ggaccttagt tactttgtc 29
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
acgatggtac tggctgaaca tg 22
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
ttttaatgga ggtggagcag ctt 23
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
caacattccc tgaggtagaa gtcac 25
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
ccttgaccat gctcttatat ctcca 25
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
ctggactgta caggaaggag aag 23
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
ctcattcttc ccacatagtt ccca 24
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 78
ctttcactcc tgctaacagg cat 23
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
gctgtatctg acaggaacct ga 22
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
caggagagcc tcttactcta cct 23
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
cctcctgcaa ctggatcatc tc 22
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
agttggttaa atacagcatt gagtgga 27
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
cggtctggcc tagtccaca 19
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
cccggaaacc tctgttcct 19
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
gacctgaacc ttcatatttc cacca 25
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 86
cacaacctca aggagcgtta ct 22
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 87
aaaaagcagg gtcatgttta cgtg 24
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 88
gtctggcttg aggatcccta ga 22
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 89
aagaatgctc acagctcact agtg 24
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 90
acacacgttt cataacgagt gct 23
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 91
atgctgcagg cagaagagac ag 22
<210> 92
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 92
tcacagacct tgctattttc tccttg 26
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 93
ctgaggaacc agcagcttcc at 22
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 94
ttggcagagt ggaagaggaa gct 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 95
caccatgagg gaaaagccta agt 23
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 96
ccctacccac cttgctgttc 20
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 97
ggagcggctg tacgagtt 18
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 98
cccaaggcat aagtgccaga 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 99
aatgagacgg cacccttcaa 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 100
cccatcaagc ccatgactgg 20
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 101
acatccagta catgtccagc atag 24
<210> 102
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 102
gcaggtcagt aggcacacc 19
<210> 103
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 103
cctcagcgtt cgcctagac 19
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 104
gtccgtagat gaggtggaaa agc 23
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 105
acagctgatc tccgtgagat g 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 106
agcttggaga gcacatagca g 21
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 107
actcgattgt cccgtctcct 20
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
ccacaccagt ccaatctctc c 21
<210> 109
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 109
gtgggctggt aggccatc 18
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 110
gttggacgtg tcagcagaag 20
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 111
cggctctcag ctgaggaag 19
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 112
cccatactct tcccatgttt agctc 25
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 113
acagtttgta gcggcactac g 21
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 114
cattgactga atacaggtgc aagga 25
<210> 115
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
cagagagcat tcacaaactg aaagaa 26
<210> 116
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 116
gtttaagcta tctctgaacc cattcct 27
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 117
cccaatttgc gtgtttttac cg 22
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 118
gcggaatctc taatccaccc aa 22
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 119
tgtgaatttg gatgctgttt ctcca 25
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
catgtgctca ccacccatgt ta 22
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 121
tcatagcaaa agccgtggag at 22
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
gttgcagcct agcttaactt gg 22
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 123
tctgctcatg aacaagatta gagagga 27
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
caaggacact aggtggttga gatc 24
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
cacggccatc caagagatct tt 22
<210> 126
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 126
aatgagaaac tgttctgtaa gcgact 26
<210> 127
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 127
gcaggagcac acgtcgta 18
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 128
gcagcactgg gctatttcca 20
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 129
gcacctggtc tctggaatac aa 22
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 130
gggtcacgag gatcaatctt ttct 24
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 131
ccaggattag aacccgagtc gta 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 132
ggtctacatg gtcaccggaa atc 23
<210> 133
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 133
aaaaagaacc tttcttaccc ttcctaaga 29
<210> 134
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
ggttttattt attgccacat tctcagca 28
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
agagatgtgc ctcagacact ga 22
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 136
cttgtttcat ggttctgcag attgt 25
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
acctacgatc agggagcaga aa 22
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
gtgtagagtg gagggaggat ct 22
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 139
gctcactgtg gagttgacac ag 22
<210> 140
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 140
gcaccctata gcatagctga atacttac 28
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
gccacaggtc tcttccactt taa 23
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
gtaggcctgt gttcaattct aggg 24
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
gcagctcata gctaagatac gca 23
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
gtccagaacg tccagtagct 20
<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
ggacttgttt cccttgtccc tt 22
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
gagaggagat gatggagagg gaaa 24
<210> 147
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
