DNA条形码组合物和在微流体装置中原位识别的方法
本申请是一项非临时申请，根据35U.S.C.119(e)要求2016年10月1日提交的美国临时申请号62/403,116；2016年10月1日提交的美国临时申请号62/403,111；2017年2月10日提交的美国临时申请号62/457,399；2017年2月10日提交的美国临时申请号62/457,582；2017年3月13日提交的美国临时申请号62/470,669的优先权，每一个公开内容都通过引用整体并入本文。
背景技术
单个细胞基因组扩增技术和下一代测序方法的出现已经导致我们对单个生物细胞的基因组和转录组进行测序的能力的突破。尽管取得了这些进展，但将基因组和转录组序列与被测序的细胞的特异性表型联系起来仍然非常困难-而且往往是不可能的。如本文进一步所述，在微流体环境中破译条形码(例如DNA条形码)的能力可以将基因组和转录组数据与原始细胞及其表型联系起来。
发明内容
本文描述了与条形码化捕获物体有关的组合物、试剂盒和方法，其可用于从单个细胞或小的细胞克隆群产生条形码化的RNA-seq文库和/或基因组DNA文库，并且将从文库获得的序列回溯到个体细胞/克隆群。该方法在微流体装置中进行，该装置具有包含一个或多个隔离坞的外壳。该方法的一个优点是细胞可以选择性地置于在微流体装置中的相应的隔离坞中，并且可以在加工用于基因组和/或转录组测序之前观察它们的表型。条形码化捕获物体和相关方法的关键特征是条形码既可以在微流体装置中原位“读取”，也可以在从基因组/转录组文库获得的序列读数中“读取”，从而将基因组/转录组数据与观察到的源细胞表型联系起来。
在一个方面，提供了捕获物体。捕获物体包含至少两个(例如，多个)与固体支持体(例如珠子)共价连接的捕获寡核苷酸，每个捕获寡核苷酸均具有条形码序列、引发序列和捕获序列。使用卡式(cassetable)寡核苷酸序列设计条形码序列，卡式寡核苷酸序列形成一组不同的寡核苷酸序列(也称为“子条形码”序列或“单词”)。将卡式寡核苷酸序列的独特组合连接在一起以形成独特的条形码序列(或“句子”)。因为可以使用标记的(例如，荧光标记的)探针单个解码卡式寡核苷酸序列，所以与该组卡式寡核苷酸序列互补的一组杂交探针足以原位识别卡式寡核苷酸序列的所有可能组合，因此识别可以从该组卡式寡核苷酸序列产生的所有可能的条形码序列。
在另一方面，提供了用于在微流体装置中原位识别捕获物体以及用于基因组/转录组数据与生物微物体关联的方法。该方法涉及将捕获物体(其可以如上文或本文其他地方所述)置于微流体装置中，并使用一组互补杂交探针原位识别/解码捕获物体的捕获寡核苷酸的条形码序列。在其中进行原位识别的微流体装置包括外壳，该外壳包括流动区域和流体连接到流动区域的多个隔离坞，且将捕获物体置于其中一个隔离坞中。多个隔离坞中的每一个均可以容纳至少一个生物微物体和至少一个捕获物体。
可以通过使包含探针的溶液流入装置的流动区域，将包含与条形码的卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列的一种或多种杂交探针引入隔离坞。这些可以包含标记(例如荧光标记)的杂交探针退火到其捕获寡核苷酸的条形码序列内的靶互补序列(即，相应的卡式寡核苷酸序列)，从而使得由于探针/卡式寡核苷酸序列互补性而通过观察到的标记(例如，荧光)破译条形码珠子。捕获物体条形码的识别可以在从生物微物体捕获核酸的过程和核酸文库制备过程期间的各个点进行。可以在将来自一个生物微物体的核酸捕获到捕获寡核苷酸之前或之后或在转录/逆转录之后进行识别过程。或者，可以在将生物微物体置于微流体装置的隔离坞中之前进行捕获物体的识别。可以利用包括图像获取单元的系统来进行解码过程。
在某些实施方案中，在将捕获物体置于隔离坞中之前或之后，可以将许多生物微物体(例如，单个细胞或克隆群)在隔离坞中显露。可以确定性地设置引入隔离坞的捕获物体和生物微物体的数量。例如，单个捕获物体和单个生物微物体可以置于单个隔离坞中，单个捕获物体和生物细胞克隆群可以置于单个隔离坞中，或者多个捕获物体和一个或多个生物微物体可以置于单个隔离坞中。在引入隔离坞之前，可以标注生物微物体的源群。
在生物微物体在隔离坞中裂解后，捕获物体可捕获释放的核酸。条形码通过不同的机制(如逆转录，任选地与PCR偶联(RT-PCR))共价结合/引入捕获的核酸的转录物/基因组DNA片段内。条形码化转录物可以进一步加工并随后测序。可以破译基因组数据和相关条形码以允许特定源隔离坞之间的匹配，从而匹配至源生物微物体和其表型。
识别捕获寡核苷酸的条形码以及由此在特定位置处的捕获物体的过程可以是自动化过程。本文描述的图像获取单元可以进一步包括成像元件，该成像元件被配置为捕获多个隔离坞以及微流体装置的流动区域的一个或多个图像。该系统还可以包括可通信地连接到图像获取单元的图像处理单元。图像处理单元可以包括关注区域确定引擎，其被配置为接收每个捕获的图像并定义图像中描绘的每个隔离坞的关注区域。图像处理单元还可以包括评分引擎，其被配置为分析每个隔离坞的关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示在每个隔离坞中特定微物体和由与其相关的标记杂交探针产生的任何相关信号的存在。微流体装置还可包括至少一个涂覆表面。在该方法的一些实施方案中，微流体装置的外壳可包括至少一个条件化的表面，其可包含与其共价结合的分子，例如亲水聚合物和/或阴离子聚合物。
在另一方面，提供了一种提供来自生物细胞的条形码化cDNA文库的方法，包括：将生物细胞置于位于微流体装置外壳内的隔离坞中；将捕获物体置于隔离坞中，其中捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸的每一个均包括：结合引物的引发序列；捕获序列；和条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列不同；裂解生物细胞并使从裂解的生物细胞释放的核酸被捕获物体所包含的多个捕获寡核苷酸捕获；并转录捕获的核酸，从而产生多个位于(decorating)捕获物体的条形码化cDNA，每个条形码化cDNA均包括(i)与捕获的核酸中的相应一个互补的寡核苷酸序列，其共价连接到(ii)多个捕获寡核苷酸中的一个。
在一些实施方案中，基因特异性引物序列可以靶向编码T细胞受体(TCR)的mRNA序列。在其他实施方案中，基因特异性引物序列可以靶向编码B细胞受体(BCR)的mRNA序列。
在一些实施方案中，该方法还可以包括：原位识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列，同时捕获物体位于隔离坞中。在一些其他的实施方案中，该方法还可以包括从所述微流体装置输出所述捕获物体或所述多个所述捕获物体。
在各种实施方案中，微流体装置的外壳还可以包括介电电泳(DEP)配置，并且其中通过在生物细胞和/或捕获物体上或其附近施加介电电泳(DEP)力来放置生物细胞和/或放置捕获物体。
然后可以输出带有条形码cDNA的捕获物体用于进一步的文库制备和测序。可以对条形码和cDNA进行测序，并且可以将基因组数据与源隔离坞编号和单个细胞/集落匹配。该过程也可以通过如本文所述的自动化过程在微流体装置内进行。
在另一方面，提供了一种提供来自生物微物体的条形码化基因组DNA文库的方法，包括将包括基因组DNA的生物微物体置于位于微流体装置外壳内的隔离坞中；使生物微物体与能够破坏生物微物体的核被膜的裂解试剂接触，从而释放生物微物体的基因组DNA；标记释放的基因组DNA，从而产生多个标记的基因组DNA片段，其具有由第一标记插入序列限定的第一末端和由第二标记插入序列限定的第二末端；将捕获物体置于隔离坞中，其中捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸的每一个均包括：第一引发序列；第一标记插入捕获序列；和条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列不同；将多个标记的(tagmented)基因组DNA片段中的一个(ones)与(i)捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的一个的第一标记(tagmentation)插入捕获序列、(ii)包含与第二标记插入捕获序列、随机引物序列或基因特异性引物序列连接的第二引发序列的扩增寡核苷酸和(iii)包含链置换酶和聚合酶的酶混合物接触；将接触的多个标记的基因组DNA片段孵育一段时间，从而同时扩增多个标记的基因组DNA片段中的一个，并将捕获寡核苷酸和扩增寡核苷酸添加到多个标记的基因组DNA片段中的一个的末端，以产生条形码化基因组DNA文库；并从微流体装置输出条形码化基因组DNA文库。
在一些实施方案中，标记可包括使释放的基因组DNA与载有(i)包含第一标记插入序列的第一双链DNA片段和(ii)包含第二标记插入序列的第二双链DNA片段的转座酶接触。
在一些实施方案中，第一双链DNA片段可包括与第三引发序列连接的第一拼接末端序列(mosaic end sequence)，并且其中第二双链DNA片段可包括与第四引发序列连接的第二拼接末端序列。
在一些实施方案中，该方法还可以包括：原位识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列，同时捕获物体位于隔离坞中。
在各种实施方案中，微流体装置的外壳还包括介电电泳(DEP)配置，并且其中通过在生物体和/或捕获物体上或其附近施加介电电泳(DEP)力来放置生物微物体和/或放置捕获物体。
在另一方面，提供了一种提供来自单个生物细胞的条形码化cDNA文库和条形码化基因组DNA文库的方法，包括：将生物细胞置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；将第一捕获物体置于隔离坞中，其中第一捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含：第一引发序列；第一捕获序列；和第一条形码序列，其中第一条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与第一条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列不同；通过进行如本文所述的获得cDNA文库的任何方法获得条形码化cDNA文库，其中裂解生物细胞以使生物细胞的质膜降解，从生物细胞释放胞质RNA，同时使生物细胞的核被膜保持完整，从而提供带有来自生物细胞的RNA的条形码化cDNA文库的第一捕获物体；从微流体装置输出带有cDNA文库的第一捕获物体；将第二捕获物体置于隔离坞中，其中第二捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，每个捕获寡核苷酸均包括：第二引发序列；第一标记插入捕获序列；和第二条形码序列，其中第二条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与第二条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列不同；通过进行如本文所述的获得条形码化基因组DNA文库的任何方法获得条形码化基因组DNA文库，其中来自生物细胞的多个标记的基因组DNA片段与第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的一个的第一标记插入捕获序列接触，从而提供来自生物细胞的基因组DNA的条形码化基因组DNA文库；并从微流体装置输出条形码化基因组DNA文库。
在一些实施方案中，该方法还可以包括：识别第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，可以在将生物细胞置于隔离坞中之前；在从生物细胞的RNA获得条形码化cDNA文库之前；或者在从微流体装置输出带有条形码化cDNA文库的第一捕获物体之前，识别第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，该方法还可以包括：识别第二捕获物体的多个寡核苷酸的条形码序列。
在另一方面，提供了一种提供条形码化B细胞受体(BCR)测序文库的方法，包括：从B淋巴细胞产生条形码化cDNA文库，其中根据如本文所述的产生条形码化cDNA的任何方法进行产生，其中条形码化cDNA文库置于(decorates)包含多个捕获寡核苷酸的捕获物体上，多个捕获寡核苷酸的每一个均包括Not1限制性位点序列；扩增条形码化cDNA文库；从条形码化cDNA文库中选择条形码化BCR序列，从而产生富含条形码化BCR序列的文库；环化来自富含条形码化BCR序列的文库的序列，从而产生环化的条形码化BCR序列文库；使环化的条形码化BCR序列文库重新线性化以提供重排的条形码化BCR序列的文库，每个BCR序列均将BCR序列3’的恒定(C)区呈递到各自的可变(V)子区和/或各自的多样性(D)子区；并且，添加测序接头并对V子区和/或D子区进行亚选择，从而产生条形码化BCR测序文库。
在各种实施方案中，该方法还可以包括：使用如本文所述的原位识别条形码的任何方法识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，可以在扩增条形码化cDNA文库之前进行识别。在其他实施方案中，可以在产生条形码化cDNA文库的同时进行识别。
附图的简要说明
图1A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的示例。
图1B和1C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。
图2A和2B示出了根据本公开的一些实施方案的分离坞。
图2C示出了根据本公开的一些实施方案的详细的隔离坞。
图2D-F示出了根据本公开的一些其他实施方案的隔离坞。
图2G示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置。
图2H示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置的经涂覆的表面。
图3A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的具体示例。
图3B示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。
图4A示出了捕获物体的原位可检测条形码序列与来自生物细胞的核酸的测序数据之间的关系，其中核酸在微流体环境中被捕获并在输出后测序。
图4B是根据本公开的一个实施方案使用捕获物体的原位可检测条形码序列的可能的多种核酸工作流程的示意图。
图5是本公开的捕获物体的捕获寡核苷酸的实施方案的示意图。
图6是本公开的捕获物体的捕获寡核苷酸的实施方案的示意图，其具有由形成条形码序列的卡式序列的不同组合产生的10,000的条形码多样性。
图7A是根据本公开的一个实施方案的用于原位检测捕获物体的条形码的方法的示意图。
图7B和7C是根据本公开的一个实施方案的原位检测捕获物体的条形码序列的方法的照片图示。
图8A-C是根据本公开的另一实施方案的原位检测捕获物体的条形码序列的方法的示意图。
图8D-8F是根据本公开的另一个实施方案的原位检测捕获物体的条形码序列的两个或更多个卡式寡核苷酸序列的方法的照片图示。
图9示出了根据本公开的一个实施方案的用于单个细胞RNA捕获、文库制备和测序的工作流程的示意图。
图10A-10D是根据本公开的一个实施方案的用于裂解外细胞膜并随后进行RNA捕获的方法的一个实施方案的照片图示。
图11A是根据本公开的一个实施方案的提供RNA文库的部分工作流程的示意图。
图11B和11C是根据本公开的一个实施方案的测序文库质量分析的图示。
图12A-12F是根据本公开的一个实施方案的用于单个细胞裂解、DNA文库制备和测序的工作流程的图示。
图12G是单个细胞DNA文库制备的示意图。
图13A和13B是单个细胞B细胞受体(BCR)捕获、文库制备和测序的工作流程的示意图。
图14A是根据本公开的原位检测捕获物体的条形码序列的方法的实施方案的照片图示。
图14B是根据本公开的一个实施方案的带有cDNA的捕获物体的输出的照片图示。
图14C和14D是根据本公开的一个实施方案的测序文库质量分析的图示。
图15A和15B是来自通过本公开的一个实施方案制备的文库的测序读数的图示。
图16A-16D是从根据本公开的一个实施方案制备的cDNA测序文库获得的测序结果的图示。
图17是测试捕获物体递送随机化的跨实验检测的条形码序列组的差异的图示。
图18是根据本公开的方法的实施方案的每个实验的条形码序列读数的恢复的图示。
图19是本公开的一个实施方案中微流体装置内的T细胞的照片图示。
图20A和20B是根据本公开的一个实施方案的培养、抗原染色和原位条形码序列检测期间特定细胞的照片图示。
图21A和21B是根据本公开的一个实施方案的培养、抗原染色和原位条形码序列检测期间特定细胞的照片图示。
图22A和22B是根据本公开的一个实施方案的培养、抗原染色和原位条形码序列检测期间特定细胞的照片图示。
图23是根据本公开的一个实施方案的活化细胞、活化抗原阳性细胞和活化抗原阴性细胞的测序结果的图示。
图24是根据本公开的一个实施方案的基本上单独分布的细胞的照片图示。
图25是根据本公开的一个实施方案的裂解和释放核DNA的方法的照片图示。
图26A和26B是根据本公开的一个实施方案在裂解之前和之后染色细胞的照片图示。
图27是根据本公开的一个实施方案的测序文库中基因组DNA分布的图示。
图28是根据本公开的一个实施方案的样品基因组DNA中染色体的预期长度并且还包括对每个染色体观察到的实验覆盖率的图示。
图29A-29D是根据本公开的一个实施方案的基因组DNA文库质量的图示。
图30A-30F是根据本公开的一个实施方案从单个细胞获得RNA和基因组DNA测序文库的方法的照片图示。
图31A和31B是根据本公开的一个实施方案的检测捕获物体上的条形码序列的方法的照片图示。
图32是根据本公开的一个实施方案的原位确定的条形码序列与确定条形码和基因组数据的测序结果之间的关联的图示。
本发明的详细描述
本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。
在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸都位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于平行于微流体装置的衬底和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(例如通道或通路)的横截面积可以参考x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。
如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。
术语“一”意味着不止一个。
如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
如本文所用，μm是指微米，μm3是指立方微米，pL是指皮升，nL是指纳升，并且μL(或uL)是指微升。
如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”；并且术语“置于”在其含义内包括“放置”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞；以及至少一个端口，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括流动区域(该流动路径可以包括微流体通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。
如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。
微流体装置或纳米流体装置在本文中可称为“微流体芯片”或“芯片”；或“纳米流体芯片”或“芯片”。
如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括其间的任何值。在一些实施方案中，水平尺寸为约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)，并且垂直尺寸为约25微米至约200微米(例如，约40到约150微米)。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的实例公开在美国专利6,408,878和9,227,200中，其每一篇均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体隔离坞的连接区域和分离区域。
如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如本公开的微流体隔离坞的分离区域和连接区域之间的界面处。
如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。
如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和/或处理的任何微物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附接于细胞的微珠、脂质体涂覆的微珠、脂质体涂覆的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价附接的部分/分子，例如可检测标记、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如Ritchie等人(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins inPhospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中。
如本文所用，术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。“生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报告细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。
如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单亲细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。
如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。
如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。
流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文所用，“捕获部分”是为微物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。所选类型的微物体可以识别原位产生的捕获部分，并且可以与原位产生的捕获部分结合或与其具有亲和力。非限制性实例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。
如本文所用，“B”用于表示单核苷酸，是选自G(鸟苷)、C(胞苷)和T(胸苷)核苷酸的核苷酸，但不包括A(腺嘌呤)。
如本文所用，“H”用于表示单核苷酸，是选自A、C和T的核苷酸，但不包括G。
如本文所用，“D”用于表示单核苷酸，是选自A、G和T的核苷酸，但不包括C。
如本文所用，“V”用于表示单核苷酸，是选自A、G和C的核苷酸，并且不包括T。
如本文所用，“N”用于表示单核苷酸，是选自A、C、G和T的核苷酸。
如本文所用，“S”用于表示单核苷酸，是选自G和C的核苷酸。
如本文所用，“Y”用于表示单核苷酸，是选自C和T的核苷酸。
如本文所用，A、C、T、G后跟“*”表示该核苷酸的磷酸键中的硫代磷酸酯取代。
如本文所用，IsoG是异鸟苷；IsoC是异胞苷；IsodG是异鸟苷脱氧核糖核苷酸，且IsodC是异胞苷脱氧核糖核苷酸。每个异鸟苷和异胞苷核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸含有分别与鸟嘌呤核碱基或胞嘧啶核碱基异构的核碱基，其通常掺入RNA或DNA中。
如本文所用，rG表示包含在核酸内的核糖核苷酸，其它情况下含有脱氧核糖核苷酸。含有所有核糖核苷酸的核酸可以不包括标记以指示每个核苷酸是核糖核苷酸，但是通过上下文其是清楚的。
如本文所用，“引发序列”是寡核苷酸序列，其是较大寡核苷酸的一部分，并且当与较大寡核苷酸分离使得引发序列包括游离3'末端时，可以作为DNA(或RNA)聚合反应中的引物。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，且包括多克隆和单克隆抗体两者；灵长类化的(primatized)(例如，人化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以天然存在或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用，“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出通过例如掺入半乳糖残留物而促进清除和摄取的结构特征。这包括例如F(ab)、F(ab)'2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)及其组合。
如本文所提及的，抗原是可以与另一分子(例如Ag特异性受体)特异性结合的分子或其部分。抗原可能能够在生物体(例如哺乳动物，(例如人、小鼠、大鼠、兔等))内诱导免疫应答，尽管抗原可能不足以自身诱导这种免疫应答。抗原可以是分子的任何部分，例如构象表位或线性分子片段，并且通常可以被适应性免疫系统的高度可变抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别。抗原可包括肽、多糖或脂质。抗原的特征在于其结合抗体可变Fab区的能力。不同的抗体具有区分抗原表面上存在的不同表位的潜力，其结构可以通过半抗原的存在来调节，所述半抗原可以是小分子。
在一些实施方案中，抗原是癌细胞相关抗原。癌细胞相关抗原可以是简单的或复杂的；抗原可以是蛋白质、碳水化合物基团或链，除蛋白质或碳水化合物之外的生物或化学试剂上的表位，或其任何组合；表位可以是线性的或构象的。
与其在正常细胞上的表达相比，癌细胞相关抗原可以是唯一识别癌细胞(例如，一种或多种特定类型的癌细胞)或在癌细胞上上调的抗原。通常，癌细胞相关抗原存在于癌细胞的表面上，从而确保其可被抗体识别。抗原可以与任何类型的癌细胞相关，包括可以在本领域已知的或本文描述的肿瘤中发现的任何类型的癌细胞。特别地，抗原可以与肺癌、乳腺癌、黑素瘤等相关。如本文所用，术语“与癌细胞相关”，当提及抗原使用时，意指抗原直接由癌细胞产生或由癌细胞和正常细胞之间的相互作用产生。
如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。
短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，关注的分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。
如本文关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过微流体装置时，这些组成处于变化中。
如本文所用，“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定介质流动的轨迹并受介质流动的轨迹影响。因此，流动路径是微流体装置的扫描(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫描(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。
如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流体装置内的限定区域。
微流体(或纳米流体)装置可以包括“扫描”区域和“未扫描”区域。如本文所用，“扫描”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经历介质的流。扫描区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所用，“未扫描”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经历流体的流动。未扫描区域可以流体连接到扫描区域，条件是流体连接被构造成在扫描区域和未扫描区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将未扫描区域与扫描区域中的介质流分离，同时在扫描区域和未扫描区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫描区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是未扫描区域的示例。
在微流体环境中从一个或多个细胞产生gDNA测序文库。通过交叉参考在微流体装置内培养、观察或表型化的细胞的物理位置来产生DNA测序数据是对目前可用的测序策略的高度期望的改进。对gDNA进行测序的原因包括表征细胞DNA内的变异或突变，评估基因编辑事件以及克隆形成能力的过程验证。将测序数据与从其分离DNA的特定细胞相关联的能力以前是不可行的。
本文描述了用于在微流体装置内从细胞产生DNA测序文库的工作流程，其引入了可在微流体装置内原位读取且来自所得的测序数据的条形码序列。在微流体环境中破译条形码的能力允许将基因组数据与细胞表型关联起来。如图4所示，生物细胞410可以置于微流体装置的外壳内的隔离坞405内，并在那里维持并测定。在测定(其可以是但不限于检测细胞表面标志物415的测定)期间，试剂420(例如，其可以是抗体)可以结合细胞表面标志物415并允许检测如此结合时的可检测信号425。通过使用本文所述的用捕获物体430捕获从细胞410释放的核酸的方法，该表型可以与来自该特定生物细胞410的基因组数据关联，捕获物体430包括包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列的条形码序列435。条形码435可以由荧光探针440在本文所述的检测方法中原位检测。捕获到捕获物体430的释放的核酸可用于产生测序文库，其在测序后提供测序数据445，测序数据445包括来自生物细胞405释放的核酸的基因组信息和相关条形码序列435。因此提供了表型和基因组数据之间的关联。此能力提供了进入如图4B所示的概括工作流程的入口。例如，在细胞培养460之前、之后或期间，来自可包括基因编辑450、功能/表型测定或标记测定455的途径的细胞可以使用条形码化捕获珠子470进入关联过程465，然后捕获RNA(475)和/或DNA(480)，并提供RNA-seq 482、T细胞受体(TCR)-seq 484、B细胞受体(BCR)-seq 486；或者关联回源细胞的DNA seq(488)数据。如果细胞是克隆群的一部分，则可导致阳性克隆输出490。
