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高通量测序文库的构建方法及其应用

2021-01-31 20:33:32

高通量测序文库的构建方法及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及涉及确定样本的目标DNA片段的靶向测序技术。更具体地，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法、一种确定样本的目标DNA片段的测序方法、一种用于确定样本目标DNA片段的装置以及一种用于构建样本目标DNA片段高通量测序文库的试剂盒。

　　背景技术

　　近年来崛起的新一代高通量测序技术能够同时对数十亿个DNA片段进行测序，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具。全基因组测序以其全面综合的检测性能广泛应用于基础科研领域，然而全基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让科研人员倍感困难，尽管新一代测序(NGS)的通量越来越高，而费用越来越低，但它仍不是大多数遗传实验室和临床检测中心可行的选择。对于复杂疾病的研究更是如此，这类研究至少需要数百个样本，以实现足够的统计能力，这么多样本的全基因组测序，无论从成本考虑，还是从数据分析考虑，都是相对困难的。

　　因此另一测序技术就应运而生—目标靶向测序技术，目标靶向测序技术是通过一些不同的方法对我们感兴趣的目标DNA进行捕获制备成测序文库，再通过高通量测序进行测序分析，得到目标DNA的序列，例如外显子捕获测序，其捕获和测定大约30MB的全基因组外显子序列，其测序成本只有全基因组测序的百分之一。目标靶向测序技术杜宇庞大的人类或高等生物的基因组，可以成百上千倍地提高测序效率，及大地提高样本的通量，是高通量测序技术更好地应用于临床检测领域，目前发展了多种目标靶向测序技术，其主要分为一种是基于探针的捕获的富集技术，另一种是基于多重PCR的富集技术。

　　基于多重PCR的目标靶向测序技术以其简便的实验流程应用于一些临床检测领域，但其大多只能捕获小于1MB的区域，大都只能检测已知突变，且检测的稳定性差，这些特性都限制了其在临床的应用。基于探针的目标靶向测序技术能够捕获大于10mb以上的区域，且稳定性好，可以检测多种类型的突变，并且可以定制不同的检测区域，在临床应用具有极大的潜力。

　　然而，基于探针捕获的目标靶向测序技术其建库流程长，探针为了能够充分地和目标区域结合需要杂交1-2天甚至更长的时间，大大限制了临床检测的时效性。另外杂交捕获的效率有限(通常只有50-60％的捕获效率)，其浪费在非目标区域的数据也无形中增加了探针捕获的成本。

　　发明内容

　　本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。本发明的第一方面提供了如下的技术方案：

　　将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；

　　将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；

　　在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；

　　将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；

　　将所述连接产物通过一条带有5端磷酸化的引物和另一条5端不带有磷酸化的引物进行PCR扩增，得到DNA文库；

　　在本发明一个优选的实施例中，将所述DNA产物用外切酶进行消化得到单链DNA文库；在本发明一个优选的实施例中，其中所述外切酶为lambda外切酶；

　　将所述DNA文库与封闭寡核苷酸，特异性探针混合以进行杂交捕获，所述封闭寡核苷酸会形成环状封闭DNA文库两端引入的接头和/或标签序列，所述特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；其中，所述环状封闭寡核苷酸是对接头和/或标签序列设计的，所述封闭寡核苷酸两段分别与DNA文库两端的接头和/或标签序列互补配对，连接形成闭环，实现环状封闭；

　　在本发明一个优选的实施例中，所述杂交捕获为6～8h；

　　在本发明一个优选的实施例中，所述杂交捕获后用带有链霉亲和素的磁珠吸附并洗涤；

　　将获得的所述目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；

　　在本发明一个优选的实施例中，所述PCR扩增扩增10-12个循环；

　　以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成所述高通量测序文库，

　　在本发明一个优选的实施例中，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种，优选所述基因组DNA为人类全血基因组DNA，更优选所述基因组DNA为外周血单核细胞基因组DNA，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述基因组DNA的量为2μg，