gaattctggt gtatgagatc tattaaagga tgg 33
<210> 148
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
gcattctttc ttgtttaggc atcatctg 28
<210> 149
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
gtacttagaa cagtgcctca cacttag 27
<210> 150
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
cccatgccta gactcctgac ta 22
<210> 151
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
caagaagtta ccaagatgct cccaa 25
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
agagtggtga aaacgcaatc ct 22
<210> 153
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
tctgaagtag agtgcatttg atcagg 26
<210> 154
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 154
gaaaagccag tttctcatta agacacg 27
<210> 155
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
cagtcatatt tcaaccacag gaatgaaaa 29
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
ttttcccaga accatttatg gaatagagaa 30
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
ggagaaagag ggagttagtg ca 22
<210> 158
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
cacttggtga gtgaatgttt gatcac 26
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
tgatgaccca ggactgcct 19
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
gtactgggag accctggtgt a 21
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
atctcacgag gcttgctctc 20
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
tctgcaaata tgggacccaa agt 23
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
ctgggaggga tctgcaaaga c 21
<210> 164
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
accgcgatca ggttcctc 18
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
aatgttcagt taggacctta aaagagttgt 30
<210> 166
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
cagcaagcaa atactacttt ttgtcagtaa 30
<210> 167
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
atgagctgtg tgtttctttg ttctatttg 29
<210> 168
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
tgagaaaaac aaagtggtag taggaaagg 29
<210> 169
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
tccaaaagtg ggaatacatt atagtcagc 29
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 170
gcacctagga aaatgaggat gtga 24
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
gtccattgga gacaaggctg aa 22
<210> 172
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 172
ctcactcctt gccttgattg aatcata 27
<210> 173
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
attaggtcag tggtcccaag tagt 24
<210> 174
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
tgtattcctt gtcagcaatg caaatag 27
<210> 175
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
catgagtcag tagttccatg tactttttag aa 32
<210> 176
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
gtaggtttgt taaaatgctg aagtttcaga t 31
<210> 177
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
ccaccaggtc tctctaactc catt 24
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
taccaggaac tcaatagacg tagtttatgt 30
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
ggcatctgga aaagggaaaa agaaa 25
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
ctggctacaa gaggagaagg aca 23
<210> 181
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
cccatacaga atcctcaggc at 22
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
gtggcatgaa gacagggaaa gca 23
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
gcttctatgt cttgggtctc ttctg 25
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
attaggccgt acccacagga 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
ggcaatgagc tgaagaccct 20
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 186
gaggatctca cagttgcata acca 24
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 187
ccaaacatga ccaccctgga 20
<210> 188
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 188
agtgatacgg gttttgtggt agttaaaa 28
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 189
gcctcgaaag acccttctgt 20
<210> 190
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 190
tgatcttgga gggtgaagac tg 22
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 191
acatacgtca tcttccccac ag 22
<210> 192
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 192
gacattgtcc caaacctcca aataaac 27
<210> 193
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 193
tgcagctcgg catttaggg 19
<210> 194
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 194
taaaggatct gggacctcag aaagg 25
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 195
acttcggcca gttttcggt 19
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 196
tgggtcccaa attaccagag c 21
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 197
catattctgg cgatagggag agc 23
<210> 198
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 198
aagactaatt tgcgcccttg tc 22
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 199
agaagggagg gaggtgtacg 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 200
ctgacccctc ctccttgtct 20
<210> 201
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 201
ggtttgtaaa gtttgggagc ctaca 25
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 202
cctatgcaga gtggccatcg 20
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 203
cacactgcac cacagtacag g 21
<210> 204
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 204
tctgggacta tgtgagcaag c 21
<210> 205
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 205
ccattgttgt ggagctgaag g 21
<210> 206
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 206
cagggcatca cactctctct g 21
<210> 207
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 207
gagagaggag caatagtttc cca 23
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 208
ctccaagtcc gcaacttgac 20
<210> 209
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 209
caggcccaag ctgaacctaa ta 22
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 210
ccagtggttg caggtatatg agg 23
<210> 211
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 211
aatgtggcag ctgtgtctgt at 22
<210> 212
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 212
ctggtgagca agaaacacac ct 22
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 213
tgtctgggta actgtggttg tatg 24
<210> 214
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 214
cccagagttc agtcacttcc tt 22
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 215
ggccgaagtc tgaccctttt 20
<210> 216
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 216
agaatgcctg tttacaggcc tt 22
<210> 217
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 217
agaagtcact gttctcatga gagaaga 27
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 218
tctgtggcaa tcagctgtat gac 23
<210> 219