此外，使用本文所述的用于RNA捕获/文库制备和DNA捕获/文库制备的方案，RNA和DNA的测序结果可以从相同的单个细胞获得，并且可以与测序的RNA和DNA的特定单个细胞源在微流体装置内的位置相关联。
本文描述了DNA条形码525，其使用卡式(例如，可变的子单元435a、435b、435c、435d，在一些实施方案中，可以是完全可互换的)子条形码或“单词”来设计，所述卡式子条形码或“单词”使用荧光单独解码，如图5中示意性所示。条形码的检测可以通过使用互补性荧光标记的杂交探针检测四个卡式寡核苷酸序列中的每一个来原位进行。如本文所示，通过与杂交探针440a杂交原位检测卡式寡核苷酸序列435a，杂交探针440a包括荧光团Fluor1。分别地，可以通过杂交探针440b(包括Fluor 2)类似地检测第二卡式寡核苷酸序列435b；可通过具有Fluor 3的杂交探针440c检测第三卡式寡核苷酸序列435c，并且可以通过具有Fluor 4的杂交探针440c检测第四卡式寡核苷酸序列435d。荧光团Fluor 1、Fluor 2、Fluor3和Fluor 4中的每一个都是光谱上可区分的，允许明确识别每个相应的卡式寡核苷酸序列。
在图5所示的方法中，可以将捕获物体430引入到每个隔离坞405，一个捕获物体430/一个条形码525用于一个细胞410/一个细胞集落(未示出)，捕获物体430包括携带多个捕获寡核苷酸的珠子510(显示多个捕获寡核苷酸中的单个捕获寡核苷酸550)，每个捕获寡核苷酸均包括DNA条形码525以及引发序列520。在一些其他的实施方案中，可以将多于一个的捕获物体置于隔离坞中以从检查的生物细胞捕获更大量的核酸。
图5示出了通过捕获物体430捕获裂解时从生物细胞410释放的核酸(释放的核酸可以是RNA 505)的示意图，捕获物体430包括通过连接体515连接到捕获寡核苷酸550的珠子510，捕获寡核苷酸550包括引发序列520、条形码525、任选的独特分子标识符(UMI)525和捕获序列535。在该实例中，条形码525包括四个卡式寡核苷酸序列435a、435b、435c和435d。在该实例中，捕获寡核苷酸的捕获序列535通过与释放的核酸505的Poly A区段杂交来捕获释放的核酸505。
待裂解的细胞可以特异性地导入微流体装置中用于文库制备和测序，或者可以存在于微流体装置内，维持任何所需的时间段。
捕获物体。捕获物体可包括多个捕获寡核苷酸，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：引发序列，其是引物结合序列；捕获序列；和条形码序列，其包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同。在各种实施方案中，捕获物体可包括多个捕获寡核苷酸。每个捕获寡核苷酸均包含5'最末端核苷酸和3'最末端核苷酸。在各种实施方案中，引发序列可以与所述5'最末端核苷酸相邻或包含所述5'最末端核苷酸。在各种实施方案中，捕获序列可以与所述3'最末端核苷酸相邻或包含所述3'最末端核苷酸。通常，条形码序列可位于引发序列的3'和捕获序列的5'。
捕获物体组成。通常，捕获物体的组成使得它易于使用介电电泳(DEP)力(例如负DEP力)进行移动。例如，捕获物体可以是珠子(或类似物体)，其具有包括顺磁性材料、聚合材料和/或玻璃的核。聚合材料可以是聚苯乙烯或可以被官能化以连接捕获寡核苷酸的任何其他塑料材料。可以涂覆捕获物体的核材料以提供将连接体连接到捕获寡核苷酸的合适材料，其可以包括官能化聚合物，尽管其他安排也是可能的。用于将捕获寡核苷酸连接到捕获物体的连接体可以是本领域已知的任何合适的连接体。连接体可以包括烃链，其可以是未取代的或取代的，或被可以提供所需的物理化学性质的官能团如酰胺、醚或酮基中断或不中断。连接体可具有足够的长度以允许通过将酶加工到与连接体连接的捕获寡核苷酸末端附近的引发位点来接近。如本领域已知的，捕获寡核苷酸可以共价或非共价连接至连接体。与连接体的非共价连接的非限制性实例可以是通过生物素/链霉亲和素对。
捕获物体可具有任何合适的尺寸，只要其足够小以通过流动区域的流动通道并进入/离开如本文所述的任何微流体装置的隔离坞。此外，可以选择捕获物体以具有足够大量的与其连接的捕获寡核苷酸，使得可以以足够的量捕获核酸，以产生可用于测序的核酸文库。在一些实施方案中，捕获物体可以是球形或部分球形的珠子，并且具有大于约5微米且小于约40微米的直径。在一些实施方案中，球形或部分球形的珠子的直径可为约5、约7、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24或约26微米。
通常，连接到捕获物体的每个捕获寡核苷酸均具有相同的条形码序列，并且在许多实施方案中，每个捕获物体均具有独特的条形码序列。使用在每个捕获珠子上具有独特条形码的捕获珠子允许唯一地识别放置捕获物体的隔离坞。在多个细胞通常单独地放置在隔离坞中的实验中，多个捕获物体也被递送并放置于被占据的隔离坞中，每个隔离坞一个捕获珠子。多个捕获珠子中的每一个均具有唯一的条形码，并且条形码与微流体装置内存在的任何其他捕获的任何其他条形码不同。结果，隔离坞中的细胞(或在一些实施方案中，多个细胞)将具有并入其测序文库中的独特的条形码标识符。
条形码序列。条形码序列可包括两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列均不同。当条形码序列组中的任何一个条形码序列的n个(例如，三个或更多个)卡式寡核苷酸序列与条形码序列组中的任何其他条形码序列的n'个(例如，三个或更多个)卡式寡核苷酸序列不完全重叠时，该条形码序列与组中的其他条形码序列“不同”；部分重叠(例如，最高n-1)是允许的，只要该组中的每个条形码序列均与该组中的任何其他条形码序列差最少1个卡式寡核苷酸序列。在某些实施方案中，条形码序列由(或基本上由)两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)卡式寡核苷酸序列组成。如本文所用，“卡式寡核苷酸序列”是寡核苷酸序列，其是限定的一组寡核苷酸序列之一(例如，一组12个或更多个寡核苷酸序列)，其中，对于限定组中的每个寡核苷酸序列，互补寡核苷酸序列(其可以是杂交探针的一部分，如本文其他地方所述)基本上不与限定的一组寡核苷酸序列中的任何其他寡核苷酸序列杂交。在某些实施方案中，所有(或基本上全部)的限定组中的寡核苷酸序列将具有相同的长度(或核苷酸数)。例如，限定组中的寡核苷酸序列都可以具有10个核苷酸的长度。然而，其他长度也适用于本发明，范围从约6个核苷酸至约15个核苷酸。因此，例如，对于限定组中的基本上所有寡核苷酸序列，限定组中的每个寡核苷酸序列均可具有6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13核苷酸、14个核苷酸或15个核苷酸的长度。或者，限定组中的每个或基本上所有寡核苷酸序列可具有6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-12、12-14或13-16个核苷酸的长度。
选自限定组的寡核苷酸序列(并因此，在条形码序列中)的每个寡核苷酸序列均可以称为与限定组中的其他寡核苷酸序列(因此，条形码序列)“不同”，因为每个寡核苷酸序列可以基于其独特的核苷酸序列被特异性识别为存在于条形码序列中，其可以通过(i)对条形码序列测序和(ii)与含有与卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列的探针(例如，杂交探针)进行杂交反应来检测。
在一些实施方案中，条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列串联连接而没有任何插入的寡核苷酸序列。在其他的实施方案中，三个或更多个卡式寡核苷酸序列可以在一个卡式寡核苷酸与其相邻的不直接连接的卡式寡核苷酸之间具有一个或多个连接。可以存在三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的任何卡式寡核苷酸序列之间的这种连接以促进通过连接而不是通过全合成进行合成。然而，在各种实施方案中，卡式寡核苷酸的寡核苷酸序列不被任何其他寡核苷酸序列中断，形成一个或多个引发序列、任选的索引序列、任选的独特分子标识符序列或任选的限制性位点，包括但不限于Not1限制性位点序列。
如本文关于卡式寡核苷酸序列及其互补寡核苷酸序列(包括含有全部或部分此类互补寡核苷酸序列的杂交探针)所用，术语“基本上杂交”是指卡式寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交水平高于阈值水平，其中阈值水平大于并且在实验上可区别于互补寡核苷酸序列与限定组的寡核苷酸序列中的任何其他卡式寡核苷酸序列之间的交叉杂交水平。如本领域技术人员将容易理解的，用于确定互补寡核苷酸序列是否与特定卡式寡核苷酸序列实质杂交的阈值取决于许多因素，包括卡式寡核苷酸序列的长度、其中发生杂交反应的溶液组分、发生杂交反应的温度以及用于检测杂交的标记(可以连接于互补寡核苷酸序列)的化学性质。申请人提供了可用于不同的限定组的寡核苷酸序列的示例性条件，但是本领域技术人员可以容易地识别合适的其他条件。
三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均可以选自一组至少12个卡式寡核苷酸序列。例如，该组可以包括至少12、15、16、18、20、21、24、25、27、28、30、32、33、35、36、39、40、42、44、45、48、50、51、52、54、55、56、57、60、63、64、65、66、68、69、70、72、75、76、78、80、81、84、85、87、88、90、92、93、95、96、99、100或更多个，包括任何前述数字之间的任何数字。
表1中所示的一组40个卡式寡核苷酸序列SEQ ID.No.1-40已经被设计用于使用10-mer寡核苷酸的原位检测方法，其在检测期间最佳地允许荧光团探针杂交。区分10mer的至少6个碱基以防止检测方法中的错误退火。该组使用Comai实验室的条形码生成器python脚本设计：(http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/Barcode_generator)，并且对所示序列的进一步选择是基于选择Tm(解链温度)等于或大于28℃的序列。Tm计算使用IDT OligoAnalyzer 3.1(https://www.idtdna.com/calc/analyzer)进行。
表1.用于插入条形码的卡式寡核苷酸序列，和用于其原位检测的杂交探针序列。
在各种实施方案中，条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均具有SEQ ID NO：1-40中任一个的序列，其中三个或更多个卡式寡核苷酸中没有一个是相同的。卡式序列可以以任何顺序呈递在捕获寡核苷酸中；该顺序不会改变原位检测，并且卡式寡核苷酸序列的每个序列可以从测序读数去卷积。在一些实施方案中，条形码序列可具有四个卡式寡核苷酸序列。
在一些实施方案中，条形码的第一卡式寡核苷酸序列具有选自SEQ ID No.1-40的第一子组的序列；条形码的第二卡式序列具有选自SEQ ID No.1-40的第二子组的序列；条形码的第三卡式序列具有选自SEQ ID No.1-40的第三子组的序列；条形码的第四卡式序列具有选自SEQ ID No.1-40的第四子组的序列。
在一些实施方案中，条形码的第一卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：1-10中任一个的序列；条形码的第二卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：11-20中任一个的序列；条形码的第三卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：21-30中任一个的序列；条形码的第四卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：31-40中任一个的序列。在一些实施方案中，当条形码的第一卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：1-10中任一个的序列；条形码的第二卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：11-20中任一个的序列；条形码的第三卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：21-30中任一个的序列；条形码的第四卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：31-40中任一个的序列时，第一、第二、第三和第四卡式寡核苷酸序列中的每一个均沿着捕获寡核苷酸的长度以条形码序列的5'到3'的顺序定位。也就是说，第一卡式寡核苷酸将位于第二卡式寡核苷酸序列的5'端，该序列又位于第三卡式寡核苷酸序列的5'端，该序列位于第四卡式的5'端。这在图6中示意性地示出，其中卡式寡核苷酸序列G1-G10之一位于第一卡式寡核苷酸序列位置；将Y1-Y10序列之一置于第二卡式寡核苷酸序列位置，将R1-R10序列之一置于第三卡式寡核苷酸序列位置，并将B1-B10序列之一置于条形码的第四卡式寡核苷酸序列位置。然而，顺序并不要紧，并且原位检测和确定存在或不存在的测序读数不依赖于呈递的顺序。
捕获序列。捕获物体包括配置成捕获核酸的捕获序列。捕获序列是具有约6至约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸序列通过与从关注细胞释放的核酸杂交来捕获核酸。一个非限制性实例包括polyT序列(具有约30至约40个核苷酸)，其可捕获具有PolyA的RNA片段并在其3'末端与其杂交。polyT序列可在其3'末端进一步含有两个核苷酸VN。捕获寡核苷酸的其他实例包括随机六聚体(“randomer”)，其可以以混合物形式使用以杂交并因此捕获互补核酸。或者，基因特异性序列的互补序列可用于靶向捕获核酸，例如B细胞受体或T细胞受体序列。
在另一个实施方案中，捕获寡核苷酸序列可用于捕获从细胞释放的核酸，其通过经由重组酶/聚合酶指导的链延伸引导可识别的末端序列以有效地“捕获”适当标记的释放的核酸，从而添加测序接头、条形码和索引。如本领域已知的，这种类型的捕获寡核苷酸序列的实例包括拼接末端(ME)序列或其他标记插入序列。拼接末端插入序列是短的寡核苷酸，其易于被转座子识别并且可用于向核酸片段提供引发/标记。用于此目的的合适的寡核苷酸序列可含有约8个核苷酸至约50个核苷酸。在一些实施方案中，ME加上额外的插入序列可以是约33个核苷酸长，并且可以通过使用市售的标记试剂盒(例如Nextera DNA文库制备试剂盒,Illumina,目录号15028212等)插入。在该实施方案中，捕获序列进行的捕获不是杂交事件，而是将捕获寡核苷酸、标记的DNA和对引发序列、条形码序列和任何其他索引、接头或功能位点(例如但不限于Not1限制性位点序列(如下所述))的重组酶/聚合酶机制间的相互作用引导(shepherding)和指导到标记的DNA片段上。引导和指导相互作用提供了与上述使用杂交相互作用以捕获释放的核酸的cDNA产物等同的产物。在两种情况下，从释放的核酸提供增大的核酸片段，其现在至少包括测序接头和条形码，其允许扩增、进一步的测序文库适应和获得测序的条形码和样品核酸读数的能力。
引发序列。捕获物体的捕获寡核苷酸具有引发序列，并且引发序列可以与捕获寡核苷酸的5'最末端核苷酸相邻或包含捕获寡核苷酸的5'最末端核苷酸。引发序列可以是通用序列或序列特异性引发序列。引发序列可以结合引物，该引物在结合时引发逆转录酶或聚合酶。在一些实施方案中，通用引发序列可以结合P7(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3'(SEQ ID.NO107))或P5(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3'(SEQ ID NO.108))引物。
在其他实施方案中，通用引发序列可结合具有以下之一的序列的引物：
5’-Me-isodC//Me-isodG//Me-isodC/ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrGrG-3’(SEQID.NO.103)；
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID.NO.104)；
5’-/5Biosg/ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3’(SEQ ID.NO.105)；
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC C*G*A*T*C*T-3’(SEQ ID NO.106)；
5’-/5生物素TEG/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGG-GCTCG*G-3’(SEQ ID No.109)；
5’/5生物素TEG/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTG-GGCTCG*G-3’(SEQ ID NO.110；和
5’-/5生物素TEG/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTG-GGCTCG*G(SEQID NO.111)。
额外的引发和/或接头序列。捕获寡核苷酸可任选地具有一个或多个额外的引发/接头序列，其提供引物延伸的着陆位点或用于固定到大规模平行测序阵列或测序芯片(flow cell)内的互补杂交锚定位点的位点。
任选的寡核苷酸序列。多个捕获寡核苷酸中的每个捕获寡核苷酸均可任选地进一步包括独特的分子标识符(UMI)序列。多个捕获寡核苷酸中的每一个均可以具有与捕获物体的其他捕获寡核苷酸不同的UMI，允许识别与扩增序列的数量相对的独特捕获物。在一些实施方案中，UMI可位于引发序列的3'端和捕获序列的5'端。UMI序列可以是具有约5至约20个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，UMI序列的寡核苷酸序列可具有约10个核苷酸。
在一些实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的每一个还可以包括Not1限制性位点序列(GCGGCCGC，SEQ ID NO.160)。Not1限制性位点序列可以位于捕获寡核苷酸的捕获序列的5'端。在一些实施方案中，Not1限制性位点序列可位于捕获寡核苷酸的条形码序列的3'端。
在其他实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的每一个还可以包括额外的索引，例如库索引序列。索引序列是4到10个寡核苷酸的序列，其独特地识别属于一个实验的一组捕获物体，允许组合来自几个不同实验的测序文库的多路测序以节省测序运行成本和时间，同时仍然允许测序数据的去卷积，并使相关性返回到正确的实验和其中相关的捕获物体。
表2中示出了一些示例性但非限制性的捕获物体，其中为清楚起见仅示出了一种捕获寡核苷酸。包括引发序列、条形码、UMI和用于捕获RNA的捕获序列的捕获物体可以是具有SEQ ID No.97、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99或SEQ ID No.100的捕获物体。包含引发序列、条形码、UMI、Not1序列和用于捕获RNA的捕获序列的捕获物体可以是具有SEQ IDNO.101或SEQ ID NO.102的捕获物体。
表2.示例性捕获物体。
多个捕获物体。提供多个捕获物体用于多路核酸捕获。多个捕获物体中的每一个均是根据本文描述的任何捕获物体的捕获物体，其中，对于多个捕获物体中的每一个，该捕获物体的每个捕获寡核苷酸均具有相同的条形码序列，并且其中多个捕获物体的每一个的捕获寡核苷酸的条形码序列与多个捕获物体的任何其他捕获物体的捕获寡核苷酸的条形码序列不同。在一些实施方案中，多个捕获物体可包括至少256个捕获物体。在其他实施方案中，多个捕获物体可包括至少10,000个捕获物体。图6中示出了显示多个捕获物体的构造的示意图。捕获物体630具有珠子510，捕获寡核苷酸550经由连接体515连接到珠子510。连接体515连接到捕获寡核苷酸550的5'末端，特别是连接到引发序列520的5'末端。连接体515和引发序列520(此处显示为33bp的长度)对该实例中的所有捕获物体的所有捕获寡核苷酸而言是共同的，但是在其他实施方案中，连接体和/或引发序列对于捕获物体上的不同捕获寡核苷酸可以是不同的，或者可选地，连接体和/或引发序列对于多个捕获物体中的不同捕获物体可以是不同的。捕获寡核苷酸550的捕获序列535位于捕获寡核苷酸550的3'末端或其附近。在该非限制性实例中，捕获序列535显示为PolyT-VN序列，其通常捕获释放的RNA。在一些实施方案中，捕获序列535对多个捕获物体的所有捕获物体630的所有捕获寡核苷酸550是共同的。然而，在其他多个捕获物体中，捕获物体630的多个捕获寡核苷酸550的每个捕获寡核苷酸上的捕获序列535可以不必相同。在该实例中，存在任选的独特分子标识符(UMI)530，其位于捕获序列535的5'端和引发序列520的3'端。在该特定实例中，UMI 530沿捕获寡核苷酸3'端至条形码序列525定位。然而，在其他实施方案中，UMI 530可以位于条形码的5'端。然而，UMI 530位于引发序列520的3'端，以便引入扩增的核酸产物中。在该实例中，UMI 530的长度为10bp。这里显示的UMI 530具有NNNNNNNNNN序列(SEQ.ID NO 84)。通常，UMI 530可以由任何核苷酸的随机组合组成，条件是它与条形码525的任何卡式寡核苷酸序列435a、435b、435c、435d不同，也不与引发序列520相同。在许多实施方案中，UMI被设计为不包括10个T的序列，其将与捕获序列535重叠，如针对这种情况所示。UMI 530对于每个捕获物体630的每个捕获寡核苷酸550是独特的。在一些实施方案中，捕获物体630的每个捕获寡核苷酸550的独特UMI 530可以在多个捕获物体630的不同捕获物体630的捕获寡核苷酸550内使用，因为不同捕获物体630的条形码525可以允许测序读数的去卷积。
捕获寡核苷酸的条形码525在引发序列的3'端，并且含有4个卡式序列435a、435b、435c和435d，它们各自的长度为10bp。单个捕获物体630上的多个捕获寡核苷酸550的每个捕获寡核苷酸均具有相同的条形码525，并且多个捕获物体的条形码525对于多个捕获物体630中的每一个是不同的。每个捕获物体的条形码525的多样性可以如下所述通过从限定组的寡核苷酸中选择卡式寡核苷酸来获得。在该实例中，通过选择四个限定组的寡核苷酸组中每一组的一个，可以制备10,000个不同的条形码，每组寡核苷酸含有10种不同的可能选择。
卡式寡核苷酸序列。提供了在如本文所述的条形码内使用的卡式寡核苷酸序列，并且其可以具有SEQ ID No.1-40中任一个的寡核苷酸序列。
条形码序列。提供在本文所述的捕获物体和方法的捕获寡核苷酸内使用的条形码序列，其中条形码序列可包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，其中条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均具有SEQ ID NO：1-40中任一个的序列，并且其中条形码序列的每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同。条形码序列包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同。在某些实施方案中，条形码序列由(或基本上由)两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)卡式寡核苷酸序列组成。条形码序列的卡式寡核苷酸序列可以如本文其他地方所述。例如，两个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均可以是来自限定组的寡核苷酸序列(例如，一组12个或更多个寡核苷酸序列)中的一个，其中对于限定组中的每个寡核苷酸序列，互补寡核苷酸序列基本上不与限定组中的任何其他寡核苷酸序列杂交。在某些实施方案中，条形码序列中的两个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均可包含6至15个核苷酸(例如，长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸)。在其他实施方案中，两个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个可以由(或基本上由)6至15个核苷酸组成(例如，长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸)。在其他实施方案中，条形码序列中的两个或更多个卡式序列中的每一个均可包含6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14或13-15个核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在具体实施方案中，卡式寡核苷酸序列可以是SEQ ID NO：1-40所限定的组中的任何一个。在一些实施方案中，条形码可包括三个或四个卡式寡核苷酸序列。在各种实施方案中，条形码的三个或四个卡式寡核苷酸序列串联连接而没有任何间隔的寡核苷酸序列。在其他实施方案中，三个或四个卡式寡核苷酸序列中的一个或多个可以使用卡式寡核苷酸序列之间间隔一个、两个或三个核苷酸而连接在一起。当使用连接化学连接卡式寡核苷酸序列时，这是有用的。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸内没有具有其他功能的其他核苷酸序列中断三个或四个卡式寡核苷酸序列的连接。
条形码序列组。提供一组条形码序列，其包括至少64个不同的条形码序列，该组的每个条形码序列均具有根据本文所述的任何条形码的结构。如本文所用，当条形码序列组中的任何一个条形码序列的n个(例如，三个或更多个)卡式寡核苷酸序列不与条形码序列组中的任何其他条形码的n’个(例如，三个或更多个)卡式寡核苷酸序列完全重叠时，该条形码序列与组中的其他条形码序列“不同”；部分重叠(例如，最高n-1)是允许的，只要该组中的每个条形码序列与该组中的任何其他条形码序列差最少1个卡式寡核苷酸序列。在一些实施方案中，该条形码序列组可基本上由64、81、100、125、216、256、343、512、625、729、1000、1296、2401、4096、6561或10,000个条形码序列组成。
杂交探针。还公开了杂交探针，其具有与卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；和可检测标记。可检测标记可以例如是荧光标记，例如但不限于荧光素、花青、罗丹明、苯基吲哚、香豆素或吖啶染料。一些非限制性实例包括Alexa Fluor染料，例如Alexa
杂交条件的进一步细节描述如下，并且技术人员可以确定适合于获得对一系列条形码及其杂交探针对的结合特异性的此类条件的其他变化。
杂交探针。提供了杂交探针，其包括具有SEQ ID NO：41至80(参见表1)中任一个的序列的寡核苷酸序列；和可检测标记。可检测标记可以是罗丹明、花青或荧光素荧光染料标记。在各种实施方案中，杂交探针的寡核苷酸序列基本上由SEQ ID No.41-80中任一个的一个序列组成，并且不具有形成杂交探针的一部分的其他核苷酸。
杂交试剂。提供了杂交试剂，包括多个杂交探针，其中多个杂交探针中的每一个均是如本文所述的杂交探针，并且其中多个杂交探针的每一个均(i)包含与多个杂交探针的任何其他杂交探针的寡核苷酸序列不同的寡核苷酸序列，和(ii)包含可检测标记，所述可检测标记在光谱上可与多个杂交探针中的任何其他杂交探针的可检测标记区分开。还公开了包含多个(例如，2、3、4、5或更多个)杂交探针的试剂。杂交探针可以是本文公开的任何杂交探针。试剂可以是液体，例如溶液。或者，试剂可以是固体，例如冻干粉末。当作为固体提供时，可以添加适当体积的水(或合适的溶液)以产生适于引入到微流体装置的液体试剂。
在一些实施方案中，多个杂交探针由2至4个杂交探针组成。在多个杂交探针的一些实施方案中，所述多个杂交探针中的第一杂交探针包括选自SEQ ID NO：41-80的第一子组的序列和第一可检测标记；且多个杂交探针中的第二杂交探针包括选自SEQ ID NO：41-80的第二子组的序列和与第一可检测标记在光谱上可区分的第二可检测标记，并且其中SEQ ID NO：41-80的第一和第二子组是非重叠子组。
第一杂交探针可包括含有SEQ ID NO：41-80所示序列之一或其子组序列的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，第一杂交探针可包括由(或基本上由)SEQ ID NO：41-80中所示序列之一或其子组序列的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)组成的序列。第二杂交探针可包括含有SEQ ID NO：41-80所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，第二杂交探针可包括由(或基本上由)SEQ ID NO：41-80中所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)组成的序列。第三杂交探针(如果存在)可包括含有SEQ ID NO：41-80所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一和第二杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一和第二杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，第三杂交探针(如果存在)可包括由(或基本上由)SEQ ID NO：41-80中所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一和第二杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一和第二杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)组成的序列。第四杂交探针(如果存在)可包括含有SEQ ID NO：41-80所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一、第二和第三杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一、第二和第三杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，第四杂交探针(如果存在)可包括由(或基本上由)SEQ ID NO：41-80中所示序列之一或其子组序列(例如，不包括第一、第二和第三杂交探针中存在的序列的子组，或者与从其选出第一、第二和第三杂交探针中存在的序列的子组不重叠的子组)的全部或部分(例如，8至10个核苷酸)组成的序列。对于本领域技术人员显而易见的是，试剂可包括第五、第六等杂交探针，其可具有与第一、第二、第三和第四杂交探针类似的性质。