　　在本发明一个优选的实施例中，利用covaris-S2打断仪将基因组DNA片段化，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述DNA片段的长度为约150-300bp，优选200-250bp，

　　在本发明一个优选的实施例中，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤，

　　在本发明一个优选的实施例中，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性，

　　在本发明一个优选的实施例中，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’-5’exo-)进行的，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述接头中包含标签序列，

　　在本发明一个优选的实施例中，将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的，

　　在本发明一个优选的实施例中，在获得连接产物后，进一步包括对连接产物进行纯化的步骤，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述特异性探针是采用eArray系统设计的，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述探针的长度为120mer，

　　在本发明一个优选的实施例中，采用1μg的连接产物进行所述杂交捕获，

　　在本发明一个优选的实施例中，使用热启动DNA聚合酶进行所述PCR扩增，

　　在本发明一个优选的实施例中，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述高通量测序文库的文库片段长度为300～450bp。

　　本发明的第二方面提供了一种对样本的目标DNA序列的进行测序的方法，其特征在于，包括下列步骤：

　　根据本发明第一方面所述的方法构建所述样本的目标DNA片段的高通量测序文库；

　　对所述样本的目标DNA序列的高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果。

　　在本发明一个优选的实施例中，所述测序是利用高通量测序技术进行的。

　　在本发明一个优选的实施例中，所述测序是利用Hiseq2000测序仪进行的。

　　本发明的第三方面提供了一种用于确定样本的目标DNA序列的装置，其特征在于，包括：

　　文库制备单元，所述文库制备单元用于制备样本的确定样本的目标DNA片段的高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有特异性探针和封闭寡核苷酸；

　　测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述样本的确定样本的目标DNA片段的高通量测序文库，以便用于对所述样本的确定样本的目标DNA片段的高通量测序文库进行测序，获得测序结果；以及

　　数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述样本的确定样本的目标DNA片段的信息。

　　在本发明一个优选的实施例中，所述高通量测序文库为单链DNA文库，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述特异性探针是采用eArray系统设计的，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述探针的长度为120mer左右。

　　本发明的第四方面提供了一种用于构建样本目标DNA序列的高通量测序文库的封闭寡核苷酸，所述环状封闭寡核苷酸是对接头和/或标签序列设计的，所述封闭寡核苷酸两段分别与DNA文库两端的接头和/或标签序列互补配对，连接形成闭环，实现环状封闭DNA文库两端引入的接头和/或标签序列。

　　在本发明一个优选的实施例中，所述封闭寡核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

　　本发明的第五方面提供了一种用于构建样本目标DNA序列的高通量测序文库，所述高通量测序文库是根据本发明第一方面所述的方法构建的。

　　本发明的第六方面提供了一种用于构建样本的目标DNA序列的高通量测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：

　　DNA文库、特异性探针和封闭寡核苷酸，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述DNA文库为单链DNA文库，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述特异性探针是采用eArray系统设计的，

　　在本发明一个优选的实施例中，所述探针的长度为120mer左右。

　　本发明提供了一种在DNA杂交捕获过程中对测序接头序列封闭的方法，该方法能够提高探针的捕获效率，降低非目标区域DNA的比例，极大地降低捕获目标DNA序列的测序成本，推动基于探针捕获的目标靶向测序技术应用于临床(附图5)。现有的捕获技术是利用RNA或DNA探针捕获双链DNA片段，通过DNA寡核苷酸线性封闭引入的接头和标签序列。该方法区别于常规的捕获方法在于，采用环状封闭(circle block)的方式去结合引入的接头的标签序列，尽可能完整地封闭引入的序列，防止接头序列之间以及探针和接头的结合造成的非目标捕获。本申请技术方案的优越效果具体详细如下：

　　1.增加目标捕获效率

　　本发明采用环状封闭策略，block可以非常牢固地和引入的接头和标签序列结合，避免探针和接头标签序列结合影响捕获效率和导致非特异序列捕获，环状封闭和模板有2个结合位点，相对于线性捕获，其结合的能力更强，封闭的效果更佳(附图3)。