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 219
cacagagggt ggagatcacc ta 22
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 220
tcagctaagt gcagggacag ata 23
<210> 221
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 221
ttagggagag gctctcggtt ag 22
<210> 222
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 222
gcggtctcca ccctagttg 19
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 223
ggatcttctt gagggccatg tt 22
<210> 224
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 224
cctaagtgcc atgattgtga cca 23
<210> 225
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 225
tgactttccc acacacggaa ag 22
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 226
ctgacgagtg gctgatgaag aa 22
<210> 227
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 227
gtcagacgcg gagcatcaga ag 22
<210> 228
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 228
tgtgtcttct ttccttagga gagtttg 27
<210> 229
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 229
ccacaaagcc tcatctcatg tg 22
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 230
acgagaagaa gctgaagagc atg 23
<210> 231
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 231
catgttcaca gcagtcccaa ga 22
<210> 232
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 232
actccacttt gcttctttct ggt 23
<210> 233
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 233
caggaggcag cttcttctct ac 22
<210> 234
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 234
gatcagcttg tctcaggctc at 22
<210> 235
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 235
ctgtgaggac tgcatcatgg aa 22
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 236
ccaagtcaag cagagggact ta 22
<210> 237
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 237
cagacttggg tggctctgc 19
<210> 238
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 238
gctcacctgc gcgtagta 18
<210> 239
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 239
accagggact gtcattctct cc 22
<210> 240
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 240
tgtgctgagt gtctccaaca g 21
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 241
ctgcccccag cttctttacc 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 242
ccacgcagtg ctagaacaga 20
<210> 243
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 243
aggtccagct gaaacgcat 19
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 244
cctctccatc cgttcctctg 20
<210> 245
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 245
tctccccgcc tttctttgg 19
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 246
aacctccagc ctacctgacc 20
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 247
taggatcagg caacactgct g 21
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 248
tgtcctccct tgggtaccat 20
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 249
ctgctcaagc tcttcatcat tctct 25
<210> 250
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 250
ccaaggtaga ggccacttca c 21
<210> 251
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 251
agtatatacc ccatgactca atggca 26
<210> 252
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 252
accctcctcg gtttccac 18
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 253
cattctcccc acctcacctt g 21
<210> 254
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 254
atctgctctc catccctaca cc 22
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 255
gcttcaggga gcagatagtg taatc 25
<210> 256
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 256
cactggcact cacagtcacc 20
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 257
ctgacactcc ctgcttcctc 20
<210> 258
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 258
tacaccaatg accaccacct tc 22
<210> 259
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 259
ataaaatagt taaacgcagt aggaatgggt 30
<210> 260
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 260
ctcttggcca accacagcaa ac 22
<210> 261
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 261
cccattttaa ggtgctcaaa agagg 25
<210> 262
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 262
ccaagaatga caatgataac attttcctgt 30
<210> 263
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 263
gtgggaggga gagcacttga aat 23
<210> 264
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 264
gaactggtca tcagcctttg ac 22
<210> 265
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 265
ccctctatga catctgcttc cgta 24
<210> 266
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 266
ccacttcctt ggtggacatc ttg 23
<210> 267
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 267
gctttgtgga gtggattccc aa 22
<210> 268
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 268
tgaacatggc tgagaaatgc tca 23
<210> 269
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 269
ggcctgtgaa tgggttagca ta 22
<210> 270
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 270
gattctgcta gcaccagctc tt 22
<210> 271
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 271
cactaatgtg gagacctcga gatt 24
<210> 272
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 272
ctaaacaact atgccgctgc ttt 23
<210> 273
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 273
ctgcaagact gaacataatg actgac 26
<210> 274
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 274
ggtggtcaag ctgctcacat tta 23
<210> 275
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 275
catttctgct ttacaatgac ttgcct 26
<210> 276
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 276
cgctgtcact tggagaacgt ac 22
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 277
taaagccgca catacgtgac a 21
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 278
actcagggag acactaacgg a 21
<210> 279
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 279
gtattgagca tatttaatat cagccacaac a 31
<210> 280
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 280
ccttggagtt tctgaatcat tcagct 26
<210> 281
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 281
tataagcatc caagagcctc agagt 25
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 282
tgtgatgaat gtgcaggaac tct 23
<210> 283
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 283
gaagcaagct ctagggctct g 21
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 284
gaatgggtct tggcaatggc 20
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 285
taggcctcca ggtaggagga g 21
<210> 286
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 286
gctacgacgt gtgctcctg 19
<210> 287
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 287
cactacctcc atgaccatcc aa 22
<210> 288
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 288
ccattcactc agctgtccac tt 22