在一些实施方案中，多个第三杂交探针可包括选自SEQ ID NO：41-80的第三子组的序列和与第一和第二可检测标记中的每一个在光谱上可区分的第三可检测标记，其中SEQ ID NO：41-80的第一、第二和第三子组是非重叠子组。
在其他的实施方案中，试剂还可以包括多个第四杂交探针，其中第四杂交探针可以包括选自SEQ ID NO：41-80的第四子组的序列和与第一、第二和第三可检测标记中的每一个在光谱上可区分的第四可检测标记，其中SEQ ID NO：41-80的第一、第二、第三和第四子组是非重叠子组。
在杂交试剂的各种实施方案中，SEQ ID NO：41-80的每个子组可以包括至少10个序列。在杂交试剂的各种实施方案中，第一子组含有SEQ ID NO：41-50，第二子组含有SEQID NO：51-60，第三子组含有SEQ ID NO：61-70，且第四子组含有SEQ ID NO：71-80。
试剂盒。提供了用于检测捕获物体的条形码的卡式寡核苷酸序列的试剂盒，其中所述试剂盒包括如本文所述的多种试剂，其中每种试剂的多个杂交探针形成与多个试剂中每种其他试剂的杂交探针组不重叠的组。在一些实施方案中，试剂盒可包括3、4、5、6、7、8、9或10种试剂。
用于原位识别捕获物体的方法。还提供了一种在微流体装置内原位识别一个或多个捕获物体的方法，该方法包括：
将一个或多个捕获物体的单个捕获物体置于位于微流体装置的外壳内的一个或多个隔离坞中的每一个中，其中每个捕获物体具有多个捕获寡核苷酸，并且其中多个捕获寡核苷酸的每一个均包括：引发序列；捕获序列；和条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同；
将包括第一组杂交探针的第一试剂溶液流入微流体装置的外壳内的流动区域，其中流动区域流体连接到一个或多个隔离坞中的每一个，并且其中第一组的每个杂交探针均具有与被一个或多个捕获物体中任何一个的任何捕获寡核苷酸的任何条形码序列包含的卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，其中第一组中每个杂交探针的互补寡核苷酸序列与第一组中杂交探针的任何其他互补寡核苷酸序列不同；和可检测标记，其选自一组在光谱上可区分的可检测标记，其中第一组中每个杂交探针的可检测标记均不同于第一组杂交探针中任何其他杂交探针的可检测标记；
将第一组的杂交探针与一个或多个捕获物体中任何一个的任何捕获寡核苷酸的任何条形码序列中的相应卡式寡核苷酸序列杂交；
对于第一组杂交探针的每个杂交探针，检测与一个或多个捕获物体中任何一个相关的相应的可检测信号；和
对于置于一个或多个隔离坞中的一个内的每个捕获物体，生成记录，其包括(i)隔离坞在微流体装置的外壳内的位置，以及(ii)第一组杂交探针的每个杂交探针的相应荧光信号与捕获物体的关联或未关联，其中关联和未关联的记录构成将捕获物体与隔离坞联系起来的条形码。
如在此方法中使用的，一个或多个捕获物体可以各自是如本文所述的任何捕获物体。通常，所有条形码序列将具有相同数量的卡式寡核苷酸序列，并且由特定捕获物体包含的多个捕获寡核苷酸的每个捕获寡核苷酸将具有相同的条形码序列。如上所述，每个条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列选自一组不同的卡式寡核苷酸序列。该组卡式寡核苷酸序列可以例如包括12至100个(或更多个)不同的寡核苷酸序列。因此，该组卡式寡核苷酸序列可包含许多卡式寡核苷酸序列，其大于该组在光谱上可区分的标记中可光谱区分标记的数目，该组在光谱上可区分的标记可包括2个或更多(例如，2至5个)在光谱上可区分的标记。
第一组(或后续组)中的杂交探针的数量可以与每个条形码序列中的卡式寡核苷酸的数量相同。但是，这些数字不必相同。例如，第一组(或任何后续组)中的杂交探针的数量可以大于每个条形码序列中的卡式寡核苷酸的数量。
检测每个杂交探针(或标记类别)包括识别第一组杂交探针的每个杂交探针(或标记)的区分光谱特征。此外，检测给定的杂交探针通常需要检测超过与用于检测区别光谱特征的系统(例如，光学系统)相关的背景或阈值水平的区别光谱特征水平。在这种识别之后，任何检测到的标记可以与卡式寡核苷酸序列的存在相关联，该卡式寡核苷酸序列与杂交探针的寡核苷酸序列互补。可检测标记可以例如是荧光标记，例如但不限于荧光素、花青、罗丹明、苯基吲哚、香豆素或吖啶染料。一些非限制性实例包括Alexa Fluor染料，例如Alexa
检测和/或生成记录可以是自动化的，例如，通过控制器。
原位识别的方法还可以包括使包含第n组杂交探针的第n试剂溶液流入微流体装置的流动区域，其中第n组的每个杂交探针均可以包括：与由一个或多个捕获物体中任一个的任何捕获寡核苷酸的任何条形码序列包含的卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，其中第n组中每个杂交探针的互补寡核苷酸序列不同于流入微流体装置的流动区域的第n组杂交探针和任何其他组杂交探针中所述杂交探针的任何其他互补寡核苷酸序列；和可检测标记，其选自一组在光谱可区分的可检测标记，其中第n组中每个杂交探针的可检测标记与第n组杂交探针中任何其他杂交探针的可检测标记不同；
将第n组的杂交探针与一个或多个捕获物体中任何一个的任何捕获寡核苷酸的任何条形码序列中的相应的卡式寡核苷酸序列杂交；
对于第n组杂交探针的每个杂交探针，检测与一个或多个捕获物体中任何一个相关的相应可检测信号；和
对于置于一个或多个隔离坞中的一个内的每个捕获物体，补充以下记录：第n组杂交探针的每个杂交探针的相应可检测信号与捕获物体的关联或不关联，其中n是一组具有{2，...，m}值的正整数，其中m是具有2或更大值的正整数，并且其中对正整数组{2，...，m}中的每个n值，重复上述使第n试剂流入、使第n组杂交探针杂交、检测相应的可检测信号和补充记录的步骤。
在各种实施方案中，m可具有大于或等于3且小于或等于20(例如，大于或等于5且小于或等于15)的值。在一些实施方案中，m可以具有大于或等于8且小于或等于12(例如10)的值。
在各种实施方案中，使第一试剂溶液和/或第n试剂溶液流入流动区域可以进一步包括允许第一试剂溶液和/或第n试剂溶液通过扩散到一个或多个隔离坞中来平衡。
检测与一个或多个捕获物体中的任何一个相关的相应荧光信号可以进一步包括：使没有杂交探针的洗涤溶液流过微流体装置的流动区域；通过将洗涤溶液扩散到一个或多个隔离坞中来平衡，从而允许第一组或第n组中任何一组的未杂交的杂交探针扩散离开一个或多个隔离坞。在一些实施方案中，可以在检测荧光信号之前进行洗涤溶液的流入。
在原位检测方法的一些实施方案中，每个捕获物体的每个捕获寡核苷酸的每个条形码序列可包括三个卡式寡核苷酸序列。在一些实施方案中，第一组杂交探针和第n组杂交探针的每一组可包括三个杂交探针。
在原位检测方法的各种实施方案中，每个捕获物体的每个捕获寡核苷酸的每个条形码序列可包括四个卡式寡核苷酸序列。在一些实施方案中，第一组杂交探针和第n组杂交探针的每一组均包含四个杂交探针。
放置一个或多个捕获物体中的每一个可以包括将一个或多个捕获物体中的每一个置于在微流体装置内的一个或多个隔离坞的分离区域内。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括将一个或多个生物细胞置于微流体装置的一个或多个隔离坞中。在一些实施方案中，一种或多种生物细胞中的每一种可以置于一个或多个隔离坞中的不同的一个中。一个或多个生物细胞可以置于微流体装置的一个或多个隔离坞的分离区域内。在该方法的一些实施方案中，一个或多个生物细胞的至少一个可以置于隔离坞中，该隔离坞具有置于其中的一个或多个捕获物体中的一个。在一些实施方案中，一种或多种生物细胞可以是来自克隆群的多个生物细胞。在该方法的各种实施方案中，可以在放置一个或多个捕获物体之前放置一个或多个生物细胞。
在原位检测方法的各种实施方案中，微流体装置的外壳可以进一步包括介电电泳(DEP)配置，并且可以使用介电电泳(DEP)力将一个或多个捕获物体置于一个或多个隔离坞中。在原位检测方法的各种实施方案中，微流体装置的外壳可进一步包括介电电泳(DEP)配置，并且将一个或多个生物细胞置于一个或多个隔离坞中可以使用介电电泳(DEP)力进行。微流体装置可以是本文公开的任何微流体装置。例如，微流体装置可包括至少一个涂覆表面(例如，共价结合表面)。所述至少一个涂覆表面可包括亲水或带负电荷的涂覆表面。
在原位识别方法的各种实施方案中，每个捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的至少一个可以进一步包括通过捕获序列捕获到其上的靶核酸。
参照图7A，为了更好地理解微流体装置内的捕获物体的原位识别方法，示出了捕获物体430的示意图，其具有包括如本文所述的条形码的捕获寡核苷酸，暴露于包含如本文所述的可检测标记的杂交探针440a的流中。当探针440a与其捕获寡核苷酸的靶卡式寡核苷酸相关联后，在捕获寡核苷酸长度755上形成杂交探针：卡式寡核苷酸序列。这产生了沿着捕获物体730的捕获寡核苷酸的至少一部分具有多个杂交探针:卡式寡核苷酸对的捕获物体。图7B示出了微流体装置内的微流体通道的照片，微流体装置具有通向通道的隔离坞，其中捕获物体(在该照片中未示出)已经置于隔离坞中。另外，虽然通向可见的所有三个通道长度的坞中存在捕获物体，但是仅在最底部通道长度处的隔离坞中放置的捕获物体具有包括探针440a的靶卡式寡核苷酸的条形码。通向最上面的通道或中间通道的隔离坞中的捕获物体在其各自的捕获寡核苷酸上没有卡式寡核苷酸，所述捕获寡核苷酸是探针440a的杂交靶。该照片示出了包括杂交探针440a的试剂流流过流动通道并扩散到隔离坞中的时间点。在整个流动通道和隔离坞中可以看到探针的可检测标记的荧光。在允许试剂流动约20分钟后，如本文所述进行不具有杂交探针440a的洗涤流动。图7B示出了在洗涤流动完成之后，在适于激发探针440a的可检测标记的荧光激发下的相同视场。所见的是通向最底部通道的隔离坞中的捕获物体730，提供了来自在此杂交的杂交探针440a的可检测信号。还可以看到，在荧光照射下，通向最上面和中间通道长度的隔离坞中的其他类别的捕获物体是不可见的。这说明了使用进行识别的杂交探针仅对微流体装置内的靶卡式寡核苷酸序列进行特异性和选择性识别。
图8A-8C示出了多路和多个试剂流(在该实例中具有四个不同的杂交探针)如何可用于识别微流体装置的隔离坞中的每个捕获物体的每个条形码。图8A示出了检测所示的四个隔离坞(坞#84、坞#12、坞#126和坞#260)中的每一个的条形码的示意图，每个坞均具有存在于其中的捕获物体。每个捕获物体均具有独特的条形码，其包括四个卡式寡核苷酸序列。坞#84中的捕获物体具有条形码，其序列为：
GGGGGCCCCCTTTTTTTTTTCCGGCCGGCCAAAAATTTTT(SEQ ID NO.89)。
坞#12中的捕获物体具有条形码，其序列为：
AAAAAAAAAATTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCC(SEQ ID NO.90)。
坞#126中的捕获物体具有条形码，其序列为：
GGGGGCCCCCTTAATTAATTCCGGCCGGCCAAAAATTTTT(SEQ ID91)。
坞#260中的捕获物体具有条形码，其序列为：
GGGGGCCCCCTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCC(SEQ ID No.92)。
第一试剂流820包括具有如下序列和可检测标记的四种杂交探针；第一探针440a-1(对于该图示，序列的选择仅用于解释，并且不表示与PolyT的捕获序列组合使用的探针序列)具有TTTTTTTTTT序列(SEQ ID 85)并具有选自一组四个可区分标记的第一可检测标记(表示为具有图案1的圆圈)；第二探针440b-1，且具有AAAAAAAAAA序列(SEQ ID NO.86)并具有选自可区分标记组的第二可检测标记(表示为具有图案2的圆圈)；第三探针440c-1，其具有CCCCCCCCCC序列(SEQ ID No.87)和有选自可区分标记组的第三可检测标记(表示为具有图案3的圆圈)；和第四探针440d-1，其具有GGGGGGGGGG序列(SEQ ID NO.88)和选自可区分标记组的第四可检测标记(表示为具有图案4的圆圈)。
在允许第一流810扩散到隔离坞中并且探针与任何条形码中存在的任何靶卡式寡核苷酸序列杂交后，用无探针介质冲洗以去除未杂交的探针，同时保留杂交的探针在合适的地方。这通过使用不将杂交探针对与其靶解离的介质来实现，例如使用DPBS或Duplex缓冲液，如下文实验部分所述。在冲洗过量的含有未杂交探针的介质后，用适当的激发波长激发允许检测仍在探针上与其靶杂交的可检测标记。在该实例中，观察到，对于坞#84，观察到第二可区分检测的波长的信号，而没有观察到其他信号。这用坞#84旁边的图案化圆圈标示，表明在流1(810)中观察到图案2。对于坞#12，观察到所有四个可区分检测波长的信号，并用相应的图案1-4表示。对于坞#126，没有观察到可检测到的信号，并且沿着图的圆圈如此标记。最后，坞#260，三个探针440b-1、440c-1和440d-1结合，并且标示观察到的可检测信号，其显示图案2、3和4。
可以看出，并未检测所有卡式寡核苷酸序列，因此如图8B所示，然后进行第二流815。第二流包含四个不同的探针：探针440a-2，其具有CCCCCGGGGG序列(SEQ ID NO.93)并具有可区分标记组的可检测标记1(表示为图案1)；第二探针440b-2，其具有AATTAATTAA序列(SSEQ ID No.94)且具有该组的可检测标记2(表示为图案2)；第三探针440c-2，其具有GGCCGGCCGG序列(SEQ ID No.95)且具有该组的第三可检测标记(表示为图案3)；第四探针440d-2，其具有TTTTTAAAAA序列(SSEQ ID No.96)且具有该组的第四可检测标记(表示为图案4)。
进行使试剂流2(815)流入、允许扩散和结合、冲洗未杂交的探针，然后检测四个可区分波长中的每一个的相同过程。如图8B所示，坞#12没有可检测的信号，因为第二流的探针都没有被配置成与其中的任何卡式序列杂交。此外，已经检测到坞#12中的捕获物体的条形码的所有卡式序列。另外，在这些方法中，应注意，当检测到可检测标记波长通道之一中的信号时，选择的卡式序列仅具有每个可检测信号中的一个并且将不具有重复。可以忽略后续流中该通道中的可检测信号，因为已经检测到结合条形码的卡式寡核苷酸序列的探针。在一些情况下，可以在后续流中观察到信号，但这是来自仍然保持与条形码序列杂交的早期流的探针的结果，而不是与卡式寡核苷酸序列结合的新流动试剂的结果。
返回到对第二流815检测的分析，注意到坞#84中的捕获物体在第一、第三和第四可检测信号波长通道中具有信号，并且用第一、第三和第四图案标示。坞#126中的捕获物体具有所有四个探针结合，因此用第一、第二、第三和第四图案进行标示。坞#260中的捕获物体标示为在第一可检测标记信号波长信道中具有信号，并且用第一图案标示。结果可以如图8C所示，对于第一流810、第二流815、第三流820以及对第x流895的一个，直到已经使用相应的杂交探针测试了整个参考组的卡式序列。
特定隔离坞中捕获物体上的每个条形码的序列可以如所示导出，将检测到的信号图案与每个卡式寡核苷酸的互补序列相匹配，因为杂交探针的序列是已知的。然后，可以如所示分配捕获物体的序列，其中坞#12中捕获物体的条形码通过原位检测方法确定为具有SEQ ID NO.90的序列；坞#84中捕获物体的条形码具有SEQ ID NO.89的序列；坞#126中的捕获物体的条形码具有SEQ ID No.91的序列，并且坞#260中的捕获物体的条形码具有SEQ IDNO.92的序列。
图8D-F示出了另一个实验，显示了同时沿条形码序列杂交和检测多个探针的能力。在该实验中，在使用的杂交探针上使用的染料是Alexa
图8D、8E和8F各自示出了不同波长区域的检测通道(滤光器)。图8D示出了采用200ms曝光的德克萨斯红检测通道，以及已被激发并被检测到的捕获物体830。这证实存在第一杂交探针的Alexa
在各种实施方案中，所用的可检测标记可包括Alexa
将基因组数据与微流体装置中的细胞关联的方法。提供了一种用于将基因组数据与微流体装置中的生物细胞关联的方法，包括：
将捕获物体(可以是单个捕获物体)置于微流体装置的隔离坞中，其中捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：引发序列；捕获序列；条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同；并且其中多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括相同的条形码序列；
原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列并记录所识别的条形码序列和隔离坞之间的关联(即，识别捕获物体在微流体装置内的位置)；
将生物细胞置于隔离坞中；
裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的核酸被捕获物体所包含的多个捕获寡核苷酸捕获；
转录(例如，逆转录)捕获的核酸，从而产生多个(可以是文库)条形码化cDNA，每个条形码化cDNA包括与捕获寡核苷酸之一共价连接的互补捕获的核酸序列；
对转录的核酸和条形码序列进行测序，从而获得与条形码序列的读取序列相关的多个转录核酸的读取序列；
基于读取序列识别条形码序列；和
使用读取序列识别的条形码序列和原位识别的条形码序列将多个转录的核酸的读取序列与隔离坞关联，从而将多个转录的核酸的读取序列与置于隔离坞中的生物细胞关联。
在一些实施方案中，单个生物细胞可以置于隔离坞中并进行上述方法。或者，可以将多于一个生物细胞(例如，来自相同细胞克隆群的一组两个或更多个生物细胞)置于隔离坞中并进行上述方法。
放置捕获物体、识别捕获物体的条形码、放置生物细胞、裂解/转录/测序，以及基于前述方法的读取序列识别条形码序列可以按照它们书写的顺序或其他顺序进行，限制是这些活动的顺序重新排列不违反逻辑顺序(例如，在裂解之前转录，等等)。例如，条形码序列的原位识别可以在将生物细胞引入隔离坞之后、在裂解生物细胞之后或在转录捕获的核酸之后进行。同样地，可以在将至少一个生物细胞引入隔离坞之后进行将捕获物体引入隔离坞的步骤。
在各种实施方案中，将基因组数据与生物细胞关联的方法可以进一步包括观察生物细胞的表型；并且将多个转录的核酸的读取序列与生物细胞的表型关联。该方法可以另外包括观察生物细胞的表型，其中生物细胞是克隆群体的代表；并且将多个转录的核酸的读取序列与生物细胞和克隆群的表型关联。在一些实施方案中，观察生物细胞的表型可包括观察至少一种生物细胞的至少一种物理特征。在其他实施方案中，观察生物细胞的表型可以包括对生物细胞进行测定并观察在测定期间产生的可检测信号。在一些实施方案中，测定可以是蛋白质表达测定。
例如，观察生物细胞的表型可以包括观察当生物细胞与测定试剂相互作用时产生的可检测信号。可检测信号可以是荧光信号。或者，该测定可以基于缺乏可检测信号。可以进行的提供识别关于生物细胞表型的观察结果的可检测信号的测定的其他实例可参见WO2015/061497(Hobbs等人)；US2015/0165436(Chapman等人)；和国际申请系列号PCT/US2017/027795(Lionberger等人)的公开内容，其中每一个公开内容都通过引用整体并入本文。
在各种实施方案中，可以在将生物细胞置于隔离坞中之前进行原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列并记录所识别的条形码序列与隔离坞之间的关联。在一些其他实施方案中，可以在将生物细胞引入隔离坞之后进行原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列并记录所识别的条形码序列与隔离坞之间的关联。
在其他实施方案中，可以在观察生物细胞的表型之后放置捕获物体，并且任选地，原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列并记录所识别的条形码序列和隔离坞之间的关联。在一些实施方案中，可在裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的核酸被捕获物体包含的多个捕获寡核苷酸捕获之后进行原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列并记录所识别的条形码序列与隔离坞之间的关联。在各种实施方案中，原位识别多个捕获寡核苷酸的条形码序列可包括进行如本文所述的方法的任何变体。在将基因组数据与微流体装置中的生物细胞关联的方法的各种实施方案中，捕获物体可以是如本文所述的任何捕获物体。
在该方法的各种实施方案中，微流体装置的外壳可包括介电电泳(DEP)配置，并且将捕获物体置于隔离坞中可包括使用介电电泳(DEP)力来移动捕获物体。在该方法的一些其他实施方案中，微流体装置的外壳可以进一步包括介电电泳(DEP)配置，并且将生物细胞置于隔离坞中可以包括使用介电电泳(DEP)力来移动生物细胞。
在将基因组数据与微流体装置中的生物细胞关联的方法的各种实施方案中，该方法可以进一步包括：将多个捕获物体置于微流体装置的相应的多个隔离坞中(例如，这可以包括每个隔离坞放置单个捕获物体)；将多个生物细胞置于相应的多个隔离坞中，并根据该方法的另外步骤处理多个捕获物体和多个生物细胞中的每一个。
用于产生核酸文库的试剂盒。还提供了用于产生核酸文库的试剂盒，包括：微流体装置，其包括外壳，其中所述外壳包括流动区域和通向流动区域的多个隔离坞；和多个捕获物体，其中所述多个捕获物体中的每一个均包括多个捕获寡核苷酸，所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：捕获序列；和条形码序列，其包含至少三个卡式寡核苷酸序列，其中条形码序列的每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同，并且其中多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含相同的条形码序列。
多个捕获寡核苷酸中的每一个均可包括至少两个卡式寡核苷酸序列(例如，三个、四个、五个或更多个卡式寡核苷酸序列)。卡式寡核苷酸序列可以如本文其他地方所述。例如，卡式寡核苷酸序列可以选自一组不同的卡式寡核苷酸序列。该组可包括12个或更多个(例如，12至100个)不同的卡式寡核苷酸序列。
微流体装置可以是如本文所述的任何微流体装置。在各种实施方案中，微流体装置的外壳可进一步包括介电电泳(DEP)配置。
在用于产生核酸文库的试剂盒的各种实施方案中，多个捕获物体可以是如本文所述的任何多个捕获物体。在一些实施方案中，多个捕获物体中的每一个均可以单独地置于多个隔离坞的相应隔离坞中。
在用于产生核酸文库的试剂盒的各种实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括识别表，其中所述识别表将多个捕获物体中的每一个的多个捕获寡核苷酸的条形码序列与多个隔离坞的相应隔离坞关联。
在用于产生核酸文库的试剂盒的各种实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含：多个杂交探针，其中每个杂交探针均包含：与多个捕获物体中任何一个的多个捕获寡核苷酸的卡式寡核苷酸序列的任何一个互补的寡核苷酸序列；和标记，其中多个杂交探针的每一个的互补序列与不同卡式寡核苷酸序列互补；并且其中多个杂交探针的每一个的标记选自一组在光谱上可区分的标记。在各种实施方案中，所述多个杂交探针的每个互补序列可包括寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：41至80中任一个的序列。在各种实施方案中，标记可以是荧光标记。
用于产生捕获物体的方法。还提供了一种用于产生具有多个捕获寡核苷酸的捕获物体的方法，包括：将多个捕获寡核苷酸中的每一个化学连接至捕获物体，其中多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：引发序列，其与引物结合；捕获序列(例如，配置为与靶核酸杂交)；和条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列不同；并且其中多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含相同的条形码序列。
在各种实施方案中，捕获物体可以是珠子。例如，捕获物体可以是具有核的珠子(或类似物体)，该核包括顺磁性材料、聚合材料和/或玻璃。聚合材料可以是聚苯乙烯或可以被官能化以连接捕获寡核苷酸的任何其他塑料材料。可以涂覆捕获物体的核材料以提供合适将连接体连接到捕获寡核苷酸的材料，其可以包括官能化聚合物，尽管其他安排也是可能的。
在各种实施方案中，连接可包括将多个捕获寡核苷酸中的每一个共价连接到捕获物体。或者，多个捕获寡核苷酸中的每一个可以非共价连接到珠子，其可以经由链霉亲和素/生物素连接体。条形码化的珠子可以以本领域已知的任何合适的方式合成。引发序列/独特分子标识符标签/细胞条形码/引物序列可以通过总寡核苷酸合成、分裂和库合成(pool synthesis)、任何长度的寡核苷酸区段的连接或其任何组合来合成。
多个捕获寡核苷酸中的每一个均可以包括5'最末端核苷酸和3'最末端核苷酸，其中引发序列可以与5'最末端核苷酸相邻或包含5'最末端核苷酸，其中捕获序列可以与3'最末端核苷酸相邻或包含3'最末端核苷酸，并且条形码序列可位于引发序列的3'最末端和捕获序列的5'最末端。
在各种实施方案中，每个条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列可以串联连接而没有任何间隔的寡核苷酸序列。在一些其他的实施方案中，一个或多个卡式寡核苷酸可以通过插入一个或两个核苷酸与另一个卡式寡核苷酸序列连接，以允许通过连接化学来连接。
在各种实施方案中，该方法可以进一步包括：通过分裂和库合成将三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均引入多个捕获寡核苷酸中。
在产生捕获物体的方法的各种实施方案中，每个卡式寡核苷酸序列可包含约6至15个核苷酸，并且可包括约10个核苷酸。
在各种实施方案中，该方法可以进一步包括：从一组12至100个不同的卡式寡核苷酸序列中选择每个条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个。在一些实施方案中，该方法可包括从SEQ ID NO：1-40选择每个条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个。
在一些实施方案中，细胞相关的条形码序列可包括四个卡式寡核苷酸序列。在各种实施方案中，该方法可包括：从SEQ ID NO：1-10中任一个选择第一卡式寡核苷酸序列；从SEQ ID NO：11-20中任一个选择第二卡式寡核苷酸序列；从SEQ ID NO：21-30中任一个选择第三卡式寡核苷酸序列；从SEQ ID NO：31-40中任一个选择第四卡式寡核苷酸序列。
在产生捕获物体的方法的各种实施方案中，当从所述捕获寡核苷酸分离时，引发DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是逆转录酶。在一些实施方案中，引发序列包含P7或P5引物的序列。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：将独特分子标识符(UMI)序列引入多个捕获寡核苷酸中的每一个，使得多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括不同的UMI。UMI可以是包含5至20个核苷酸(例如，8至15个核苷酸)的寡核苷酸序列。
在产生捕获物体的方法的各种实施方案中，捕获序列可包括poly-dT序列、随机六聚体或拼接末端序列。
在产生捕获物体的方法的各种实施方案中，该方法可以进一步包括：在捕获寡核苷酸5'末端附近将引物序列引入多个捕获寡核苷酸的每一个；并且，在捕获寡核苷酸3'末端附近将捕获序列引入多个捕获寡核苷酸的每一个。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：在引入引发序列之后并在引入捕获序列之前，将条形码序列引入多个捕获寡核苷酸中的每一个。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：在引入引发序列之后并在引入捕获序列之前，将UMI引入多个捕获寡核苷酸中的每一个。在其他实施方案中，该方法可以进一步包括：将包含Not1限制性位点的序列引入多个捕获寡核苷酸中的每一个。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：在引入条形码序列之后并在引入捕获序列之前，引入包含Not1限制性位点的序列。
在产生捕获物体的方法的各种实施方案中，该方法可以进一步包括：将一个或多个接头序列引入多个捕获寡核苷酸的每一个。
生成测序文库的方法。基于本文所述的工作流程，可以制备多种测序文库，其允许基因组数据与源细胞的位置以及对该细胞观察到的表型信息关联。此处显示的方法适合于最终与通过合成化学的
RNA捕获和文库制备。此外，提供了一种用于提供来自生物细胞的条形码化cDNA文库的方法，包括：将生物细胞置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；将捕获物体置于隔离坞中，其中捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：引发序列；捕获序列；和条形码序列，其中条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列不同；裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的核酸被捕获物体包含的多个捕获寡核苷酸捕获；和