　　2.使用多种捕获系统

　　本发明所提供的方法在NimbleGen芯片杂交系统、Agilent液相杂交系统和NimbleGen EZ液相杂交系统中均适用，在相同或接近的测序深度(每个碱基被测序次数)时作为衡量序列捕获效果的目标区域覆盖度和序列捕获特异性指标在单个样品杂交或者多个样品杂交时结果一致。

　　3.适合多种测序平台

　　本发明所提供的方法在构建杂交测序文库时，只需要更换为所使用测序平台提供的对应接头和引物序列，即可适用于Roche454和AB SOLiD等其他的第二代测序平台，有较广的应用前景。

　　本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

　　附图说明

　　本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

　　图1：显示了线性封闭和环状封闭的原理的示意图；

　　图2：显示不封闭接头导致的非目标区域捕获的示意图；

　　图3：显示了封闭寡核苷酸oligo结构的示意图；

　　图4：显示环状封闭对捕获效率的提升的示意图；

　　图5：显示了捕获文库构建的技术流程示意图；

　　图6：采用环状封闭和采用环状封闭加单链建库GC偏好性示意图

　　具体实施方式

　　下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

　　构建高通量测序文库的方法

　　根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

　　首先，将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段。在本发明中所使用的术语“DNA”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA。本领域的技术人员可以理解，基因组DNA的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其他实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取。根据本发明的实施例，可以从样本中提取获得基因组DNA。根据本发明的一个实施例，构建高通量测序文库的方法可以进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤。根据本发明的一些具体示例，样本可以来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种。根据本发明的一些实施例，哺乳动物可以为人和小鼠的至少一种。根据本发明的一个实施例，基因组DNA可以为人类全血基因组DNA，优选为外周血单核细胞基因组DNA。

　　根据本发明的实施例，基因组DNA的量不受特别限制，根据本发明的具体示例，优选基因组DNA的量为2μg。发明人惊奇地发现，当基因组DNA的量为2μg时，根据本发明实施例的构建高通量测序文库的方法构建的样本的确定样本的目标DNA片段的高通量测序文库，能够非常方便地应用于高通量测序技术，如Solexa测序技术，且文库测序结果准确，可重复性好。

　　其次，将DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段。根据本发明的一个实施例，在将DNA片段进行末端修复前，可以进一步包括纯化DNA片段的步骤，由此，使得后续的末端修复易于进行。根据本发明的实施例，将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

　　接下来，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’→5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

　　根据本发明的一个实施例，将具有粘性末端A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的，由此可以方便地获得连接产物。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对连接产物进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

　　然后，利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段。根据本发明的实施例，这里的术语“特异性探针”是指探针是对已知目标DNA片段的特异性。根据本发明的具体示例，特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用基因组上已知的目标DNA片段作为靶序列而设计的，由此，利用根据本发明实施例的特异性探针进行杂交捕获，能够有效地捕获样本中与靶序列互补的序列(在本说明书中，有时也称为“确定样本的目标DNA片段”)。

　　根据核酸的互补配对原则，单链状态的捕获探针可以与单链状态的目的序列互补结合，从而成功地将目标区域捕获。根据本发明的实施例，探针设计可选择固相捕获芯片(探针固定在固体载体上)或液相捕获探针(探针游离在液体中)，然而固相捕获芯片因探针长度、探针密度、价格偏高等诸多因素限制，液相捕获即作为首选。

　　根据本发明的实施例，采用安捷伦公司(Agilent)的探针设计系统eArray设计探针，探针长度80-120mer，探针可覆盖长度范围大，从小于200kb到24Mb甚至更长。eArray探针设计系统可以方便地使用生物信息学工具window masker(窗口序列屏蔽)和repeat masker(重复序列屏蔽)对目标区域分析并进行屏蔽，由此，可以避免对这些区域进行探针设计，非常有效地减少实验中的捕获干扰以及后续序列分析时发生的比对干扰；并且缩短覆盖长度可以在一定程度上减少成本。

