一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法。
背景技术
2001年利用抽脂术从人的脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。由于从脂肪组织提取干细胞取材容易，且可以把抽脂术中过去扔掉的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来源，故而这方面的研究得到了迅速而深入的开展。目前已证实脂肪组织来源干细胞(ATSCs)能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导转化，可作为多种组织工程的种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。
目前人脂肪干细胞的分离和培养中，人脂肪干细胞的生长速度慢，而且细胞分化严重，无法满足临床研究及日后医用的需求。
发明内容
针对上述问题，本发明的发明人提出了一种人脂肪干细胞的分离培养方法，并基于该方法提出了干细胞库的构建方法。
本发明的第一个方面在于公开一种人脂肪干细胞的分离培养方法，所述方法至少包括脂肪干细胞的原代操作步骤，培养方法使用的培养基由DMEM-F12培养基中添加终浓度为1-20％的胎牛血清、1-100ng/ml的bFGF和1-100ng/ml的EGF制成。
优选的，所述DMEM-F12培养基中的胎牛血清添加终浓度为10％、bFGF为10ng/ml、EGF为10ng/ml。
优选的，所述脂肪原代操作步骤包括破碎、清洗、消化、分离、培养步骤。
优选的，所述脂肪原代操作步骤包括：
破碎，将脂肪组织置于离心管中后用剪刀剪碎，用齿镊剔除肉眼可见的结缔组织，然后离心；
清洗，吸出脂肪，用PBS清洗，清洗后离心，取上层的脂肪层；
消化，用Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化；用与消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化并轻轻吹打；
分离，离心，移除脂肪层及脂肪组织层，吸取下面的细胞，用网筛过滤；
收集滤液于离心管中，离心；
培养，弃去上层脂质层及中间液体层，用所述培养基重悬细胞沉淀后，以1×105～1×107细胞/瓶的密度接种于T75培养瓶中，加入所述培养基，于37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。
优选的，所述脂肪原代操作步骤包括：
破碎，将脂肪组织置于50ml离心管中后用剪刀剪碎，用齿镊剔除肉眼可见的结缔组织，然后1500r/min，离心5min；
清洗，吸出脂肪，用与脂肪组织等量的PBS清洗两次，清洗后1500rpm/min离心5min，每次清洗完毕后吸取上层的脂肪层；
消化，用与脂肪组织等体积的0.15％Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化30min，200r/min；用与消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化并轻轻吹打；
分离，1500rpm/min离心5min，移除脂肪层及脂肪组织层，吸取下面的细胞，用200目网筛过滤；收集滤液于50ml离心管中，1500rpm/min离心5min；
培养，弃去上层脂质层及中间液体层，用所述培养基重悬细胞沉淀后，以1×106细胞/瓶的密度接种于T75培养瓶中，每瓶加入所述培养基10ml，于37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。
优选的，还包括传代操作步骤，所述传代操作步骤包括清洗、消化、清洗、离心、培养步骤；所述传代操作步骤使用的培养基由DMEM-F12培养基中添加终浓度为10％的胎牛血清、10ng/ml的bFGF和10ng/ml的EGF制成。
优选的，所述传代操作步骤包括：
清洗，取原代培养后的细胞培养液，用PBS洗；
消化，加入胰酶，37℃消化；
清洗，细胞悬液用PBS清洗；
离心，合并洗涤液离心；
培养，倒掉上清，用新鲜的所述培养基重悬细胞，细胞接种量为1×105～1×107每瓶，37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。
优选的，所述传代操作步骤包括：
清洗，取原代培养后的细胞培养液10ml，倒出培养液，留2ml作终止液，然后用PBS洗两次，每次5ml；