转录捕获的核酸，从而产生位于捕获物体的多个条形码化cDNA，每个条形码化cDNA均包含(i)与捕获的核酸中相应的一个互补的寡核苷酸序列，其共价连接到(ii)多个捕获寡核苷酸中的一个。捕获物体可以是单个捕获物体。从裂解的生物细胞释放的核酸可以被捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的每一个的捕获序列捕获。在一些实施方案中，转录可包括逆转录。捕获物体和/或生物细胞可以例如置于在隔离坞的分离区域内。
在一些实施方案中，生物细胞可以是免疫细胞，例如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等。在一些实施方案中，生物细胞可以是癌细胞，例如黑素瘤癌细胞、乳腺癌细胞、神经癌细胞等。在其他实施方案中，生物细胞可以是干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)干细胞等)或祖细胞。在其他实施方案中，生物细胞可以是胚胎(例如受精卵，2至200个细胞胚胎、囊胚等)。在各种实施方案中，生物细胞可以是单个生物细胞。或者，生物细胞可以是多个生物细胞，例如克隆群。
在各种实施方案中，放置生物细胞可以进一步包括标记生物细胞(例如，使用用于核酸的标志物，例如Dapi或Hoechst染色剂)。
捕获物体可以是如本文所述的任何捕获物体。
在一些实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的一个或多个(其可以是每个)的捕获序列可以包括oligo-dT引物序列。在其他实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的一个或多个(例如，每个)的捕获序列可包括基因特异性引物序列。在一些实施方案中，基因特异性引物序列可靶向(或可结合)编码T细胞受体(TCR)的mRNA序列(例如，TCRα链或TCRβ链，特别是编码可变区的mRNA区域或位于3'端但靠近可变区的mRNA区域)。在其他实施方案中，基因特异性引物序列可以靶向(或可结合)编码B细胞受体(BCR)的mRNA序列(例如，BCR轻链或BCR重链，特别是编码可变区的mRNA区域或位于3'端但靠近可变区的mRNA区域)。
在各种实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的一个或多个(例如，全部或基本上全部)的捕获序列可以结合到释放的核酸之一并引发释放的核酸，从而允许聚合酶(例如，逆转录酶)转录捕获的核酸。
在各种实施方案中，捕获物体可包括磁性部件(例如，磁珠)。或者，捕获物体可以是非磁性的。
在一些实施方案中，可以在将捕获物体置于隔离坞中之前将生物细胞置于隔离坞中。在一些实施方案中，可以在将生物细胞置于隔离坞中之前将捕获物体置于隔离坞中。
在各种实施方案中，该方法可以进一步包括：原位识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列，同时捕获物体位于隔离坞中。可以使用如本文所述的识别条形码的任何方法来识别条形码。在各种实施方案中，可以在裂解生物细胞之前识别条形码序列。
在一些实施方案中，微流体装置的外壳可包括至少一个涂覆表面。涂覆表面可涂覆有Tris和/或聚合物，例如PEG-PPG嵌段共聚物。在其他实施方案中，微流体装置的外壳可包括至少一个条件化的表面。
至少一个条件化的表面可包括共价结合的亲水部分或带负电荷的部分。共价结合的亲水部分或带负电荷的部分可以是亲水或带负电荷的聚合物。
在各种实施方案中，微流体装置的外壳可进一步包括介电电泳(DEP)配置。可以通过在生物细胞和/或捕获物体上或附近施加介电电泳(DEP)力来放置生物细胞和/或放置捕获物体。
微流体装置还可包括多个隔离坞。在各种实施方案中，该方法可以进一步包括将多个生物细胞置于多个隔离坞中。在各种实施方案中，多个生物细胞可以是克隆群。在各种实施方案中，将多个生物细胞置于多个隔离坞中可以包括将多个生物细胞中的基本上仅一个置于多个隔离坞的相应隔离坞中。因此，具有置于其中的生物细胞的多个隔离坞中的每一个通常将包含单个生物细胞。例如，少于10％、7％、5％、3％或1％的被占据的隔离坞可含有多于一个生物细胞。
在各种实施方案中，该方法还可包括：将多个捕获物体置于多个隔离坞中。在一些实施方案中，将多个捕获物体置于多个隔离坞中可以包括将基本上仅一个捕获物体置于多个隔离坞的相应隔离坞中。在一些实施方案中，可以在裂解生物细胞或多个生物细胞之前将多个捕获物体置于多个隔离坞中。多个捕获物体可以是如本文所述的任何多个捕获物体。
在各种实施方案中，该方法还可包括：从微流体装置输出捕获物体或多个捕获物体。在一些实施方案中，捕获物体或多个捕获物体是带有cDNA的捕获物体。在一些实施方案中，输出多个捕获物体可以包括单独地输出多个捕获物体中的每一个(即，一次一个)。在各种实施方案中，该方法可以进一步包括：将多个捕获物体中的每一个递送到微流体装置外部的单独的目标容器。
在各种实施方案中，以下的一个或多个可以以自动化方式进行：放置生物细胞或多个生物细胞；放置捕获物体或多个捕获物体；裂解生物细胞或多个生物细胞以及允许从裂解的生物细胞或多个生物细胞释放的核酸被捕获；转录；和原位识别捕获物体或多个捕获物体的每一个的条形码序列(如果进行)。
另外，提供了一种用于提供条形码化测序文库的方法，包括：扩增通过本文所述的任何方法获得的捕获物体的cDNA文库或多个捕获物体中的每一个的cDNA文库；并且标记扩增的DNA文库或多个cDNA文库，从而产生一个或多个条形码测序文库。在各种实施方案中，扩增cDNA文库或多个cDNA文库可包括引入库索引序列，其中库索引序列包含4至10个核苷酸。在其他实施方案中，该方法可以进一步包括组合多个条形码化测序文库，其中多个条形码化测序文库中的每一个均包含不同的条形码序列和/或不同的库索引序列。
通过参照图9可以更全面地理解从释放的核酸(例如RNA)获得cDNA的方法，图9是该方法的示意图。对于细胞分离和细胞裂解框902，可以将生物细胞410置于微流体装置内的隔离坞中。可以将捕获物体930(可以被配置为本文所述的任何捕获物体)置于相同的隔离坞中，其可以在将细胞410置于隔离坞之前或之后进行。可以使用裂解试剂裂解细胞410，裂解试剂裂解细胞410的外细胞膜而不裂解核膜，如下文实施例中所述。裂解细胞410'由该过程产生并释放核酸905，例如RNA。捕获物体930的捕获寡核苷酸包括引发序列520和条形码序列525，引物序列520具有5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.104)的序列，并且条形码序列525可以像本文所述的任何条形码一样配置。捕获物体930的捕获寡核苷酸可任选地包括UMI 530。捕获物体930的捕获寡核苷酸包括捕获序列，其在这种情况下包括PolyT序列，其可以捕获在其3'末端具有PolyA序列的释放的核酸905。捕获序列535捕获释放的核酸905。在细胞和分子条形码框904和逆转录框906中，捕获寡核苷酸是释放的核酸905，并且在模板转换寡核苷酸915存在的同时从其逆转录，其序列为/5Me-isodC//isodG//iMe-isodC/ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrGrG(SEQ ID NO.103)。在RNA捕获到条形码化珠子之前、在捕获到珠子上的RNA的逆转录之前或者在珠子上的RNA的逆转录之后可以使用本文所述的任何方法进行条形码912的识别。在一些实施方案中，可以在捕获到珠子的RNA的逆转录之后进行细胞特异性条形码的识别。在实现捕获物体的条形码的逆转录和原位识别之后，将带有cDNA的捕获物体输出到微流体装置外。可以同时输出多个cDNA捕获物体，并使用具5’-/5Biosg/ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3’(SEQ ID NO.105)序列的扩增引物进行合并和cDNA扩增框912(产生DNA扩增子92)。然后对扩增的DNA 920进行修改、尺寸调整和编辑索引框916。这包括单侧标记框914，其将DNA片段化至DNA 925的尺寸并插入标记接头942。虽然本文说明了标记，但该过程也可以通过例如使用片段化酶(NEB，Kapa)的酶促片段化进行，然后进行末端修复。
框0916中还包括库编辑索引框918，其中引物935a和935b对标记的DNA 940起作用。针对标记接头942的第一引物935a引入P7测序接头932，其具有以下序列：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3(SESQ ID NO.107)；
并且还引入了任选的库索引934。具有以下序列的第二引物935b：(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC C*G*A*T*C*T-3(SEQ ID No.106))具有针对引发序列520的部分并引入P5测序接头序列936。可以在测序框922中对尺寸调整的、编辑索引的和修改的测序文库950进行测序，其中第一测序读数955(序列读取起始点)读取条形码525和任选的UMI 539。第二测序读数960读取库索引934。第三测序读数965读取DNA文库本身内所需数量的bp，以产生基因组读数。
图10A-10D是根据本公开的一个实施方案的用于裂解外细胞膜并随后进行RNA捕获的方法的一个实施方案的照片图示。图10A显示了明场图像，其显示了裂解前的捕获物体430和细胞430，每个都置于微流体装置1000内的隔离坞中。图10B示出了在裂解前在相同时间点来自完整细胞410的DAPI染色核的荧光。图10C示出了在完成裂解之后捕获物体930和剩余的未裂解核410'的明场图像。图10D示出了在裂解后在与图10C相同的时间点的荧光图像，显示了来自未破坏的细胞核410'的DAPI荧光，显示细胞核是完整的。
图11A是如图9所示的RNA捕获产生的cDNA的加工示意图，其在微流体环境外进行，包括cDNA扩增框912、单侧标记盒914、库编辑索引框918和测序框922，以及一些质量分析。在cDNA扩增框912之后的QC显示了图11B中扩增的DNA 920，显示了具有大量尺寸为700至大于1000bp的产物的尺寸分布。在标记步骤完成后，条形码化文库中所得片段的尺寸分布显示在图11C中，并且在300-800bp内，这对于合成测序方案是最佳的。通过Qubit测量的定量显示从单个细胞获得约1.160ng/微升的条形码化DNA样品。对于测序运行，合并来自约100个单个细胞的单独条形码化的材料以进行测序运行，从而为约100个单个细胞中的每一个提供测序数据。
该工作流程还可以通过加工上文获得的条形码化cDNA而适应PacBio文库制备(SMRT系统，Pacific Biosystems)，并且SMRTbell接头可以直接连接到全长条形码化转录物。
DNA捕获和测序文库的生成。此外，提供了一种用于提供来自生物微物体的条形码化基因组DNA文库的方法，包括将包含基因组DNA的生物微物体置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；使生物微物体与能够破坏生物微物体的核被膜的裂解试剂接触，从而释放生物微物体的基因组DNA；标记释放的基因组DNA，从而产生多个标记的基因组DNA片段，其具有由第一标记插入序列限定的第一末端和由第二标记插入序列定义的第二末端；将捕获物体置于隔离坞中，其中捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含：第一引发序列；第一标记插入捕获序列；和条形码序列，其中条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列不同；使多个标记的基因组DNA片段中的一个与(i)捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的一个的第一标记插入捕获序列、(ii)包含与第二标记插入序列、随机引物序列或基因特异性引物序列连接的第二引发序列的扩增寡核苷酸和(iii)包含链置换酶和聚合酶的酶混合物接触；将接触的多个标记的基因组DNA片段孵育一段时间，从而同时扩增多个标记的基因组DNA片段中的一个，并将捕获寡核苷酸和扩增寡核苷酸添加到多个标记的基因组DNA片段的一个的末端，以产生条形码化基因组DNA文库；并从微流体装置输出条形码化基因组DNA文库。
在一些实施方案中，基因组DNA可包括线粒体DNA。
在各种实施方案中，可以在标记步骤之前或之后将捕获物体置于隔离坞中。在各种实施方案中，孵育可以在等温条件下进行(例如，约30℃至约45℃，通常约37℃)。
输出可以包括允许扩增的基因组DNA从隔离坞扩散到与隔离坞连接的流动区域(例如，通道)中，然后使介质(例如，扩增缓冲液、输出缓冲液等)流动通过流动区域，从微流体装置离开，并进入适当的容器(例如，孔板的孔、管，例如微量离心管等)。
在一些实施方案中，可以在将捕获物体置于隔离坞中之前将生物微物体置于隔离坞中。
在一些实施方案中，生物微物体可以是生物细胞。在其他实施方案中，生物微物体可以是生物细胞(例如，真核细胞)的细胞核。
在一些实施方案中，生物细胞是免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等)。在一些实施方案中，生物细胞可以是癌细胞(例如，黑素瘤癌细胞、乳腺癌细胞、神经癌细胞等)。
在一些实施方案中，裂解试剂可包括至少一种核糖核酸酶抑制剂。
在各种实施方案中，标记可包括使释放的基因组DNA与载有(i)包含第一标记插入序列的第一双链DNA片段和(ii)包含第二标记插入序列的第二双链DNA片段的转座酶接触。在一些实施方案中，第一双链DNA片段可包括与第三引发序列连接的第一拼接末端序列，并且第二双链DNA片段可包括与第四引发序列连接的第二拼接末端序列。
在一些实施方案中，捕获物体的每个捕获寡核苷酸的第一标记插入捕获序列可以包括至少部分(或在一些实施方案中，它可以完全)与第一标记插入序列互补的序列。在一些实施方案中，扩增寡核苷酸的第二标记插入捕获序列包含与第二标记插入序列至少部分(或在一些实施方案中，它可以完全)互补的序列。例如，每个捕获寡核苷酸的第一标记插入捕获序列可以与第一标记插入序列的第一拼接末端序列和/或第三引发序列至少部分(例如，完全)互补。在其他实例中，扩增寡核苷酸的第二标记插入捕获序列可以与第二标记插入序列的第二拼接末端序列和/或第四引发序列至少部分(例如，完全)互补。
在各种实施方案中，捕获物体可以是如本文所述的任何捕获物体。在一些实施方案中，捕获物体可包括磁性部件(例如，磁珠)。或者，捕获物体可以是非磁性的。
在提供条形码化基因组DNA文库的方法的各种实施方案中，该方法可以进一步包括：原位识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列，同时捕获物体位于隔离坞中。在一些实施方案中，可以使用如本文所述的任何方法识别条形码序列。在一些其他实施方案中，在裂解生物细胞之前识别条形码序列。或者，可以在标记释放的基因组DNA之前或在输出条形码化基因组DNA文库之后识别条形码序列。
在一些实施方案中，微流体装置的外壳可包括至少一个涂覆表面。涂覆表面可涂覆有Tris和/或聚合物，例如PEG-PPG嵌段共聚物。在一些其他的实施方案中，微流体装置的外壳包括至少一个条件化的表面。如权利要求141所述的方法，其中所述至少一个条件化的表面包含共价结合的亲水部分或带负电荷的部分。在一些实施方案中，共价结合的亲水或带负电荷的部分可以是亲水或带负电荷的聚合物。
在各种实施方案中，微流体装置的外壳可以进一步包括介电电泳(DEP)配置，并且可以通过在生物细胞和/或捕获物体上或附近施加介电电泳(DEP)力来放置生物微物体和/或放置捕获物体。
在一些实施方案中，微流体装置可进一步包括多个隔离坞。在各种实施方案中，该方法还可包括将多个生物微物体置于多个隔离坞中。在一些实施方案中，将多个生物微物体置于多个隔离坞中可以包括将多个生物微物体中的基本上仅一个置于多个隔离坞中的相应隔离坞中。
因此，具有置于其中的生物微物体的多个隔离坞中的每一个通常将包含单个生物微物体。例如，少于10％、7％、5％、3％或1％的被占据的隔离坞可包含多于一个的生物微物体。在一些实施方案中，多个生物微物体可以是生物细胞的克隆群。
在各种实施方案中，该方法还可包括：将多个捕获物体置于多个隔离坞中。在一些实施方案中，将多个捕获物体置于多个隔离坞中可以包括将基本上仅一个捕获物体置于多个隔离坞的相应隔离坞中。在其他实施方案中，可以在裂解生物微物体或多个生物微物体之前将多个捕获物体置于多个隔离坞中。
在一些实施方案中，多个捕获物体可以是如本文所述的任何多个捕获物体。
在各种实施方案中，对于包含多个生物微物体之一的每个隔离坞，标记、接触和孵育的步骤可以基本上同时进行。
在一些实施方案中，以下中的一个或多个可以以自动化方式进行：放置生物微物体或多个生物微物体；放置捕获物体或多个捕获物体；裂解生物微物体或多个生物微物体和允许从裂解的生物细胞或多个生物细胞释放的核酸被捕获；标记释放的基因组DNA；接触多个标记的基因组DNA片段中的几个；孵育接触的多个标记的基因组DNA片段；输出条形码化基因组DNA文库或多个DNA文库；和原位识别捕获物体或多个原位捕获物体的每一个的条形码序列。
在一些实施方案中，该方法还可以包括：从微流体装置输出捕获物体或多个捕获物体。输出多个捕获物体可以包括单独地输出多个捕获物体中的每一个。在一些实施方案中，该方法还可以包括：将多个捕获物体中的每一个递送到微流体装置外的单独目标容器。
通过参考图12A-G和下面的实施例3和4可以更好地理解该方法。图12A-12F示出了用于获得具有如本文所述的原位可检测条形码的测序文库的工作流程。将生物细胞410置于隔离坞405内，隔离坞405通向微流体装置内的微流体通道(未示出)(图12A)。裂解细胞以破坏细胞膜和核膜，并释放基因组DNA 1220，如图12B所示。图12C示出了下一个过程-标记，其用于产生适当尺寸的片段并插入标签，提供允许捕获和扩增的标记的DNA1225。在图12D中，将具有多个捕获寡核苷酸的捕获物体1230引入含有标记的DNA1225的坞405。多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括原位可检测的条形码、引发序列和捕获序列。在图12E中，使用重组酶/聚合酶扩增对标记的DNA1225进行等温扩增，其中捕获寡核苷酸的捕获序列在重组酶/聚合酶机制的存在下引导并指导(捕获物体1230')标记的DNA，以提供扩增的DNA1235，其包括测序接头、条形码和任选的索引，如UMI或库索引。在整个扩增过程中和之后，扩增的修改的条形码化DNA 1235扩散出隔离坞405并进入隔离坞通向的微流体通道122，并使用流体介质流242输出微流体装置(图12F)。一旦输出，将扩增的修改的条形码DNA 1235定量以用作测序文库，并且可以与用于测序运行的其他文库合并。在完成DNA1235的输出后，使用本文所述的任何方法(图12F)进行捕获物体1230的捕获寡核苷酸的条形码的原位测定。
图12G显示了从细胞DNA产生测序文库的方法中捕获寡核苷酸和DNA加工的示意图。捕获物体1230的每个捕获寡核苷酸通过连接体1215共价或非共价连接，并且从捕获寡核苷酸的5'末端起包括：引发序列/接头1240；条形码1245、任选的UMI 1250和捕获序列1255，其具有标记插入捕获序列并且可以捕获(例如，引导和指导)拼接末端插入序列。条形码序列1245可以是含有至少三个如本文所述的卡式寡核苷酸序列的任何条形码序列。标记的DNA1225具有标记插入序列1255和DNA片段1260，标记插入序列1255可以是拼接末端序列插入物。在等温重组酶聚合酶驱动的扩增过程中，通过具有P5接头/引发序列1270的通用引物1275、任选的库索引1265和标记插入捕获序列1255的任何一个进行引发。或者，可以使用基因特异性引物1275'，其中引物1261的一部分引导选择DNA的子组，例如基因特异性序列。
形成测序文库的等温扩增产物是扩增的并修改的DNA1280或1280'。扩增的和修改的DNA1280是通用引物1275的产物，并包括DNA片段1260的通用文库，而扩增的DNA1280'具有DNA片段区域1262(由基因特异性引发序列引发的基因特异性DNA的剩余部分)加上1261(基因特异性引发序列)，其包括基因特异性扩增产物。
从同一细胞产生条形码化cDNA文库和条形码化基因组DNA文库。此外，提供了一种用于提供来自单个生物细胞的条形码化cDNA文库和条形码化基因组DNA文库的方法，包括：将生物细胞置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；将第一捕获物体置于隔离坞中，其中第一捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含：第一引发序列；第一捕获序列(例如，配置成捕获释放的核酸)；和第一条形码序列，其中第一条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与第一条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列不同；通过进行如本文所述的获得cDNA文库的任何方法获得条形码化cDNA文库，其中裂解生物细胞以使生物细胞的质膜降解，从生物细胞释放胞质RNA，同时使生物细胞的核被膜保持完整，从而提供带有来自生物细胞的RNA的条形码化cDNA文库的第一捕获物体；从微流体装置输出带有cDNA文库的第一捕获物体；将第二捕获物体置于隔离坞中，其中第二捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，每个均包括：第二引发序列；第一标记插入捕获序列；和第二条形码序列，其中第二条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均与第二条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列不同；通过进行如本文所述的获得条形码化基因组DNA文库的任何方法获得条形码化基因组DNA文库，其中来自生物细胞的多个标记的基因组DNA片段与第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸中的一个的第一标记插入捕获序列接触，从而提供来自生物细胞的基因组DNA的条形码化基因组DNA文库；并从微流体装置输出条形码化基因组DNA文库。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：识别第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，可以在将生物细胞置于隔离坞中之前；在从生物细胞的RNA获得条形码化cDNA文库之前；或者在从微流体装置输出带有条形码化cDNA文库的第一捕获物体之前识别第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：识别第二捕获物体的多个寡核苷酸的条形码序列。
在各种实施方案中，可以在获得条形码化基因组DNA文库之前或在从微流体装置输出条形码化基因组DNA文库之后，识别第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。
在各种实施方案中，识别第一或第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列可以使用如本文所述的任何原位识别条形码的方法进行。
在各种实施方案中，第一捕获物体和第二捕获物体均可以是如本文所述的任何捕获物体。
在一些实施方案中，第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的第一引发序列可以不同于第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的第二引发序列。在其他实施方案中，第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的第一捕获序列可以不同于第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的第一标记插入捕获序列。
在各种实施方案中，第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列可以与第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列相同。在其他实施方案中，第一捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列可以不同于第二捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。
产生B细胞受体测序文库。
提供了一种提供条形码化B细胞受体(BCR)测序文库的方法，包括：从B淋巴细胞产生条形码cDNA文库，其中根据本文所述的任何产生条形码化cDNA文库的方法来进行产生，其中条形码化cDNA文库置于包括多个捕获寡核苷酸的捕获物体上，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括Not1限制性位点序列；扩增条形码化cDNA文库；从条形码化cDNA文库中选择条形码化BCR序列，从而产生富含条形码化BCR序列的文库；环化来自富含条形码化BCR序列的文库的序列，从而产生环化的条形码化BCR序列文库；使环化的条形码化BCR序列文库重新线性化以提供重排的条形码化BCR序列的文库，每个BCR序列将BCR序列3’的恒定(C)区呈递到各自的可变(V)子区和/或各自的多样性(D)子区；并且，添加测序接头并对V子区和/或D子区进行亚选择，从而产生条形码化BCR测序文库。
在各种实施方案中，该方法可以进一步包括扩增BCR测序文库以提供条形码化BCR子区序列的扩增文库。在一些实施方案中，可以使用通用引物扩增条形码化cDNA文库。
在一些实施方案中，选择BCR序列区可包括进行对对BCR序列具有选择性的聚合酶链反应(PCR)，从而产生条形码化BCR区选择性扩增DNA文库。在一些实施方案中，选择条形码化BCR序列可以进一步包括添加至少一种测序引物序列和/或至少一种索引序列。在各种实施方案中，环化来自富含条形码化BCR序列文库的序列可包括将每个条形码化BCR序列的5'末端连接至其各自的3'末端。在各种实施方案中，使环化的条形码化BCR序列文库重新线性化可包括在Not1限制性位点消化环化的条形码化BCR序列文库中的每一个。
在其他实施方案中，添加测序接头和对V子区和/或D子区进行亚选择可以包括进行PCR，从而添加测序接头并对V子区和/或D子区进行亚选择。
在一些其他的实施方案中，捕获物体是如本文所述的任何捕获物体。
在各种实施方案中，该方法可以进一步包括：使用如本文所述的任何原位识别条形码的方法识别捕获物体的多个捕获寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，可以在扩增条形码化cDNA文库之前进行识别。在其他实施方案中，可以在产生条形码化cDNA文库的同时进行识别。
在各种实施方案中，任何以下步骤可以在位于微流体装置的外壳内的隔离坞中进行：扩增条形码化cDNA文库；选择性对条形码化BCR序列进行聚合酶链式反应(PCR)；环化序列；在Notl限制性位点处使环化的条形码化BCR序列文库重新线性化；和添加测序接头和对V子区和/或D子区进行亚选择。
通过参考图13A-B可以更好地理解产生B细胞受体(BCR)测序文库的方法。图13A-B是产生如本文和实施例7中所述的BCR测序文库的过程的示意图。捕获物体1330包括珠子1310，为了清楚起见，仅示出了多个捕获寡核苷酸中的一个捕获寡核苷酸。捕获物体1330的捕获寡核苷酸通过连接体1315与珠子1310连接，其可以是共价的或非共价的。连接体1315连接到捕获寡核苷酸的5'末端，其中引发序列1(1320)沿着捕获寡核苷酸的长度定位。捕获寡核苷酸还包括条形码1325，其可以是如本文所述的任何原位可检测的条形码；任选的UMI1335；测序接头序列1340；Not1限制性位点序列和捕获序列1350，其在该实施例中是RNA的通用捕获序列Poly T(其在3'末端可具有两个额外的核苷酸-VN)。Not1序列1345位于捕获序列1350的5'端，并且是条形码1325、引发序列1320、测序接头1340和任何UMI 1335的3'端。捕获寡核苷酸被配置成捕获RNA505，其具有关注的RNA序列1301(不是PolyA序列1350')，其在裂解源细胞的细胞膜时释放。通过将其PolyA序列1350'与捕获物体的PolyT捕获序列1350杂交，将RNA捕获到捕获物体，从而形成修饰的捕获物体1330'。在模板转换寡核苷酸1306存在下，逆转录框1365提供了带有cDNA的捕获物体，其中捕获寡核苷酸现在含有逆转录核酸1355的区域。使用针对引发序列1(1320)和引入cDNA的模板转换寡核苷酸1307的一部分的通用引物1311、1312(参见表6，SEQ ID NO.113)，通过PCR扩增cDNA，提供了扩增的DNA文库1370。选择PCR1375使用引物1302(其具有针对DNA 1370的引发序列1(1320)的序列1320；任选的库索引1305和测序引发序列2(1304)和BCR选择性引物1303，其仅选择BCR序列，且是物质(species)依赖性的。BCR选择性引物1303可以是引物的混合物，其可以靶向重链或轻链区(1356)。参见表6，SEQ ID No.114-150)。产物选择的DNA 1380具有如上文所列的用于扩增产物1370的引发序列、UMI、条形码序列，但DNA片段现在仅包含BCR区1357，其中BCR区1357的5'端区是BCR的全长恒定(C)子区1351，具有连接(J)区1352(如果存在于所研究的物质中)；多样性(D)子区1353，以及最后到3'端可变(V)区1354。
为了使更关注的BCR子区(V、D、J)更适合于测序分析，进行重排。选择的DNA 1380通过连接环化，以产生图13B中的环化的DNA文库1385。然后，环化的DNA文库1385在Not1限制性位点1345(黑色箭头)处消化，以产生重新线性化的DNA文库1390。环化和重新线性化的作用是使更关注的BCR子区(V、D、J)更好地接近测序引发位点，从而可以实现更高质量的读数。在重新线性化的DNA文库1390中，BCR子区序列5'至3'的顺序已经颠倒，并且可变(V)区1354现在朝向所有BCR子区的5'端放置，随后在3'方向上的顺序是多样性(D)子区1353；连接(J)区1352(如果存在于所研究的物质中)；最后，在BCR区序列1357的最3'区段处的BCR的全长恒定(C)子区1351。