　　本发明设计了一种在DNA杂交捕获系统中的测序接头封闭方法，其中包括线性环状封闭测序接头杂交捕获系统。

　　将样品基因组DNA通过包括但不限于超声波打断法打断成200～250bp大小的片段，通过末端修复、加“A”碱基、连接等过程为DNA片段加上接头，通过一条带有5端磷酸化的引物和另一条5端不带有磷酸化的引物进行PCR扩增，得到的双链DNA产物用lambda外切酶进行消化得到单链DNA文库。

　　样本杂交

　　在常规的探针捕获过程中，一般采用线性的block oligo去封闭引入的接头和标签序列(附图2)，因为采用双链捕获，往往加入的block oligo只能封闭1/2的接头序列(附图1)，有可能导致探针和接头以及标签之间结合，造成非特异性捕获；此外双链DNA片段2端的接头序列是互补配对的，很容易进行结合，例如非目标区域DNA片段一端的接头和目标区域DNA片段一端的接头结合，当目标区域被磁珠捕获时，非目标区域的片段也被顺带捕获下来，造成非特异性捕获(附图6)，

　　本发明改进DNA杂交流程，采用环状oligo的完全封闭引入的接头和标签序列，通过探针去结合完全封闭的单链DNA，防止接头之间以及探针和接头之间的互补导致非特异性捕获，然后用探针将目标DNA序列捕获下来。

　　a)采用环状oligo的封闭策略，完全封闭引入的接头的标签序列，环状封闭的稳定性比线性封闭能力更强，封闭效果更好，尽可能的减少接头和接头以及探针和接头DNA序列的互补结合而造成的非目标捕获。

　　下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

　　实施例1环状封闭

　　Agilent液相杂交体系(Agilent公司)对照实施例：单个样品用50M全外显子序列捕获(SureSelect Human All Exon 50Mb Kit)

　　实验方法：

　　杂交文库构建流程参考SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library protocol，取3ug基因组DNA(从人外周血中提取)打断后，末端补平，加“A”碱基，加接头(来自Illumina Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit)。采用发明的单链DNA文库制备方法进行单链DNA文库制备，用到的引物序列和封闭oligo序列如表1、2中所示。

　　末端修复

　　在1.5ml的离心管中配置如下试剂

　　25度，30min，65度15min；

　　接头连接

　　在上一步的反应体系中加入如下试剂

　　23度，30min；

　　在上述反应体系中加入100ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，最终纯化PCR产物，溶解至35ul纯水中。

　　双链DNA文库制备

　　PCR反应体系及反应条件如下：

　　在200ul PCR管中配置如下反应体系：

　　按照以下反应条件进行反应：

　　(a).98℃30s

　　(b).98℃30s

　　(c).65℃30s

　　(d).72℃1min

　　(e).重复(b)-(d)步骤3-9次(共4-10循环)

　　(f).72℃5min

　　(g).4℃ 静置

　　得到的PCR产物进行下一步反应

　　在上述反应体系中加入60ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，溶解至25ul纯水中，使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。

　　杂交

　　a.用浓缩等方法准备≥3.4μL 100ng/μL的双链DNA文库。

　　b.配制Hybridization Buffer(所有试剂都来自Agilent公司)：

　　c.准备SureSelect Oligo Capture Library Mix(所有试剂都来自Agilent公司)，并于冰上放置：

　　d.于PCR管中加入样品SureSelect-SC的DNA文库，同时加入cotDNA(100ng)2ul和环状封闭oligo1(100uM)或环状封闭oligo2(100uM)2ul,混匀后保持在65℃中。

　　e.按要求将HybridizationBuffer加入到PCR管中，混匀，于65℃(热盖设为105℃)杂交8小时

　　f.杂交后的样品用Dynal磁珠(Invitrogen)吸附样品，并用35μL SureSelect Elution Buffer洗脱捕获后的序列。

　　捕获后PCR扩增：

　　反应条件：

　　(a).98℃2min

　　(b).98℃20s

　　(c).60℃30s

　　(d).72℃30s

　　(e).重复(b)-(d)步骤9-14次(共10-15次)