消化，加入1ml 0.125％胰酶，37℃消化3min，用2ml终止液终止消化；
清洗，将细胞悬液转移到50ml离心管中，用PBS洗瓶两次，每次5ml；离心，洗涤液全部移至50ml离心管中；1500rpm/min离心5min；
培养，倒掉上清，用新鲜的所述培养基重悬细胞，细胞接种量为1×106每T75培养瓶，37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。
本发明的第二个方面在于公开第一个方面所述的人脂肪干细胞的分离培养方法在人脂肪干细胞细胞库的构建中的应用。
本发明的第三个方面在于公开一种人脂肪干细胞细胞库的构建方法，包括第一个方面所述的人脂肪干细胞的分离培养方法。
本发明的有益效果：
本发明的一种人脂肪干细胞的分离培养方法，培养基配方组分简单，分离培养方法中培养时间短，生长速度快，干细胞纯度高，培养过程中没有出现干细胞分化现象。
附图说明
图1为培养3天的原代培养显微镜照片；
A实施例3培养基，B对照例1培养基
图2为培养7天的原代培养显微镜照片；
A实施例3培养基，B对照例1培养基
图3为采用实施例3培养基的传代操作培养显微镜照片；
A培养1天，B培养2天，C培养3天
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种人脂肪干细胞的培养基，DMEM-F12培养基中添加终浓度为1％的胎牛血清、1ng/ml的bFGF和1ng/ml的EGF。
实施例2
一种人脂肪干细胞的培养基，DMEM-F12培养基中添加终浓度为20％的胎牛血清、100ng/ml的bFGF和100ng/ml的EGF。
实施例3
一种人脂肪干细胞的培养基，DMEM-F12培养基中添加终浓度为10％的胎牛血清、10ng/ml的bFGF和10ng/ml的EGF。
实施例4
一种人脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
包括脂肪原代操作步骤，所述脂肪原代操作步骤包括：
破碎，将脂肪组织置于50ml离心管中后用剪刀剪碎，用齿镊剔除肉眼可见的结缔组织，然后1500r/min，离心5min；
清洗，吸出脂肪，用与脂肪组织等量的PBS清洗两次，清洗后1500rpm/min离心5min，每次清洗完毕后吸取上层的脂肪层；
消化，用与脂肪组织等体积的0.15％Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化30min，200r/min；用与消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化并轻轻吹打；
分离，1500rpm/min离心5min，移除脂肪层及脂肪组织层，吸取下面的细胞，用200目网筛过滤；收集滤液于50ml离心管中，1500rpm/min离心5min；
培养，弃去上层脂质层及中间液体层，用培养基重悬细胞沉淀后，以1×106细胞/瓶的密度接种于T75培养瓶中，每瓶加入培养基10ml，于37.5℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。
还包括传代操作步骤，所述传代操作步骤包括：
清洗，取细胞培养液10ml，倒出培养液，留2ml作终止液，然后用PBS洗两次，每次5ml；
消化，加入1ml 0.125％胰酶，37℃消化3min，用2ml终止液终止消化；
清洗，将细胞悬液转移到50ml离心管中，用PBS洗瓶两次，每次5ml；离心，洗涤液全部移至50ml离心管中；1500rpm/min离心5min；
培养，倒掉上清，用新鲜的培养基重悬细胞，细胞接种量为1×106每瓶。37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。
对照例1
一种人脂肪干细胞的培养基，低糖DMEM中添加终浓度为10％的胎牛血清。
实验例一 本发明实施例和对照例的分离培养干细胞的效果评价实验
以实施例1-3、对照例1的培养基，用实施例4的分离培养方法，分离培养人脂肪干细胞。
采用实施例3和对照例1培养基的脂肪原代操作培养3天和7天的结果见图1、图2。采用实施例3培养基的传代操作培养1天、2天、3天的结果见图3。
实验中发现用对照例1培养基培养的细胞难以胰酶消化，两次消化，后一次消化3min后仍有大量细胞残余。细胞的生长速度慢且分化严重，纯度降低。使用实施例2的培养基，培养的细胞状态较好，并且无分化现象。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