接下来进行亚选择PCR 1394，其中引物1308(包括引物序列1360和选择区1351”)指向恒定(C)子区的序列1351'。选择序列135'靠近C子区域的5'末端以切除C子区的大部分。这产生了亚选择的DNA文库1395，其也添加了引发序列1360。亚选择的BCR区通过将其置于与测序引发位点更好的并列，并且通过1)完全去除polyT序列1350和2)去除BCR C子区的实质性区域，现在允许更高质量的读数和读入V、D和J区的长度。对亚选择的DNA文库1395进行测序1396，并产生条形码1325和任选的UMI 1335的第一读数。测序1392读取任选的库索引。测序1393和1397读取亚选择的BCR 1357'。
用于产生测序文库的任何方法也可以通过将两个或更多个捕获物体引入隔离坞来进行。两个或更多个捕获物体中的每一个均可以包括两个或更多个捕获寡核苷酸，其具有包括如上所述的一个或多个卡式子单元的细胞相关条形码以及引发序列。在一些实施方案中，两个或更多个捕获物体中的每一个均可以具有相同的条形码。在一些其他实施方案中，当将两个或多个捕获物体引入同一坞时，每个捕获物体均可具有不同的细胞相关条形码。在其他实施方案中，两个或更多个捕获物体中的每一个均可以具有相同的细胞相关条形码。使用多于一个捕获物体可以允许更多的核酸捕获能力。可以容易地扩展本文描述的原位识别方法以识别一个隔离坞中的两个或更多个捕获物体。
微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1A示出了可以用于维持、分离、测定或培养生物微物体的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1A中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这样的微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1A所示，微流体管路120可以包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个隔离坞可以具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。在图1A的装置的一些实施方案中，隔离坞可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
如图1A中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1A所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口107均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、腔室、坞、阱(trap)等。在图1A所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。
盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1A所示的分离结构或同一结构的集成部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置以及倾斜装置190(倾斜模块166的一部分)。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像装置可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。
系统150进一步包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106上方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106下方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，而不是位于隔离坞的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。
系统150可以进一步包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1A所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监视设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出设备172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、基质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可以包括由成像装置捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、可检测标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。
在图1A所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体基本上分离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。坞到微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流106不被引导到坞中。流动可以与坞的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW、流体流动和/或重力一起使用。
微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体管路120的微流体隔离坞124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于保持、分离、测定或培养生物微物体的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离坞。
在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120进一步包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个隔离坞(例如，相对于通道122)，使得隔离坞可以平行地加载目标微物体。
在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地置于。在一些实施方案中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。
阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离坞的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离坞的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕获微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离坞中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个隔离坞的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离坞中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。
在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到坞中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替的方式施加DEP和/或OEW力。
图1B、1C和2A-2H示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1B描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公开号20150306598(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公开WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。
已经在例如US 2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、US2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和US 2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有坞的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测生物微物体，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个进一步描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。
微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上选择性地诱导DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。
图1B和IC中示出了包含DEP配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1B和IC分别示出了具有区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如图1B所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可以具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。
在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。
图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约
在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonal lattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。
已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP构造的图1B-1C的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动原位产生的捕获的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕获和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1A中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一个示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kOhms至约50kOhms的阻抗。
在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1A中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
隔离坞。在图2A-2C中描绘的微流体装置230内示出了一般隔离坞224、226和228的非限制性实例。每个隔离坞224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从微流体通道122流入隔离坞224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。因此，由于连接区域236，布置在隔离坞224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的介质180的流动分离且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔离坞224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。隔离坞的开口从微流体通道122侧向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和隔离坞224、226和228二者的下方。隔离坞的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成隔离坞的底板)被置于在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为流动区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动区域)和隔离坞的衬底的上表面中的高度变化可以小于隔离坞的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290、300、700、800、1000中的任一个。
因此，微流体通道122可以是扫描区域的示例，并且隔离坞224、226、228的分离区域240可以是未扫描区域的实例。应当注意，微流体通道122和隔离物224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2A-2B所示的实例中，端口222被连接到微流体通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流242。例如，如图所示，端口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222形成介质的流242。
图2C示出了根据本公开的隔离坞224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。
已知的是，微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔离坞224的近端开口234可以使介质180的二次流244进入和/或离开隔离坞224。为了将隔离坞224的分离区域240中的微物体246与二次流244分离，隔离坞224的连接区域236的长度Lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流244进入连接区域236的穿透深度Dp。二次流244的穿透深度Dp取决于在微流体通道122中流动的流体介质180的速度以及与微流体通道122的配置有关的各种参数以及到微流体通道122的连接区域236的近端开口234。对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置将是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流242的速率将是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别通道122中的流体介质180的流242的最大速度Vmax，确保二次流244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。只要微流体通道122中的流体介质180的流242的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流244就可以被限制到微流体通道122和连接区域236并且保持在分离区域240之外。因此，微流体通道122中的介质180的流242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体介质180的流242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。
此外，只要微流体通道122中的介质180的流242的速率不超过Vmax，微流体通道122中的流体介质180的流242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到隔离坞224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度Lcon大于二次流244的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离坞224被来自微流体通道122或另一个隔离坞(例如，图2D中的隔离坞226、228)的混杂的颗粒污染。
因为微流体通道122和隔离坞224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的介质180的流242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫描(或流动)区域。另一方面，隔离坞224、226、228的分离区域240可以被认为是未扫描(或非流动)区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。
如上所述，由微流体通道122中的流体介质180的流242引起的二次流244的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：微流体通道122的形状(例如，微流体通道可以将介质引导到连接区域236中，将介质从连接区域236转移，或者沿着基本上垂直于通向微流体通道122的连接区域236的近端开口234的方向引导介质)；微流体通道122在近端开口234处的宽度Wch(或横截面积)；和连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon(或横截面积)；微流体通道122中的流体介质180的流242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度，等等。
在一些实施方案中，微流体通道122和隔离坞224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流242的向量如下定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流242。前述仅是示例，并且微流体通道122和隔离坞224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何值。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。
如图2C所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何值。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度Wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。
图2D-2F描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1A的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离坞266，其是上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2D-2F中所示的装置250的隔离坞266可以代替装置100、200、230、280、290、300、700、800、1000中的上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290、300、700、800、1000相同或不同的DEP配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。
图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1A中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2D所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个隔离坞266与其流体连接。
每个隔离坞266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2B和2C的讨论，通道264中的第一流体介质254的流278可以产生从微流体通道264进入和/或离开隔离坞266的相应连接区域268的第一介质254的二次流282。
如图2E所示，每个隔离坞266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度Lcon可以大于二次流282的最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度Dp的长度Lcon，在这种情况下，二次流282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度Lc1和Lc2的和大于最大穿透深度Dp，使得二次流282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度Lcon是否大于穿透深度Dp，或者连接区域268的长度Lc1和Lc2的和是否大于穿透深度Dp，通道264中的第一介质254的不超过最大速度Vmax的流278会产生具有穿透深度Dp的二次流，并且隔离坞266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流278拖曳离开分离区域270。通道264中的流278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到隔离坞266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一的机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。
如图2E所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度Wch(即，横切流体介质流过微流体通道的方向，如图2D中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度Wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度Wcon2。然而，近端开口274的宽度Wcon1和远端开口276的宽度Wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度Wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度Wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。
在隔离坞室(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，分离区域(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以为约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米或100-120微米。在一些其他实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以为约200-800微米、200-700微米或200-600微米。以上仅是示例，并且微流体通道122的宽度Wch可以上文列出的任何端点内的宽度。此外，在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的Wch可以被选择为在任何这些宽度内。
在一些实施方案中，隔离坞的高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约1×104-3×106平方微米、2×104–2×106平方微米、4×104–1×106平方微米、2×104–5×105平方微米、2×104–1×105平方微米或约2×105–2×106平方微米。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的高度Hch可以是以下任何高度内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)的高度Hch可以是上文列出的任何端点内的高度。在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的高度Hch可以被选择为在任何这些高度内。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以为约500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的横截面积可以是上文列出的任何端点内的任何面积。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon可以是约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)的长度Lcon可以是上文列出的任何端点内的任何长度。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以是约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米或80-100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，上文列出的任何端点内的任何值)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以至少与隔离坞打算用于的微物体(例如，生物细胞，其可以是T细胞、B细胞或卵细胞或胚胎)的最大尺寸一样大。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，上文列出的任何端点内的宽度)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域的近端开口的宽度Wpr可以至少与隔离坞所预期用于的微物体(例如，生物微物体，如细胞)的最大尺寸一样大。例如，宽度Wpr可以是约50微米、约60微米、约100微米、约200微米、约300微米或可以是约50-300微米、约50-200微米、约50-100微米、约75-150微米、约75-100微米或约200-300微米。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon与连接区域(例如，236)在近端开口234处的宽度Wcon的比可以大于或等于任何以下比值：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域236的长度Lcon与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon的比可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、23、250、280、290、300、700、800、1000的各种实施方案中，Vmax可以被设定为约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14或15微升/秒。
在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的分离区域(例如，240)的体积可以是例如至少5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、1×107、5×107、1×108、5×108或8×108立方微米或更大。在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约5×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107、3×107、5×107或约8×107立方微米或更大。在一些其他实施方案中，隔离坞的体积可以是约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞、约1000至约3500个隔离坞、约3000至约7000个隔离坞、约5000至约10,000个隔离坞、约9,000至约15,000个隔离坞或约12,000至约20,000个隔离坞。隔离坞不需要全部是相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔离坞中不同的宽度、不同的特征)。
图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G中示出的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和隔离坞128)会具有本文所讨论的尺寸。图2G中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280进一步包括向每个通道122开口的多个隔离坞。在图2G所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫描区域(例如，通道122和连接区域236在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)和非扫描区域(例如，分离区域240和连接区域236不在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)这两者。
图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300、700、800、1000)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302加持微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置320的能力并不意味着当插座302加持微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要促进在微流体装置320中生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时施加。