　　(f).72℃5min

　　(g).4℃ 静置

　　j.在上述反应体系中加入50ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，溶解至25ul纯水中，使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。

　　测序与数据分析：

　　得到的文库经之间合格后到illuminanextseq500平台上机，测序长度PE150,得到的数据比对到人参考基因组，并统计比对率、捕获效率等参数

　　结果：

　　本发明获得的捕获效率和常规方法得到的捕获效率之比(76％vs59％)(图4)，该实施例中的环状封闭的方法取得了意料外的技术效果。

　　实施例2单链建库+环状封闭

　　Agilent液相杂交体系(Agilent公司)对照实施例：单个样品用50M全外显子序列捕获(SureSelect Human All Exon 50Mb Kit)

　　实验方法：

　　末端修复

　　在1.5ml的离心管中配置如下试剂

　　25度，30min，65度15min；

　　接头连接

　　在上一步的反应体系中加入如下试剂

　　23度，30min；

　　在上述反应体系中加入100ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，最终纯化PCR产物，溶解至35ul纯水中。

　　双链DNA文库制备

　　PCR反应体系及反应条件如下：

　　在200ul PCR管中配置如下反应体系：

　　按照以下反应条件进行反应：

　　(a).98℃30s

　　(b).98℃30s

　　(c).65℃30s

　　(d).72℃1min

　　(e).重复(b)-(d)步骤3-9次(共4-10循环)

　　(f).72℃5min

　　(g).4℃ 静置

　　得到的PCR产物进行下一步反应

　　双链文库消化

　　采用NEB的lambda外切酶对磷酸化的DNA进行酶切，在上述PCR产物中加入如下试剂：

　　反应条件：37度，30分钟，

　　在上述反应体系中加入60ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，溶解至25ul纯水中，使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。

　　杂交

　　a.用浓缩等方法准备≥3.4μL 100ng/μL的单链DNA文库。

　　b.配制Hybridization Buffer(所有试剂都来自Agilent公司)：

　　c.准备SureSelect Oligo Capture Library Mix(所有试剂都来自Agilent公司)，并于冰上放置：

　　d.于PCR管中加入样品SureSelect-SC的DNA文库，同时加入cotDNA(100ng)2ul和环状封闭oligo2(100uM)2ul,混匀后保持在65℃中。

　　e.按要求将Hybridization Buffer加入到PCR管中，混匀，于65℃(热盖设为105℃)杂交8小时

　　f.杂交后的样品用Dynal磁珠(Invitrogen)吸附样品，并用35μL SureSelect Elution Buffer洗脱捕获后的序列。

　　捕获后PCR扩增：

　　反应条件：

　　(a).98℃2min

　　(b).98℃20s

　　(c).60℃30s

　　(d).72℃30s

　　(e).重复(b)-(d)步骤9-14次(共10-15次)

　　(f).72℃5min

　　(g).4℃ 静置

　　j.在上述反应体系中加入50ul XP beads按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)对产物进行纯化，溶解至25ul纯水中，使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。

　　测序与数据分析：

　　得到的文库经之间合格后到illumina nextseq500平台上机，测序长度PE150,得到的数据比对到人参考基因组，并统计比对率、捕获效率等参数

　　结果：

　　采用环状封闭加单链建库比仅仅采用的环状封闭方法的GC偏好性要小(图6)。

　　表1：环状封闭oligo

　　N*样本INDEX

　　表2：测序接头和扩增引物

　　I*：样本INDEX，

　　Phos#：5端磷酸化

　　在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

　　尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

　　序列表

　　<110>深圳市艾斯基因科技有限公司

　　<120>高通量测序文库的构建方法及其应用

　　<160>6

　　<170>SIPOSequenceListing 1.0

　　<210>1

　　<211>128

　　<212>DNA

　　<213>人工序列(Artificial Sequence)

　　<400>1

　　tctagccttc tcgcagcaca tccctttctc acacacatct agagccacca gcggcatagt60