如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 322上并被电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 322上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302加持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为对波形发生器的反馈提供，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3A所示，支撑结构300(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300加持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kOhm+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1kOhm+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置。在一些实施方案中，成像装置包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、铁电硅基液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。
在某些实施方案中，成像装置进一步包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成部件。
在某些实施方案中，显微镜350可以进一步包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。
在某些实施方案中，成像装置被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源334可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被巢300加持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被巢300加持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源334可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3B中所示的光具组的表示仅是示意性表示，并且光具组可以包括另外的滤光器、陷波滤光器、透镜等。当第二光源334包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3B中所示的不同，并且可以在光具组内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源334和光源332/光调制子系统330的示意性位置也可以互换。
在图3B中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统330，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源334被显示为经由分束器336将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此通过物镜336向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。
在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，这种滤除来自光调制子系统330的光才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被调节或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可携带性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。
涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的条件化的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、腔室或隔离坞的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。
涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、洗涤剂、酶及其任何组合。
基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。
聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。
在其他实施方案中，涂料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白质。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中的存在浓度为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中的存在浓度可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物调节的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。
共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供调节的表面。
共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。
在一些实施方案中，被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，共价连接的烷基部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)，其中第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可携带性(portability)或其任何组合。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或者聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。
共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离坞和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。
提供条件化的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基调节的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
条件化的表面性质。除了条件化的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变条件化的表面的物理厚度，例如在衬底上形成条件化的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。在一些实施方案中，条件化的表面的厚度为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的条件化的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施方案中，如本文所述制备的条件化的表面具有小于10nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，条件化的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过旋涂制备的表面的值(其厚度通常为约30nm)形成对比。在一些实施方案中，条件化的表面不需要完美形成的单层来适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。
在各种实施方案中，提供微流体装置的经调节表面的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕获。不同的涂层材料可能捕获电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕获并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕获。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕获量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。
除了其电性质之外，条件化的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的条件化的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用，表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积
单一或多部分条件化的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。
制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离坞和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。
涂层材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的衬底的表面的氧化物上。DEP或EW配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。
涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被选自醚、氨基、羰基、酰氨基和/或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分L的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。
在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加将被配置为提供适合维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx(即，被配置为与反应性部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团L可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的主链。当偶联基团CG是亚三唑基时，它可以是由Click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。
在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰配体)沉积在微流体装置的内表面上。可任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。
在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面修饰配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面修饰的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。
图2H描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供条件化的表面的示例性共价连接的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是DEP衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被置于在邻近且向内面向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被置于在微流体装置290的一个或一些内表面上。
在图2H所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、PEG封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被置于在其面向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。
在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。
在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其面向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。
适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以参见2016年4月22日提交的美国申请系列号15/135,707，其通过引用整体并入。
用于在微流体装置的隔离坞中维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。
用于在微流体装置的隔离坞中维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。
加载方法。加载生物微物体或微物体(例如但不限于珠子)可涉及使用如本文所述的流体流动、重力、介电电泳(DEP)力、电润湿、磁力或其任何组合。DEP力可以光学地(例如通过光电镊子(OET)配置)和/或电学地(通过以时间/空间方式激活电极/电极区域)产生。类似地，可以光学地(例如通过光电润湿(OEW)配置)和/或电学地(例如通过以时间空间方式激活电极/电极区域)提供电润湿力。
实验
系统和微流体装置。系统和微流体装置：由Berkeley Lights，Inc制造。该系统至少包括流控制器、温度控制器、流体介质条件化和泵组件、用于光激活的DEP配置的光源、用于微流体装置的固定台(mounting stage)和相机。微流体装置是OptoSelectTM装置(Berkeley Lights,Inc)，配置有OptoElectroPositioning(OEPTM)技术。微流体装置包括微流体通道和与其流体连接的多个NanoPenTM室，室具有约7×105立方微米的体积。
引发方案。以12微升/秒的速率流入250微升100％二氧化碳。接着是250微升的引发培养基，其组成如下：1000ml伊思柯夫改良培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)(
灌注方案。灌注方法是以下两种方法之一：
1.以0.01微升/秒灌注2小时；以2微升/秒灌注64秒；并重复。
2.以0.02微升/秒灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒灌注64秒；并重复。
条形码化核酸捕获珠子：珠子是聚苯乙烯(16微米)或磁性的(22微米)，Spherotech#SVP-150-4或#SVM-200-4。修饰珠子以包括具有如本文所述的条形码的寡核苷酸。条形码化的珠子可以以本领域已知的任何合适的方式合成。
表3.本实验中使用的引物
RNA测序：修饰珠子以显示寡(dT)捕获序列/独特分子标识符序列/条形码/引发序列。选择对每个珠子唯一的条形码。寡(dT)引物/独特分子标识符标签/细胞条形码/引物序列可以通过总寡核苷酸合成、分隔、库合成、任何长度的寡核苷酸区段的连接或其任何组合来合成。寡(dT)引物/独特分子标识符标签/细胞条形码/引物序列可以直接或间接共价连接到珠子上，或者可以例如通过链霉亲和素/生物素连接体等非共价连接。在该实验中，通过非共价生物素/链霉亲和素连接将包含捕获序列、UMI、条形码和引发序列的全合成的寡核苷酸连接到珠子上。
实施例1.如OKT3细胞所证明的RNA捕获、测序文库制备和测序结果。
细胞：OKT3细胞，一种鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系，从ATCC获得(
培养基：将1000ml伊思柯夫改良培养基(
当在孵育期间灌注时，在引入OptoSelect装置之前，将培养基连续用含5％二氧化碳的空气条件化。
实验：将OKT3细胞样品以200微升中2E6的密度引入OptoSelect装置中。通过光驱动的介电电泳力移动250个细胞，以向每个NanoPen室加载一个细胞。将每个细胞置于最远离通向微流体通道(例如，分离区域)的开口的室的区段内。随后将单个独特条形码化的珠子装载到每个占据的室中。装载到具有单个生物细胞的NanoPen室中的珠子的总数是223，并且每个珠子也位于每个室的未经历穿透流体流动的部分内。在该实验中，产生256个独特条形码化的珠子，每个珠子具有总共4个卡式序列。通过以下选择产生多样性：在条形码的第一位置中选择四个可能序列中的一个；在条形码的第二位置中选择第二不同组的四个可能序列的四个中的一个，在条形码的第三位置中选择第三不同组的四个可能序列的四个中的一个，和在条形码的第四位置中选择第四不同组的四个可能序列的四个中的一个。
将裂解试剂(Single Cell Lysis Kit，Ambion目录号4458235)流入微流体通道并允许扩散到NanoPen室中。将单独围住的OKT3细胞暴露于裂解缓冲液10分钟。通过流入终止裂解缓冲液(Single Cell Lysis Kit，Ambion目录号4458235)并在室温下孵育2分钟同时在微流体通道中没有流动来停止裂解。(使用其他裂解缓冲液可以获得类似的结果，包括但不限于Clontech裂解缓冲液，目录号635013，其不需要终止裂解处理步骤)。在使用的条件下，核膜未被破坏。将释放的mRNA捕获到存在于相同NanoPen室内的条形码化珠子上。
通过流入RT试剂混合物(Thermo ScientificTM MaximaTM H Minus RT(Thermofisher,目录号EP0751:4微升RT缓冲液；2微升10毫摩尔各种dNTP(New EnglandBiolabs目录号NO447L)；2微升10微摩尔E5V6引物(5Me-isodC//iisodG//iMe-isodC/ACACTCTTTCCCTACACGAC GCrGrGrG；SEQ ID No.103)；1微升H Minus RT酶；11微升水)逆转录捕获的RNA。或者，包括酶、缓冲液和DTT的Clontech SMARTscribeTM逆转录酶试剂盒(目录号639536)可用于从捕获的核酸获得cDNA。在16℃下20分钟的时间段内允许试剂混合物扩散到NanoPen室中，然后在42℃下反应90分钟。
逆转录后，以3微升/秒空白输出12微升作为阴性对照。然后单独但类似于如下所述加工输出组的珠子处理该对照。
然后通过如上所述的荧光标记的杂交探针的多路流动识别每个珠子的独特细胞条形码。1微摩尔(来自100mM原液，稀释在1×DPBS中)的荧光标记的探针(以每试剂流四种探针的组提供，每种探针含有与流中任何其他探针不同的荧光团和不同的寡核苷酸序列)流入(每组四种具有可区分的荧光标记的探针)微流体装置的微流体通道，并允许在16℃下在20分钟内扩散到NanoPen室中，然后在42℃下杂交90分钟。(或者，也成功使用了不同的缓冲溶液，IDT Duplex缓冲液目录号11-05-01-12。使用这种不含核酸酶并含有30mM Hepes和100mM乙酸钾pH7.5的缓冲液在这些条件下也有利于优异的双链体形成)。在完成杂交期后，使新鲜培养基(DPBS或Duplex缓冲液)流过微流体装置20分钟(300微升，0.25微升/秒)，以将未结合的杂交探针从微流体装置的流动区域冲洗出来。选择冲洗期足够长以使未杂交的杂交探针扩散出每个NanoPen室。随后激发每个可区分的荧光波长(Cy5、FITC、DAPI和德克萨斯红通道)，并如果任何NanoPen室显示荧光信号，对其识别。记录了定位于NanoPen室的每个探针的荧光标记的位置和颜色，并且与第一试剂流的杂交探针的已知序列和荧光标记关联，并且分配珠子上的条形码的相应卡式序列的身份。其他组的荧光标记的杂交探针(每种具有彼此不同的寡核苷酸序列并且不同于第一和任何其他在先的试剂流的序列)的另外的连续试剂流如上所述流入并继续检测。在每轮试剂流动和检测之间，使用100微升1×DPBS(杜尔贝科氏PBS(Dulbecco's PBS))的第一冲洗液进行冲洗，然后进行相同培养基的第二次50微升冲洗，两者均以0.5微升/秒进行。为了最小化第二或另外的试剂流中卡式序列的错误识别，仅使用每种可区分的荧光团的第一次识别的荧光信号来对条形码分配卡式序列的身份。在完成微流体装置内所有珠子的条形码中使用的总计所有卡式序列的试剂流后，将NanoPen室中所有珠子的条形码分配给每个相应的单个NanoPen室。通过该方法分配的特定条形码序列的分配位置用于识别RNA从哪个特定细胞捕获到珠子，例如，微流体装置的NanoPen室内源核酸的位置。图14A显示了一个NanoPen室#470的过程中的连续点。每种可区分的荧光信号区域如所示在每列顶部标记为A-D。每个流垂直显示，标记为1-4。在流1的探针已经允许杂交并且冲洗完成之后，NanoPen室470中的珠子仅在颜色通道B中具有荧光信号。在引入第二试剂流之后检测，允许杂交，并且冲洗，没有检测到额外的标签。注意，虽然NanoPen室#470在“B”荧光通道中的第二流期间显示信号，但是每种条形码和每种探针被设计成使得每种条形码仅具有一种卡式序列，该卡式序列具有可区分荧光标记的一种。不记录该第二信号，因为它代表仍然与珠子结合的第一流动探针。试剂流2的探针或试剂流3也均未识别出额外的卡式序列。然而，对于其他三个荧光通道中的每一个，在第四流中识别出荧光信号。结果，NanoPen室470中的珠子的条形码，该条形码被识别为具有与A4B1C4D4卡式序列关联的序列。检测后，通过在进一步操作之前用10mM Tris-HCl(200微升，0.5微升/秒)冲洗微流体装置的流动区域两次来移除剩余的杂交探针。
然后使用光驱动的介电电泳力将条形码化的珠子在位移缓冲液(10微摩尔Tris)中从NanoPen室输出到流动区域(例如，流动通道)，如图14B所示。从NanoPen室输出的珠子使用流输出微流体装置，并合并。出口组中存在阳性对照珠子。通过在80℃孵育10分钟并用外切核酸酶I(NEB，目录号M0293L)在Exo 1缓冲液中(17微升输出的珠子，1微升外切核酸酶溶液和2微升Exo I缓冲液)处理失活逆转录酶之后，将输出组的珠子(20微升体积)加入到5微升10X Advantage 2PCR缓冲液、dNTP、10微摩尔SNGV6引物(5’-/5Biosg/ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’；SEQ ID No.105)、1微升Advantage 2聚合酶混合物；和22微升水中。该序列存在于E5V6引物上，也存在于珠子上的寡核苷酸中，并用于通过单引物PCR扩增cDNA以在较短的片段上富集全长cDNA。对cDNA进行18个DNA扩增循环(
根据供应商的说明书使用0.6x SPRI(固相可逆固定化)珠子(Agencourt AMPureXP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))进行输出组的粗扩增混合物的初始纯化。根据供应商的说明书，通过电泳和/或荧光(QubitTM,ThermoFisher Scientific)(图14C)进行定量(Bioanalyzer 2100，Agilent，Inc.)并显示可接受的扩增DNA回收率，其在进一步文库制备之前用于进行单侧标记(Nextera XT DNA Library Preparation Kit,
使用MiSeq测序仪(
图16A和B说明了使用这些方法对测序数据和文库制备的额外质量评估。图16A列出了如上所述进行的两个不同实验A和B，不同之处在于进行逆转录步骤的时间长度(60分钟，90分钟)。实验A包括来自DNA文库的数据，DNA文库来自108个珠子的输出(从108个细胞捕获RNA)。实验B包括来自DNA文库的数据，DNA文库来自120个珠子的输出(从120个细胞捕获RNA)。在图16B中，总列显示了从每个实验的测序数据获得的读数总数。已分配列表示读取次数，其1)映射到条形码并2)具有高于预选质量阈值的测序质量。已分配列显示了映射到关注基因组的读取数。除去了映射到假基因、错误注释基因和未在参考内的基因间区的已分配读数以获得该总数。Mito总计列包括映射到线粒体参考的读取数，其涉及生理条件差的细胞，其通常表达增加的线粒体基因数量。Mito UMI列表示具有不同的独特分子标识符的读取数，其映射到线粒体参考。Refseq总计列表示与mRNA Refseq参考比对的读取数，Refseq UMI列表示具有与mRNA Refseq参考比对的不同UMI的读取数，并且表示在裂解细胞时捕获珠子捕获的分子的原始数量。所有这些数字表明由这些方法提供的DNA文库产生高质量的测序数据，代表细胞的所有组成成分。
一些其他分析用于评估测序样品文库的质量。使用来自相同细胞池的1ng提取的总RNA进行芯片外实验。使用含有所有256个条形码组合的珠子混合物制备cDNA。如上所述进行下游加工，提供批量控制(bulk control)，不需要识别条形码。从这些输入中的每一个对相等量的输入DNA进行测序。从这些样品获得的测序数据的比较显示在图16C和D中。在测序数据中可识别的条形码读数的百分比范围为总读取数的约78％至约87％，且当与参考转录组比对时，测序读数所涵盖的序列范围为约49％至约61％。(图16C)。最后，前5位表达的基因包括RP128(核糖体蛋白)；Emb(B细胞特异性)；Rpl24(B细胞特异性)；Dcun1d5(B细胞特异性)、Rp35a(核糖体蛋白)和Ddt(B细胞特异性)，其与细胞类型和起源一致。(图16D)。图17显示，在实验100、98、105、106中，使用90分钟逆转录反应期，在每个实验之间检测到的条形码组变化，表明珠子递送至NanoPen室的良好随机化。对于四个实验(实验100、98、105、106)每一个的芯片外实验(标记为256)、空白(XXX-bl)和输出的珠子数据的比较显示在图18中。图18显示了许多NanoPen室的测序读数的取回。对于每个实验，XXX-E1是带有cDNA的珠子的第一输出，并且XXX-E2是来自相同坞的随后的第二输出。图18的小提琴图的y轴是来自每个样品的条形码读取量。微流体装置外对照256具有等效表示的所有条形码。输出的珠子数据(XXX-E1或XXX-E2)显示少于代表的所有条形码，并且条形码读取量也更少等效地表示。不出所料，样品XXX-E2显示甚至更少的读取，但这些读取变化数量更多。最后，如前所述，空白读数显示非常低的条形码读取数，仅一个或两个具有合理的发生频率的读取。
实施例2.T细胞表型分型、培养、测定和RNA测序。表型与基因组信息的关联。
微流体系统、材料和方法与实验1中的相同，不同之处如下：
细胞：对照细胞是人外周血T细胞。样品细胞是衍生自人肿瘤样品的人T细胞。
培养基：RPMI 1640培养基(Gibco，#12633-012)、10％胎牛血清(FBS)、(Seradigm，#1500-500)；2％人AB血清(Zen-bio，#HSER-ABP100ml)、IL-2(R&D Systems，202-IL-010)2U/ml；IL-7(PeproTech，#200-07)10ng/ml；IL-15{PeproTech，#200-15)10ng/ml、IX Pluronic F-127(Life Tech目录号50-310-494)。
源自人肿瘤样品的人T细胞用抗原在芯片外染色，然后以5×E6个细胞/ml的密度引入OptoSelect装置的微流体通道。通过光驱动的介电电泳力移动抗原阳性T细胞(P-Ag)和抗原阴性细胞(N-Ag)以将单个T细胞分离进入单独的NanoPen室，形成多个填充的NanoPen室。
在4天的培养期间(图19)，在CD3/28珠子(
向每个被占据的室中加入单个条形码化珠子，其经由连接合成(在该特定实验中)。每个珠子包括如上所述的引发序列、条形码序列、UMI序列和捕获序列。如上所述，随后进行裂解和RNA捕获。在使用的条件下，核膜不会被破坏。将释放的mRNA捕获到存在于相同NanoPen室内的条形码化珠子上。
在图20A、21A和22A中，一组四个照片图像示出了代表性的被占据的NanoPen室。从左到右的每组照片显示：1)使用光驱动的介电电泳力放入NanoPen室后T细胞的明场照明；2)探测抗原特异性染色的荧光检测(德克萨斯红通道)；3)使用光驱动的介电电泳力输入一个条形码化捕获珠子后，NanoPen室的明场照明；4)裂解后的明场照明。如上所述，裂解条件破坏细胞膜，但不干扰核膜。
在图20A中，显示了具有1446位置标识符的NanoPen室被一个细胞占据。该细胞是抗原阳性染色细胞(P-Ag)，如图20A组的第二张照片所示，其具有荧光信号(显示在NanoPen室内的白色圆圈内)。图20A组的第三张照片显示了将单个珠子置于NanoPen室内，并且图20A组的第四张照片显示了珠子和剩余的细胞核仍然位于NanoPen室内。在图21A中，显示了将细胞(第二组的第一张照片)和珠子(第二组的第三张照片)类似地置于NanoPen室547号中。但是，该细胞没有被抗原染色；在图21A的照片组的第二张照片中未检测到荧光信号。因此，该细胞被识别为抗原阴性T细胞(N-Ag)。在图22A中，显示了含有对照活化的T细胞的NanoPen室3431的同组照片。正如预期的那样，在该组的第二张照片中没有荧光信号，证实该细胞不是抗原阳性的。
RNA释放、捕获、文库制备和测序。进行实施例1中描述的用于微流体环境内的逆转录和条形码读取的方案，并记录每个NanoPen室的条形码的识别。在图20B、21B和22B中，示出了各个NanoPen室的条形码检测过程的图像。确定NanoPen室1446具有含有条形码A1B1C1D4的珠子；NanoPen室547含有具有条形码A1B3C3D4的珠子；和NanoPen室3431具有包含条形码A2B3C4D4的珠子。如实施例1中所述进行珠子输出以及从输出的携带的珠子中进行cDNA芯片外扩增、标记、纯化和尺寸选择。
使用MiSeq测序仪(
图23显示了该实验的测序结果的热图，其具有测序读数列，每列代表从NanoPen室中的一个细胞捕获到单个珠子的RNA，其是1)肿瘤抗原暴露的，抗原阳性；2)肿瘤抗原暴露的，抗原阴性；或3)阴性对照，活化的T细胞但非抗原暴露的。根据它们在测序读数中的相似性来排列柱，其与基因表达信息关联。颜色(暗vs亮带)代表表达水平。第1-14列彼此之间的关系比第15-36列更密切。由于可读条形码对于每个列(每个珠子，来自一个细胞)是可识别的，因此确定了从其回收珠子的位置，以及从其获取RNA的细胞的表型。例如，来自NanoPen室1446(标记的2EB1p_1466(P-Ag)，在组A中的第6列中发现)、547(2EB1n_547(N-Ag)，在组A的第8列中发现)和3431(标记的EA1NC_3431(NC)，在组B的第33列中发现)的上面识别的三个珠子提供了在各自突出显示和标记的列处显示的基因表达谱。第15-36列的基因表达的基因表达(在热图顶部的关系括号中的B组中聚簇)和第1-14列(A组)之间的差异被认为基本上取决于暴露于肿瘤抗原。基本上所有的A组的第1-14列的源细胞已经暴露于肿瘤抗原，无论是抗原染色阳性还是阴性。相反，第15-36列的所有来源细胞都是阴性对照细胞，并且未暴露于肿瘤抗原。每列代表一个实验的测序读数，并且颜色代表表达水平。每个珠子活化的抗原非特异性对照T细胞(NC)的测序读数明显可区分于抗原阳性肿瘤来源的T细胞(P-Ag)或抗原阴性肿瘤来源的T细胞(N-Ag)的任一测序读数。证明了特异性和可区分的单细胞RNA测序。此外，显示表型信息可与单细胞的基因表达谱相关联。
实施例3.如OKT3细胞所证明的DNA捕获、测序文库制备和测序结果。除非在该实施例中特别指出，否则如上述一般方法中那样使用/进行装置、引发和灌注方案、细胞来源和制备。除非另有说明，否则将培养基和OptoSelect装置保持在37℃。
表4、用于本实验的引物。
该实验证明了，Nextera测序文库(Illumina)可以使用与珠子连接的一条生物素化的引发序列(携带条形码)和在溶液中游离的(free)一条引物的等温PCR产生。将OKT3细胞(150)输入OptoSelect装置，并使用光驱动的介电电泳力加载到NanoPen室中。图24显示了递送至NanoPen室后的细胞。光驱动的介电电泳力为7个NanoPen室的每个NanoPen室递送一个细胞，其中错过将一个细胞递送至一个NanoPen室，并将2个细胞递送至一个NanoPen室，从而每个NanoPen室基本上仅递送一个细胞。
裂解。使用自动序列进行裂解程序，但可以通过手动控制每个步骤适当地进行。使裂解缓冲液流入OptoSelect装置(缓冲液TCL(Qiagen，目录号1031576)中，然后停止流2分钟以允许缓冲液扩散到坞中。实现细胞膜和核膜的裂解。然后用50微升培养基冲洗OptoSelect装置三次，包括每50微升冲洗后30秒的暂停。将浓度为800微克/毫升的蛋白酶K(Ambion目录号#AM2546，20mg/ml)引入OptoSelect装置并在不灌注的情况下维持20分钟。蛋白酶K扩散到NanoPen室中，并蛋白质水解不需要的蛋白质并破坏染色质以允许gDNA提取。完成后，OptoSelect装置用三个50微升PBS循环冲洗，包括每次流后10分钟保持期。
在1×PBS中以1:1000用
标记。用转座酶标记DNA。用于标记的方案之后是引入15微升体积的转座体试剂(Nextera DNA Library Prep Kit，Illumina，目录号15028212)引入OptoSelect装置，该转座体试剂包括3.3微升Tagment DNA缓冲液(TD)；16微升Tagment DNA酶混合物(TDE1缓冲液)；和14微升无核酸酶的H2O(Ambion目录号AM9937)。标记试剂在15分钟内扩散到NanoPen室中。然后对OptoSelect装置进行大量冲洗，包括用100微升PBS清洗入口和出口管线，并用50微升PBS冲洗装置本身。图27显示了通过该方案获得的标记产物尺寸的图形分布(Bioanalyzer，Agilent)，最大分布恰好在300bp以下，并且几乎没有标记产物具有大于约600bp的尺寸，这证明适用于大规模平行测序方法。
将DNA捕获到珠子。生物素化的16微米聚苯乙烯捕获珠子(Spherotech)被链霉亲和素标记的寡核苷酸修饰。寡核苷酸以5'至3'的顺序包括引发序列、条形码序列和捕获序列(例如，拼接序列)。条形码序列包含至少一个子条形码模块，允许识别OptoSelect装置的特定NanoPen室内的源细胞。在该实验中，掺入寡核苷酸内的引发序列是P7(P7接头序列)。(然而，可以使用其他引发序列，例如P5或专门设计用于与RPA过程的重组酶和聚合酶相容的引发序列)。在包含1M NaCl、20mM TrisHCl、1mM EDTA和0.00002％Triton-X的结合缓冲液中在以高达约300rpm的速度搅拌(VWR Analog涡旋混合器)下与过量的SA-寡核苷酸结合15分钟之后，珠子用三等份的新鲜结合缓冲液洗涤，然后用50微升PBS洗涤。将含有P7引发序列(测序接头)/条形码/捕获序列寡核苷酸的新鲜制备的珠子递送至NanoPen室，其在裂解前含有细胞。该步骤使用包括OEP递送至NanoPen室的自动化程序进行，但如果需要也可以手动进行。在此实验中，使用的特定自动化过程需要1小时完成。更快速的递送可能是有利的。另外，低于37℃的降低的温度对于有效的DNA捕获可能是有利的。
等温扩增。使用重组酶聚合酶扩增(RPA)反应(TwistAMP TABA S03,TwistDX)在珠子(beds)上进行捕获的DNA的等温扩增，还包括稳定在此过程中形成的置换环(D-环)的单链DNA(ss-DNA)结合蛋白。反应混合物中还存在P5-拼接序列、P7和P5引物(IDT)。将以下混合物加入2.5微升280毫摩尔乙酸镁(MgOAc)中并在微量离心管中涡旋：TwistDx试剂盒的干燥酶颗粒；27.1微升重悬浮缓冲液；2.4微升10微摩尔P5引物；2.4微升10微摩尔P7引物；和2.4微升10微摩尔P5末端索引引物(例如，S521)。将15微升这种溶解且涡旋的溶液以1微升/秒的速率输入OptoSelect装置的微流体通道中，并允许扩散到NanoPen室中并使捕获的DNA接触珠子40至60分钟。
在等温扩增期完成后，使用PBS从OptoSelect装置输出50微升流体介质。用
仍然含有珠子和未扩散到通道中的扩增DNA的OptoSelect装置在4℃保持过夜，并且使用50微升PBS进行第二输出，捕获还存在于微流体通道中的扩增产物，“第二输出”。通过PCR进一步分别扩增两个样品用于定量和尺寸分析，在具有KAPA HiFi Hotstart(KAPABiosystems)、1微升10微摩尔P5引物和1微升10微摩尔P7引物的25微升反应中，每个样品使用5个循环PCT。通过用
立即输出样品在共享的Miseq大规模平行测序实验(Illumina)中测序。覆盖率很低(平均值＝0.002731)，但读数映射遍布整个小鼠基因组，如图28所示。在图28中，每条染色体沿x轴显示。左侧浅色柱表示每条染色体的预期长度，而右侧深色柱表示在立即输出样品的数据中看到的总映射读数的百分比。虽然有些染色体在数据中过度代表(chr 2、chr16)，但其他染色体代表不足(chr 8、chr 12、chr 15)。注意，正如预期的那样，没有获得Y染色体的读数，因为细胞源于雌性小鼠。识别到可接受的低水平的接头污染物(0.000013％)。另外，在数据中也发现了关注的特定序列(例如，CXCR4序列，数据未显示)。
实施例4.来自人B淋巴细胞的OKT3细胞和人LCL1细胞的混合物的DNA分离、文库制备和测序。LCL1细胞来源：Coriell Institute。目录号：GM128781C。用于培养的培养基是RPMI-1640(Life Technologies，目录号11875-127)、10％FBS、1％Pen/Strep(1000U/ml)、2mM Glutamax。
实验使用150个OKT3细胞：150个Hu LCL1细胞或75个OKT3细胞:75个Hu LCL1细胞。使用OEP力将细胞特异性递送至单个NanoPen室，一个细胞至一个室，使得每个OKT3和每个Hu LCL1细胞的位置是已知的。
如实验3进行裂解和标记的过程，但具有通过具有以下序列之一的转座酶附加到片段化DNA的拼接末端加插入序列：
Tn5ME-A(Illumina FC-121-1030)，
5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′(SEQ ID No.161)；Tn5ME-B(Illumina FC-121-1031)
5′GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′(SEQ ID NO.162)。
将具有第一独特条形码的第一组条形码化珠子仅特异性递送至含有OKT3细胞的NanoPen，然后将具有第二独特条形码的第二组条形码化珠子特异性递送到含有HC LCL1细胞的NanoPen。这为从每组珠子扩增的DNA提供了特异性标识符，因此小鼠DNA读数可以被映射回小鼠细胞，并且Hu LCL1细胞DNA读数可以被映射回人类细胞。在标记步骤之后将珠子递送到NanoPen室。如实验3进行等温扩增，产生5.67ng(来自总共300个细胞)或2.62ng(来自总共150个细胞)。对每个文库进行如上所述运行的两个PCR循环，以确保用于NGS测序的P5、P7的存在，并且类似地进行清洁。图29A(来自150个细胞)和29B(来自300个细胞)显示了分别在随后的两个循环PCR扩增和清洁之后的两个(OKT3/hu LCL1)DNA文库。这些结果可以与从以标准孔板形式单独加工的OKT3细胞以及hu LCL1细胞产生的对照文库的尺寸分布迹线进行比较，如图29C(OKT3)和图29D(hu LCL1)所示。比较表明可能需要进一步优化以在微流体方案内获得更理想的片段分布。来自混合的OKT3/hu LCL1DNA文库的测序结果显示获得了具有两个条形码中的每一个的读数(数据未显示)。
原位条形码检测。在输出扩增的DNA产物后，如上所述的荧光标记的杂交探针的连续流动识别条形码位置。
实施例5.在DNA分离、库制备和扩增工作流程顺序中引入条形码化珠子并原位检测条形码化珠子。不希望受理论束缚，转座子的活性针对双链核酸，而不是单链结合寡核苷酸。在一个推论实验中显示了捕获珠子对这些条件的稳健性。将在实验3中制备的20微升珠子在相同实验条件下暴露于标记反应试剂。将转座子暴露的珠子和未暴露的对照珠子与1.4ng人标准DNA接触。将2.4微升每个珠子组用于等温扩增，使用2.4微升RPA(S521)中的成对引物(S521，Illumina)，并提供基本相似量的扩增DNA。结果显示，在用于DNA捕获之前暴露于转座子的捕获珠子产生合理等量的扩增产物，表明转座子不会降解捕获珠子上的捕获寡核苷酸。
表5.比较在等温扩增后暴露于标记反应条件的珠子和未暴露的珠子之间的产率。
实施例6.对已经进行RNA测序的相同细胞测序核DNA。图30A-F各自示出了一排OptoSelect装置的四个NanoPen室，其包含OKT3细胞和捕获珠子。系列照片是在进行RNA捕获、标记和输出的方案过程中拍摄的，如实验1中所示。在输入之前将
图30A-30F表明通过使用本文所述的进行RNA捕获/文库制备和DNA捕获/文库制备的方案，致密核仍然是用于DNA文库产生的核dsDNA的可行来源。因此，RNA和DNA的测序结果均可以从相同的单个细胞获得，并且可以与测序的RNA和DNA的特定单个细胞来源在OptoSelect装置内的位置相关联。这种将RNA/DNA测序结果的单个细胞来源的位置相关联的能力可以进一步与相同单个细胞的表型观察结果相关联，例如产生针对特定抗原的抗体的细胞。
引入带有条形码化引发序列的珠子(beds)的步骤显示在标记步骤之前或标记之后适当地进行(如在实验3中)。
另外，读取置于NanoPen室内的条形码化珠子上的条形码的步骤可以在标记之前、等温扩增之前、输出扩增的DNA之前或在输出扩增的DNA之后进行(如实验4所示)。或者，可以在输入生物细胞之前将珠子放置在NanoPen室内。在该实施方案中，还可以在将生物细胞带入微流体环境之前检测条形码。
实施例7.如OKT3细胞和OKT8细胞所证明的B细胞受体(BCR)捕获、测序文库制备和测序结果。
细胞：OKT3细胞(一种小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系)从ATCC获得(
OKT8细胞(一种小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系)从ATCC获得(
培养基：将伊思柯夫改良培养基(对于OKT3，
当在孵育期间灌注时，在引入OptoSelect装置之前，将培养基连续用含5％二氧化碳的空气条件化。
表6.实验中使用的寡核苷酸序列
实验：将OKT3细胞样品以200微升中2E6的密度引入OptoSelect装置中。通过光驱动的介电电泳力移动大约150个细胞，以向每个NanoPen室加载一个细胞。将每个细胞定位在最远离通向微流体通道(例如，分离区域)的开口的室的区段内。然后用50微升引发培养基冲洗OptoSelect装置一次。为了识别围住的OKT3细胞的位置，拍摄了OptoSelect装置的明场图像(未示出)。将OKT8细胞样品以200微升中2E6的密度引入OptoSelect装置中。通过光驱动的介电电泳力移动大约150个细胞，以在没有围住OKT3细胞的视场内向每个NanoPen室加载一个细胞。然后用50微升引发培养基冲洗OptoSelect装置一次。为了识别围住的OKT8细胞的位置，拍摄了OptoSelect装置的明场图像(未示出)。将具有如本文所述的捕获寡核苷酸(两个示例性但非限制性的序列是SEQ ID NO.101和102，参见表2)的条形码化珠子的样品以200微升中2E6的密度引入OptoSelect装置中。随后将单个独特条形码化珠子加载到每个被占据的室中。加载到具有单个生物细胞的NanoPen室中的珠子总数为126，其中57个珠子分配给OKT3细胞，69个珠子分配给OKT8细胞，并且每个珠子也位于每个室的未经历穿透流体流动的部分内。然后用50微升1×DPBS冲洗OptoSelect装置一次。
使裂解试剂(Single Cell Lysis Kit，Ambion目录号4458235)流入微流体通道并允许扩散到NanoPen室中。将单独围住的OKT3和OKT8细胞暴露于裂解缓冲液10分钟。然后用30微升1×DPBS冲洗OptoSelect装置一次。通过使终止裂解缓冲液(Single Cell LysisKit，Ambion目录号4458235)流入并在室温下孵育2分钟同时在微流体通道中没有流动来停止裂解。或者，可以使用裂解缓冲液(如10x裂解缓冲液，目录号635013，Clontech/Takara)来提供类似的结果，其优点是不需要使用终止裂解缓冲液。然后用30微升1×DPBS冲洗OptoSelect装置一次。在使用的条件下，核膜未被破坏。将释放的mRNA捕获到存在于相同NanoPen室内的条形码化珠上。
通过使RT试剂混合物(Thermo ScientificTM MaximaTM H Minus RT(Thermofisher，目录号EP0751))和模板转换寡核苷酸(SEQ ID NO.112)流入，将捕获的RNA逆转录成cDNA。在16℃下，允许酶在20分钟的时间内扩散到NanoPen室中，然后在42℃下反应90分钟。逆转录后，然后用30微升1×DPBS冲洗OptoSelect装置一次。
然后，通过如本文所述的荧光标记的杂交探针的多路流动识别每个捕获珠子的独特条形码。使每组荧光标记的探针的连续试剂流以1微摩尔(稀释在1×DPBS中)流入微流体装置的微流体通道中(或者，可以使用IDT双工缓冲液)，并允许其扩散到NanoPen室中。杂交后，通过用150微升1×DPBS冲洗OptoSelect装置除去背景信号。记录如此识别的每个细胞条形码的位置(例如，用该细胞条形码标记的珠子的NanoPen位置)并用于识别BCR序列从哪个特定细胞捕获到珠子上。在图31A和31B中，示出了用于两个单独的NanoPen室3441和1451的条形码检测的图像和结果。NanoPen室3441的条形码被确定为C3D11F22T31，其中条形码由四个卡式序列GAATACGGGG(SEQ ID NO.3)TTCCTCTCGT(SEQ ID NO.11)AACATCCCTC(SEQID NO.22)CCGCACTTCT(SEQ ID NO.31)形成。NanoPen室1451的条形码被确定为C1D11F24T31，其中条形码由四个卡式序列CAGCCTTCTG(SEQ ID NO.1)TTCCTCTCGT(SEQ IDNO.11)TTAGCGCGTC(SEQ ID NO.24)CCGCACTTCT(SEQ ID NO.31)形成。
检测后，在输出带有cDNA的捕获珠之前，用10mM Tris-HCl(200微升，0.5微升/秒)洗涤芯片两次。
使用光驱动的介电电泳力在位移缓冲液(10mM Tris-HCl)中将选择的带有条形码化cDNA的珠子从NanoPen室输出。一个输出含有来自分配OKT3的孔的47个珠子和来自分配OKT8的孔的69个珠子。随后，使用流动将从NanoPen室输出的珠子输出到微流体装置之外，并合并。
用外切核酸酶I(NEB，目录号M0293L)处理之后，输出组的珠子经受22个使用引物5’-ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3’(SEQ ID NO.113)的DNA扩增循环(
然后将粗扩增混合物分成两部分，其中两部分中的第一部分经历18个PCR循环，其采用针对重链的BCR特异性正向引物的混合物(SEQ ID NO114-132，表6)，其中第二部分经历18个PCR循环，其采用针对轻链的BCR特异性正向引物的混合物(SEQ ID NO 133-150，表6)(
用T4多核苷酸激酶(T4多核苷酸激酶，NEB，目录号M0201)处理纯化的和尺寸选择的含有扩增子的BCR序列，然后根据供应商的说明书，使用1x SPRI(固相可逆固定化)珠子(Agencourt AMPure XP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))纯化反应物。进行荧光定量(QubitTM,ThermoFisher Scientific)。
然后，纯化的T4多核苷酸激酶处理的含有扩增子的BCR序列(使用小于或等于10ng的BCR扩增子)自连接以产生环化DNA分子(T4DNA连接酶，目录号EL0011，ThermoFisherScientific)。超过检测限的任何量的DNA，大约0.5ng将足以进行环化反应。不超过约10ng对于驱动自环化而不是交叉连接到另一扩增子分子是有用的。
根据供应商的说明书，使用1xSPRI(固相可逆固定化)珠子(Agencourt AMPure XP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))纯化连接反应物，随后通过在2％琼脂糖凝胶(E-gelTMEX琼脂糖凝胶2％，目录号G401002，ThermoFisher Scientific)上的位置选择环化DNA分子。根据供应商的说明书进行凝胶提取(ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit，目录号D4001，Zymo Research)。
然后根据制造商的说明书，通过进行Not1限制酶消化(Not1-HF，NEB，目录号R3189S)，将纯化的环化DNA分子重新线性化，随后使反应失活。根据供应商的说明书，使用1x SPRI(固相可逆固定化)珠子(Agencourt AMPure XP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))纯化重新线性化的DNA。
重新线性化的DNA用P7接头序列正向引物(SEQ ID NO.153，表6)和含有P5接头序列的BCR恒定区引物(SEQ ID NO.154，表6)经历16个PCR循环(KAPA HiFi HotStartReadyMix，KK2601，KAPA Biosystems/Roche)。根据供应商的说明书，使用1×SPRI(固相可逆固定化)珠子(Agencourt AMPure XP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))纯化扩增的DNA分子。然后扩增的DNA产物用P7和P5接头序列引物(SEQ ID NO.153和155，表6)进行PCR，重链7个循环且轻链6个循环(KAPA HiFi HotStart Ready Mix，KK2601，KAPABiosystems/Roche)。根据供应商的说明书，使用1xSPRI(固相可逆固定化)珠子(AgencourtAMPure XP珠子(Beckman Coulter，目录号A63881))纯化得到的测序文库，随后按照在2％琼脂糖凝胶(E-gelTMEX Agarose Gels 2％，目录号G401002，ThermoFisher Scientific)上的尺寸(550-750bp)选择。根据供应商的说明书，进行凝胶提取(ZymocleanTMGel DNARecovery Kit，目录号D4001，Zymo Research)。
进行纯化的测序文库的荧光定量(QubitTM,ThermoFisher Scientific)。使用MiSeq测序仪(
对测序结果进行转换(de-plexed)以分别为了每个库(包括重链或轻链)通过包括在读数1和读数2引物中的索引，并为了由独特条形码序列识别的每个细胞产生序列数据的FASTQ文件。将包含OKT3和OKT8细胞系的可变区的针对抗原结合位点的关键子区的已知CDR3BCR序列与每个细胞的读取数据比对，并用于识别来自OKT3或OKT8细胞的读数。图32中的右侧栏显示来自细胞1-8的读数与OKT3序列身份(SEQ ID NO.157，表6)匹配，具有以下的CDR3序列：
TGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGG(SEQ ID NO.156)。
来自细胞9-12的读数与OKT8序列身份(SEQ ID NO.159)匹配，具有以下的CDR2序列：
TGTGGTAGAGGTTATGGTTACTACGTATTTGACCACTGG(SEQ ID No.158)。
还通过测序确定每个细胞的条形码，并显示细胞1-12的每个的条形码。将通过测序确定的条形码与通过上述试剂流动方法确定的条形码相匹配，允许细胞和基因组之间的明确关联。例如，上面针对NanoPen室1451通过流动试剂确定的条形码与细胞1匹配，其CDR3序列与OKT3细胞的表型匹配。对于NanoPen 3441，上述另一条形码匹配细胞9的条形码，其CDR3序列与OKT8的表型匹配。由于这是原理实验的证明，因此知道哪种类型的细胞被置于特定的NanoPen室内，并且测序结果显示条形码流动试剂检测与通过测序和预期的CDR3序列确定的条形码完美关联。这证明BCR序列数据可与源细胞的物理位置关联。
除了任何先前指出的修改之外，本领域技术人员可以在不脱离本说明书的精神和范围的情况下提出许多其他变型和替换安排，并且所附权利要求旨在涵盖这样的修改和安排。因此，尽管上面已经结合目前被认为是最实际和优选的方面的特定内容和细节描述了信息，但是对于本领域技术人员来说，显而易见的是，不脱离本文阐述的原理和概念的情况下可以进行许多修改，包括但不限于形式、功能、操作方式和使用。此外，如本文所用，实施例和实施方案在所有方面都仅是说明性的，不应被解释为以任何方式进行限制。此外，在本文中引用要素列表(例如，要素a、b、c)时，这样的引用旨在包括所列要素中的任何一个本身、少于所有列出要素的任何组合，以及/或所有列出要素的组合。此外，如本文所使用的，术语一个(a、an和one)可以各自与术语至少一个和一个或多个互换。还应注意，虽然本文使用术语步骤，但该术语可用于简单地引起对所述方法的不同部分的注意，并不意味着描绘方法的任何部分的起点或停止点，或以任何其他方式限制。
示例性实施方案
根据当前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
1.一种捕获物体，其包含多个捕获寡核苷酸，其中所述多个捕获寡核苷酸的每一个均包含：
引发序列；
捕获序列；和
条形码序列，其包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列。
2.实施方案1所述的捕获物体，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含相同的条形码序列。
3.实施方案1或2所述的捕获物体，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含5'最末端核苷酸和3'最末端核苷酸，
其中所述引发序列与所述5'最末端核苷酸相邻或包含所述5'最末端苷酸，
其中所述捕获序列与所述3'最末端核苷酸相邻或包含所述3'最末端核苷酸，并且
其中所述条形码序列位于所述引发序列的3'和所述捕获序列的5'。
4.实施方案1至3中任一项所述的捕获物体，其中所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均包含6至15个核苷酸。
5.实施方案1至4中任一项所述的捕获物体，其中所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均包含10个核苷酸。
6.实施方案1至5中任一项所述的捕获物体，其中所述条形码序列的三个或更多个卡式寡核苷酸序列串联连接而没有任何间隔的寡核苷酸序列。
7.实施方案1至6中任一项所述的捕获物体，其中所述条形码序列的所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均选自12至100个卡式寡核苷酸序列的多个。
8.实施方案1至7中任一项所述的捕获物体，其中所述条形码序列的所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均具有SEQ ID NO：1-40中任一个的序列。
9.实施方案1至8中任一项所述的捕获物体，其中所述条形码序列包含四个卡式寡核苷酸序列。
10.实施方案9所述的捕获物体，其中第一卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：1-10中任一个的序列；第二卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：11-20中任一个的序列；第三种卡式寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：21-30中任一个的序列；和第四卡式寡核苷酸序列具有SEQID NO：31-40中任一个的序列。
11.实施方案1至10中任一项所述的捕获物体，其中所述引发序列在与所述捕获寡核苷酸分离时引发聚合酶。
12.实施方案11所述的捕获物体，其中所述引发序列包含P7或P5引物的序列。
13.实施方案1至12中任一项所述的捕获物体，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个还包含独特分子标识符(UMI)序列。
14.实施方案13所述的捕获物体，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含不同的UMI序列。
15.实施方案13或14所述的捕获物体，其中所述UMI位于所述引发序列的3'和所述捕获序列的5'。
16.实施方案13至15中任一项所述的捕获物体，其中所述UMI序列是包含5至20个核苷酸的寡核苷酸序列。
17.实施方案13至15中任一项所述的捕获物体，其中所述UMI的所述寡核苷酸序列包含10个核苷酸。
18.实施方案1至17中任一项所述的捕获物体，其中每个捕获寡核苷酸还包含Not1限制性位点序列。
19.实施方案18所述的捕获物体，其中所述Not1限制性位点序列位于所述捕获序列的5'。
20.实施方案18或19所示的捕获物体，其中所述Not1限制性位点序列位于所述条形码序列的3'。
21.实施方案1至20中任一项所述的捕获物体，其中每个捕获寡核苷酸还包含一个或多个接头序列。
22.实施方案1至19中任一项所述的捕获物体，其中所述捕获序列包含poly-dT序列、随机六聚体序列或拼接末端序列。
23.多个捕获物体，其中所述多个捕获物体的每一个均是根据实施方案1至22中任一项所述的捕获物体，其中，对于所述多个捕获物体中的每一个，所述捕获物体的每个捕获寡核苷酸均包含相同的条形码序列，并且其中所述多个捕获物体的每一个的捕获寡核苷酸的条形码序列不同于所述多个捕获物体的每一个其他捕获物体的捕获寡核苷酸的条形码序列。
24.实施方案23所述的多个捕获物体，其中所述多个捕获物体包含至少256个捕获物体。
25.实施方案23所述的多个捕获物体，其中所述多个捕获物体包括至少10,000个捕获物体。
26.一种卡式寡核苷酸序列，其包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含SEQ IDNO：1至40中任一个的序列。
27.一种条形码序列，其包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，其中所述条形码序列的所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列中的每一个均具有SEQ ID NO：1-40中任一个的序列，并且其中所述条形码序列的每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列。
28.实施方案27所述的条形码序列，其包含三个或四个卡式寡核苷酸序列。
29.实施方案27或28所述的条形码序列，其中所述三个或更多个卡式寡核苷酸序列串联连接而没有任何间隔的寡核苷酸序列。
30.一组条形码序列，其包括至少64个不同的条形码序列，所述组的每个条形码序列均具有根据实施方案27至29中任一项所述的结构。
31.实施方案30所述的一组条形码序列，其中该组基本上由64、81、100、125、216、256、343、512、625、729、1000、1296、2401、4096、6561或10,000个条形码序列组成。
32.一种杂交探针，其包含：寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：41至80中任一个的序列；和荧光标记。
33.一种试剂，其包含多个杂交探针，其中所述多个杂交探针中的每一个均是根据实施方案32所述的杂交探针，并且其中所述多个杂交探针的每一个均(i)包含与多个杂交探针的每一个其他杂交探针的寡核苷酸序列不同的寡核苷酸序列和(ii)包含与所述多个杂交探针中的每一个其他杂交探针的荧光标记在光谱上可区分的荧光标记。
34.实施方案33所述的试剂，其中所述多个杂交探针由2至4个杂交探针组成。
35.实施方案33或34所述的试剂，其中：所述多个杂交探针的第一杂交探针包含选自SEQ ID NO：41-80的第一子组的序列和第一荧光标记；
所述多个杂交探针的第二杂交探针包含选自SEQ ID NO：41-80的第二子组的序列和与所述第一荧光标记在光谱上可区分的第二荧光标记，其中SEQ ID NO：41-80的第一和第二子组是非重叠子组。
36.实施方案35所述的试剂，其中：所述多个杂交探针的第三杂交探针包含选自SEQ ID NO：41-80的第三子组的序列，和与所述第一和第二荧光标记中的每一个在光谱上均可区分的第三荧光标记，其中SEQ ID NO：41-80的第一、第二和第三子组是非重叠子组。
37.实施方案36所述的试剂，其中：所述多个杂交探针的第四杂交探针包含选自SEQ ID NO：41-80的第四子组的序列，和与所述第一、第二和第三荧光标记中的每一个在光谱上均可区分的第四荧光标记，其中SEQ ID NO：41-80的第一、第二、第三和第四子组是非重叠子组。
38.实施方案35至37中任一项所述的试剂，其中SEQ ID NO：41-80的每个子组包含至少10个序列。
39.实施方案35至37中任一项所述的试剂，其中所述第一子组包含SEQ ID NO：41-50，其中所述第二子组包含SEQ ID NO：51-60，其中所述第三子组包含SEQ ID NO：61-70，并且其中所述第四子组包含SEQ ID NO：71-80。
40.一种试剂盒，其包含根据实施方案33至39中任一项所述的多个试剂，其中每个试剂的多个杂交探针均形成与多个试剂的每一个其他试剂的杂交探针组不重叠的组。
41.实施方案40所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个所述试剂。
42.一种原位识别微流体装置内的一个或多个捕获物体的方法，所述方法包括：
将所述一个或多个捕获物体的单个捕获物体置于位于所述微流体装置的外壳内的一个或多个隔离坞中的每一个中，其中每个捕获物体均包括多个捕获寡核苷酸，并且其中所述多个捕获寡核苷酸的每一个均包含：
引发序列；
捕获序列；和
条形码序列，其中所述条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列；
使包含第一组杂交探针的第一试剂溶液流入所述微流体装置的所述外壳内的流动区域，其中所述流动区域流体连接到所述一个或多个隔离坞中的每一个，并且其中所述第一组的每个杂交探针均包含：
与所述一种或多种捕获物体中的任一个的所述捕获寡核苷酸的任一个的所述条形码序列的任一个所包含的卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，其中第一组中的每个杂交探针的所述互补寡核苷酸序列均不同于所述第一组中所述杂交探针的任何其他互补寡核苷酸序列；和
荧光标记，其选自一组在光谱上可区分的荧光标记，其中所述第一组中每个杂交探针的荧光标记不同于所述第一组杂交探针中每一个其他杂交探针的荧光标记；
将所述第一组的所述杂交探针与所述一个或多个捕获物体中的任一个的所述捕获寡核苷酸的任一个的所述条形码序列的任一个中的相应的卡式寡核苷酸序列杂交；
对于所述第一组杂交探针的每个杂交探针，检测与所述一个或多个捕获物体中的任一个关联的相应荧光信号；并且
对于置于所述一个或多个隔离坞中的一个中的每个捕获物体，生成记录，其包括(i)隔离坞在所述微流体装置的所述外壳内的位置，和(ii)所述第一组杂交探针的每个杂交探针的所述相应荧光信号与所述捕获物体的关联或未关联，其中关联和未关联的所述记录构成将所述捕获物体与所述隔离坞联系起来的条形码。
43.实施方案42所述的方法，还包括：
使包含第n组杂交探针的第n试剂溶液流入所述微流体装置的所述流动区域，其中所述第n组的每个杂交探针均包括：与由所述一个或多个捕获物体中任一个的所述捕获寡核苷酸的任一个的所述条形码序列任一个包含的卡式寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，其中第n组中每个杂交探针的所述互补寡核苷酸序列不同于流入所述微流体装置的所述流动区域的所述第n组杂交探针和任何其他组杂交探针中所述杂交探针的任何其他互补寡核苷酸序列；和
荧光标记，其选自一组在光谱可区分的荧光标记，其中所述第n组中每个杂交探针的荧光标记均不同于所述第n组杂交探针中任何其他杂交探针的荧光标记；
将所述第n组的所述杂交探针与所述一个或多个捕获物体中任一个的所述捕获寡核苷酸的任一个的条形码序列任一个中的相应卡式寡核苷酸序列杂交；
对于所述第n组杂交探针的每个杂交探针，检测与所述一个或多个捕获物体中任一个相关的相应荧光信号；和
对于置于所述一个或多个隔离坞中的一个内的每个捕获物体，补充以下记录：所述第n组杂交探针的每个杂交探针的所述相应荧光信号与所述捕获物体的关联或不关联，其中n是一组具有{2，...，m}值的正整数，
其中m是具有2或更大值的正整数，并且其中对所述正整数组中的每个n值，重复上述使所述第n试剂流入、使所述第n组杂交探针杂交、检测所述相应的荧光信号和补充所述记录的步骤。
44.实施方案43所述的方法，其中m具有大于或等于3且小于或等于20(例如，大于或等于5且小于或等于15)的值。
45.实施方案43所述的方法，其中m具有大于或等于8且小于或等于12(例如10)的值。
46.实施方案43至45中任一项所述的方法，其中使第一试剂溶液和/或所述第n试剂溶液流入所述流动区域进一步包括允许所述第一试剂溶液和/或所述第n试剂溶液通过扩散平衡到所述一个或多个隔离坞中。
47.实施方案43至45中任一项所述的方法，其中检测与所述一个或多个捕获物体中的任一个相关的所述相应荧光信号还包括：
使没有杂交探针的洗涤溶液流过所述微流体装置的所述流动区域；
通过将所述洗涤溶液扩散到所述一个或多个隔离坞中来平衡，从而允许所述第一组或所述n组中任何一组的未杂交的杂交探针扩散离开所述一个或多个隔离坞；并且进一步地，其中在检测所述荧光信号之前进行所述洗涤溶液的所述流入。
48.实施方案43至47中任一项所述的方法，其中每个捕获物体的每个捕获寡核苷酸的每个条形码序列均包含三个卡式寡核苷酸序列。
49.实施方案48所述的方法，其中所述第一组杂交探针和所述n组杂交探针的每一组包含三个杂交探针。
50.实施方案43至47中任一项所述的方法，其中每个捕获物体的每个捕获寡核苷酸的每个条形码序列包含四个卡式寡核苷酸序列。
51.实施方案50所述的方法，其中所述第一组杂交探针和所述n组杂交探针的每一组包含四个杂交探针。
52.实施方案42至51中任一项所述的方法，其中放置所述一个或多个捕获物体中的每一个包括将所述一个或多个捕获物体中的每一个置于所述微流体装置内的所述一个或多个隔离坞的分离区域内。
53.实施方案42至52中任一项所述的方法，还包括将一种或多种生物细胞置于所述微流体装置的所述一个或多个隔离坞中。
54.如实施方案53所述的方法，其中将所述一个或多个生物细胞中的每一个置于所述一个或多个隔离坞中的不同的一个中。
55.实施方案53或54所述的方法，其中将所述一种或多种生物细胞置于所述微流体装置的所述一个或多个隔离坞的所述分离区域内。
56.实施方案53至55中任一项所述的方法，其中将所述一个或多个生物细胞中的至少一个置于隔离坞中，所述隔离坞具有置于其中的所述一个或多个捕获物体中的一个。
57.实施方案53至56中任一项所述的方法，其中所述一个或多个生物细胞是来自克隆群的多个生物细胞。
58.实施方案53至57中任一项所述的方法，其中在放置所述一个或多个捕获物体之前放置所述一个或多个生物细胞。
59.实施方案42至58中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包括介电电泳(DEP)配置，并且其中使用介电电泳(DEP)力将所述一个或多个捕获物体置于一个或多个隔离坞中。
60.实施方案53至59中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包括介电电泳(DEP)配置，并且所述将所述一个或多个生物细胞置于所述一个或多个隔离坞中使用介电电泳(DEP)力进行。
61.实施方案42至60中任一项所述的方法，其中所述一个或多个捕获物体是根据实施方案1至25中任一项所述的捕获物体。
62.实施方案42至61中任一项所述的方法，其中每个捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸中的至少一个还包含通过所述捕获序列捕获的靶核酸。
63.一种用于将基因组数据与微流体装置中的生物细胞关联的方法，包括：
将捕获物体置于微流体装置的隔离坞中，其中所述捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：
引发序列；
捕获序列；和
条形码序列，其中条形码序列包括三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列；并且
其中所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括相同的条形码序列；
原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列并记录所识别的条形码序列和所述隔离坞之间的关联；
将所述生物细胞置于所述隔离坞中；
裂解所述生物细胞并允许从所述裂解的生物细胞释放的核酸被所述捕获物体所包含的所述多个捕获寡核苷酸捕获；
转录所捕获的核酸，从而产生多个转录的核酸，每个转录的核酸均包括与所述捕获寡核苷酸之一共价连接的捕获的互补核酸序列；
对所述转录的核酸和所述条形码序列进行测序，从而获得与所述条形码序列的读取序列相关的多个转录的核酸的读取序列；
基于所述读取序列识别所述条形码序列；和
使用所述读取序列识别的条形码序列和所述原位识别的条形码序列将所述多个转录的核酸的读取序列与所述隔离坞关联，从而将所述多个转录的核酸的读取序列与置于所述隔离坞中的所述生物细胞关联。
64.实施方案63所述的方法，还包括：观察所述生物细胞的表型；并且将所述多个转录的核酸的所述读取序列与所述生物细胞的所述表型关联。
65.实施方案63所述的方法，还包括：观察所述生物细胞的表型，其中所述生物细胞是克隆群的代表；并且将所述多个转录的核酸的所述读取序列与所述生物细胞和所述克隆群的所述表型关联。
66.实施方案64或65所述的方法，其中观察所述生物细胞的所述表型包括观察所述至少一种生物细胞的至少一种物理特征。
67.实施方案64或65所述的方法，其中观察所述生物细胞的所述表型包括对所述生物细胞进行测定并观察在所述测定期间产生的可检测信号。
68.实施方案67所述的方法，其中所述测定是蛋白表达测定。
69.实施方案63至68中任一项所述的方法，其中在将所述生物细胞置于所述隔离坞中之前，进行原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列并记录所述识别的条形码序列与所述隔离坞之间的关联。
70.实施方案63至68中任一项所述的方法，其中在将所述生物细胞引入所述隔离坞之后，进行原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列并记录所述识别的条形码序列与所述隔离坞之间的关联。
71.实施方案64至68中任一项所述的方法，其中在观察所述生物细胞的表型之后，放置所述捕获物体，并原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列并记录所述识别的条形码序列与所述隔离坞之间的关联。
72.实施方案63至68中任一项所述的方法，其中在裂解所述生物细胞并允许从所述裂解的生物细胞释放的所述核酸被所述捕获物体包含的所述多个捕获寡核苷酸捕获之后，进行原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列并记录所述识别的条形码序列与所述隔离坞之间的关联。
73.实施方案63至72中任一项所述的方法，其中原位识别所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列包括进行实施方案42至60中任一项所述的方法。
74.实施方案63至73中任一项所述的方法，其中所述捕获物体是实施方案1至23中任一项所述的捕获物体。
75.实施方案63至74中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳包括介电电泳(DEP)配置，并且其中将所述捕获物体置于所述隔离坞中包括使用介电电泳(DEP)力来移动所述捕获物体。
76.实施方案63至75中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包含介电电泳(DEP)配置，并且其中将所述生物细胞置于所述隔离坞中包括使用介电电泳(DEP)力移动所述生物细胞。
77.实施方案63至76中任一项所述的方法，还包括：
将多个捕获物体置于所述微流体装置的相应的多个隔离坞中；
将多个生物细胞置于相应的多个隔离坞中，并
根据所述方法的所述另外步骤处理所述多个捕获物体和多个生物细胞中的每一个。
78.一种用于产生核酸文库的试剂盒，包括：
微流体装置，其包括外壳，其中所述外壳包括流动区域和通向所述流动区域的多个隔离坞；和
多个捕获物体，其中所述多个捕获物体中的每一个均包括多个捕获寡核苷酸，所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：
捕获序列；和
条形码序列，其包含至少三个卡式寡核苷酸序列，其中所述条形码序列的每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的其他卡式寡核苷酸序列，并且其中多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含相同的条形码序列。
79.实施方案78所述的试剂盒，其中所述微流体装置的所述外壳还包含介电电泳(DEP)配置。
80.实施方案78或79所述的试剂盒，其中所述多个捕获物体是根据实施方案23至25中任一项所述的多个捕获物体。
81.实施方案78至80中任一项所述的试剂盒，其中所述多个捕获物体中的每一个均单独地置于多个隔离坞的相应隔离坞中。
82.实施方案81所述的试剂盒，其还包含识别表，其中所述识别表将所述多个捕获物体中的每一个的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列与所述多个隔离坞的所述相应隔离坞关联。
83.实施方案78至82中任一项所述的试剂盒，其还包含：多个杂交探针，每个杂交探针均包含：
与所述多个捕获物体中任一个的所述多个捕获寡核苷酸的所述卡式寡核苷酸序列的任一个互补的寡核苷酸序列；和
标记，其中所述多个杂交探针的每一个的所述互补序列与不同的卡式寡核苷酸序列互补；并且
其中所述多个杂交探针的每一个的所述标记选自一组在光谱上可区分的的标记。
84.实施方案83所述的试剂盒，其中所述多个杂交探针的每个互补序列均包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：41至80中任一个的序列。
85.实施方案83或84所述的试剂盒，所述标记是荧光标记。
86.一种用于提供来自生物细胞的条形码化cDNA文库的方法，包括：
将所述生物细胞置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；
将捕获物体置于所述隔离坞中，其中所述捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括：
引发序列，其结合引物；
捕获序列；和
条形码序列，其中所述条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的任何其他卡式寡核苷酸序列；
裂解所述生物细胞并允许从所述裂解的生物细胞释放的核酸被所述捕获物体包含的所述多个捕获寡核苷酸捕获；和
转录所述捕获的核酸，从而产生位于捕获物体的多个条形码化cDNA，每个条形码化cDNA均包含(i)与所述捕获的核酸中相应的一个互补的寡核苷酸序列，其共价连接到(ii)所述多个捕获寡核苷酸中的一个。
87.实施方案86所述的方法，其中所述生物细胞是免疫细胞。
88.实施方案86所述的方法，其中所述生物细胞是癌细胞。
89.实施方案86所述的方法，其中所述生物细胞是干细胞或祖细胞。
90.实施方案86所述的方法，其中所述生物细胞是胚胎。
91.实施方案86至90中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是单个生物细胞。
92.实施方案86至91中任一项所述的方法，其中所述放置所述生物细胞还包括标记所述生物细胞。
93.实施方案86至92中任一项所述的方法，其中所述捕获物体是根据实施方案1至22中任一项所述的捕获物体。
94.实施方案86至93中任一项所述的方法，其中所述多个捕获寡核苷酸中的一个或多个的所述捕获序列包含寡dT引物序列。
95.实施方案86至93中任一项所述的方法，其中所述多个捕获寡核苷酸中的一个或多个的所述捕获序列包含基因特异性引物序列。
96.实施方案95所述的方法，其中所述基因特异性引物序列靶向编码T细胞受体(TCR)的mRNA序列。
97.实施方案95所述的方法，其中所述基因特异性引物序列靶向编码B细胞受体(BCR)的mRNA序列。
98.实施方案86至97中任一项所述的方法，其中所述多个捕获寡核苷酸中的一个或多个的所述捕获序列与所述释放的核酸之一结合并引发所述释放的核酸，从而允许聚合酶转录所捕获的核酸。
99.实施方案86至98中任一项所述的方法，其中所述捕获物体包括磁性组件。
100.实施方案86至99中任一项所述的方法，其中在将所述捕获物体置于所述隔离坞中之前，将所述生物细胞置于所述隔离坞中。
101.实施方案86至99中任一项所述的方法，其中在将所述生物细胞置于所述隔离坞中之前，将所述捕获物体置于所述隔离坞中。
102.实施方案86至101中任一项所述的方法，还包括：原位识别所述捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列，同时所述捕获物体位于所述隔离坞中。
103.实施方案102所述的方法，其中所述识别所述条形码通过使用实施方案42至62中任一项所述的方法进行。
104.实施方案102或103所述的方法，其中在裂解所述生物细胞之前进行识别所述条形码序列。
105.实施方案86至104中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳包含至少一个涂覆的表面。
106.实施方案105所述的方法，其中所述至少一个涂覆的表面包含共价连接的表面。
107.实施方案105或106所述的方法，其中所述至少一个涂覆的表面包含亲水或带负电荷的涂覆的表面。
108.实施方案86至107中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包含介电电泳(DEP)配置，并且其中通过在所述生物细胞和/或所述捕获物体上或附近施加介电电泳(DEP)力来放置所述生物细胞和/或放置所述捕获物体。
109.实施方案86至108中任一项所述的方法，其中所述微流体装置还包含多个隔离坞。
110.实施方案109所述的方法，还包括：将多个所述生物细胞置于所述多个隔离坞中。
111.实施方案110所述的方法，其中所述多个所述生物细胞是克隆群。
112.实施方案110或111所述的方法，其中将所述多个所述生物细胞置于所述多个隔离坞中包括将所述多个生物细胞中的基本上仅一个生物细胞置于所述多个隔离坞的相应隔离坞中。
113.实施方案109至112中任一项所述的方法，还包括：将多个所述捕获物体置于所述多个隔离坞中。
114.实施方案113所述的方法，其中将所述多个所述捕获物体置于所述多个隔离坞中包括将基本上仅一个捕获物体置于所述多个隔离坞的相应一个隔离坞中。
115.实施方案113或114所述的方法，其中在所述裂解所述生物细胞或所述多个所述生物细胞之前，将所述多个捕获物体置于所述多个隔离坞中。
116.实施方案113至115中任一项所述的方法，其中所述多个所述捕获物体是根据实施方案23所述的多个捕获物体。
117.实施方案86至116中任一项所述的方法，还包括：从所述微流体装置输出所述捕获物体或所述多个所述捕获物体。
118.实施方案117所述的方法，其中输出所述多个所述捕获物体包括分别输出所述多个所述捕获物体中的每一个。
119.实施方案118所述的方法，还包括：将所述多个捕获物体中的每一个递送到所述微流体装置外部的单独目标容器。
120.实施方案86至119中任一项所述的方法，其中以下的一个或多个以自动化方式进行：所述放置所述生物细胞或多个所述生物细胞；所述放置所述捕获物体或所述多个捕获物体；所述裂解所述生物细胞或所述多个所述生物细胞以及所述允许从所述裂解的所述生物细胞或所述多个所述生物细胞释放的核酸被捕获；所述转录；和所述原位识别所述捕获物体或所述多个捕获物体的每一个的所述条形码序列。
121.一种提供条形码化测序文库的方法，包括：
扩增通过实施方案86至120中任一项所述的方法获得的捕获物体的cDNA文库或多个所述捕获物体中的每一个的cDNA文库；并且
标记所述扩增的DNA文库或所述多个cDNA文库，从而产生一个或多个条形码化测序文库。
122.实施方案121所述的方法，其中扩增所述cDNA文库或所述多个cDNA文库包括引入库索引序列，其中所述库索引序列包含4至10个核苷酸。
123.实施方案122所述的方法，还包括组合多个所述条形码化测序文库，其中所述多个条形码化测序文库中的每一个均包含不同的条形码序列和/或不同的库索引序列。
124.一种提供来自生物微物体的条形码化基因组DNA文库的方法，包括
将包含基因组DNA的生物微物体置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；
使所述生物微物体与能够破坏所述生物微物体的核被膜的裂解试剂接触，从而释放所述生物微物体的基因组DNA；
标记所述释放的基因组DNA，从而产生多个标记的基因组DNA片段，其具有由第一标记插入序列限定的第一末端和由第二标记插入序列定义的第二末端；
将捕获物体置于所述隔离坞中，其中所述捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含：
第一引发序列；
第一标记插入捕获序列；和
条形码序列，其中所述条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列；
使多个标记的基因组DNA片段中的一个与(i)所述捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸中的一个的所述第一标记插入捕获序列、(ii)包含与第二标记插入序列、随机引物序列或基因特异性引物序列连接的第二引发序列的扩增寡核苷酸，和(iii)包含链置换酶和聚合酶的酶混合物接触；
将所述接触的多个标记的基因组DNA片段孵育一段时间，从而同时扩增所述多个标记的基因组DNA片段中的所述一个，并将所述捕获寡核苷酸和所述扩增寡核苷酸添加到所述多个标记的基因组DNA片段的所述一个的末端，以产生所述条形码化基因组DNA文库；并
从所述微流体装置输出所述条形码化基因组DNA文库。
125.实施方案124所述的方法，其中在将所述捕获物体置于所述隔离坞中之前，将所述生物微物体置于所述隔离坞中。
126.实施方案124或125所述的方法，其中所述生物微物体是生物细胞。
127.实施方案124或125所述的方法，其中所述生物微物体是生物细胞(例如真核细胞)的细胞核。
128.实施方案126或127所述的方法，其中所述生物细胞是免疫细胞。
129.实施方案126或127所述的方法，其中所述生物细胞是癌细胞。
130.实施方案124至129中任一项所述的方法，其中所述裂解试剂包含至少一种核糖核酸酶抑制剂。
131.实施方案124至130中任一项所述的方法，其中所述标记包使所述释放的基因组DNA与载有(i)包含所述第一标记插入序列的第一双链DNA片段和(ii)包含所述第二标记插入序列的第二双链DNA片段的转座酶接触。
132.实施方案131所述的方法，其中所述第一双链DNA片段包含与第三引发序列连接的第一拼接末端序列，并且其中所述第二双链DNA片段包含与第四引发序列连接的第二拼接末端序列。
133.实施方案131或132所述的方法，其中所述捕获物体的每个捕获寡核苷酸的所述第一标记插入捕获序列包含与所述第一标记插入序列至少部分互补的序列。
134.实施方案131至133中任一项所述的方法，其中所述扩增寡核苷酸的所述第二标记插入捕获序列包含与所述第二标记插入序列至少部分互补的序列。
135.实施方案124至134中任一项所述的方法，其中所述捕获物体是根据实施方案1至20中任一项所述的捕获物体。
136.实施方案124至135中任一项所述的方法，其中所述捕获物体包括磁性组分。
137.实施方案124至136中任一项所述的方法，还包括：
原位识别所述捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列，同时使所述捕获物体位于所述隔离坞中。
138.实施方案137所述的方法，其中所述识别所述条形码序列使用实施方案42至62中任一项所述的方法进行。
139.实施方案137或138所述的方法，其中识别所述条形码序列在裂解所述生物细胞之前进行。
140.实施方案124至139中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳包含至少一个涂覆的表面。
141.实施方案124至140中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳包含至少一个条件化的表面。
142.实施方案141所述的方法，其中所述条件化的表面包含共价结合的亲水部分或带负电荷的部分。
143.实施方案124至142中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包括介电电泳(DEP)配置，并且其中通过在所述生物细胞和/或所述捕获物体上或附近施加介电电泳(DEP)力来放置所述生物细胞和/或放置所述捕获物体。
144.实施方案124至143中任一项所述的方法，其中所述微流体装置还包含多个隔离坞。
145.实施方案144所述的方法，还包括：将多个所述生物微物体置于所述多个隔离坞中。
146.实施方案145所述的方法，其中所述多个所述生物微物体是生物细胞的克隆群。
147.实施方案145或146所述的方法，其中将所述多个所述生物微物体置于所述多个隔离坞中包括将所述多个生物微物体中的基本上仅一个生物微物体置于所述多个隔离坞的相应隔离坞中。
148.实施方案144至147中任一项所述的方法，还包括：将多个所述捕获物体置于所述多个隔离坞中。
149.实施方案148所述的方法，其中将所述多个所述捕获物体置于所述多个隔离坞中包括将基本上仅一个捕获物体置于所述多个隔离坞的相应一个隔离坞中。
150.实施方案148或149所述的方法，其中在所述裂解所述生物微物体或所述多个所述生物微物体之前，将所述多个捕获物体置于所述多个隔离坞中。
151.实施方案148至150中任一项所述的方法，其中所述多个所述捕获物体是根据实施方案23的多个捕获物体。
152.实施方案124至151中任一项所述的方法，还包括：从所述微流体装置输出所述捕获物体或所述多个所述捕获物体。
153.实施方案152所述的方法，其中输出所述多个所述捕获物体包括分别输出所述多个所述捕获物体中的每一个。
154.实施方案153所述的方法，还包括：将所述多个捕获物体中的每一个所述捕获物体递送到所述微流体装置外部的单独目标容器。
155.实施方案145至154中任一项所述的方法，其中对于包含所述多个生物微物体之一的所述多个所述隔离坞的每一个，所述标记、接触和孵育的步骤基本上同时进行。
156.实施方案124至155中任一项所述的方法，其中以下的一个或多个以自动化方式进行：所述放置所述生物微物体或所述多个所述生物微物体；所述放置所述捕获物体或所述多个所述捕获物体；所述裂解所述生物微物体或所述多个所述生物微物体以及所述允许从所述裂解的生物细胞或所述多个所述生物细胞释放的核酸被捕获；所述标记所述释放的基因组DNA；所述接触所述多个标记的基因组DNA片段中的一个；所述孵育所述接触的多个标记的基因组DNA片段；所述输出所述条形码化基因组DNA文库或所述多个DNA文库；以及所述原位识别所述捕获物体或所述多个所述捕获物体的每一个所述捕获物体的所述条形码序列。
157.一种提供来自单个生物细胞的条形码化cDNA文库和条形码化基因组DNA文库的方法，包括：
将所述生物细胞置于位于微流体装置的外壳内的隔离坞中；
将第一捕获物体置于所述隔离坞中，其中所述第一捕获物体包含多个捕获寡核苷酸，多个捕获寡核苷酸中的每一个均包含：
第一引发序列；
第一捕获序列；和
第一条形码序列，其中所述第一条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述第一条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列；
通过进行实施方案86至123中任一项所述的方法获得所述条形码化cDNA文库，其中裂解所述生物细胞以使所述生物细胞的质膜降解，从所述生物细胞释放胞质RNA，同时使所述生物细胞的核被膜保持完整，从而提供带有来自所述生物细胞的所述RNA的所述条形码化cDNA文库的所述第一捕获物体；
从所述微流体装置输出带有所述cDNA文库的第一捕获物体；
将第二捕获物体置于所述隔离坞中，其中所述第二捕获物体包括多个捕获寡核苷酸，每个均包括：
第二引发序列；
第一标记插入捕获序列；和
第二条形码序列，其中所述第二条形码序列包含三个或更多个卡式寡核苷酸序列，每个卡式寡核苷酸序列均不同于所述第二条形码序列的每一个其他卡式寡核苷酸序列；
通过进行实施方案124至156中任一项所述的方法获得所述条形码化基因组DNA文库，其中来自所述生物细胞的多个标记的基因组DNA片段与所述第二捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸中的一个的所述第一标记插入捕获序列接触，从而提供来自所述生物细胞的所述基因组DNA的所述条形码化基因组DNA文库；并
从所述微流体装置输出所述条形码化基因组DNA文库。
158.实施方案157所述的方法，还包括：识别所述第一捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列。
159.实施方案158所述的方法，其中在将所述生物细胞置于所述隔离坞中之前；在从所述生物细胞的所述RNA获得所述条形码化cDNA文库之前；或者在从微流体装置输出带有所述条形码化cDNA文库的第一捕获物体之前，进行识别所述第一捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列。
160.实施方案157至159中任一项所述的方法，还包括：
识别所述第二捕获物体的所述多个寡核苷酸的所述条形码序列。
161.实施方案160所述的方法，其中在获得所述条形码化基因组DNA文库之前或在从所述微流体装置输出所述条形码化基因组DNA文库之后进行识别所述第二次捕获的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列。
162.实施方案157至161中任一项所述的方法，其中使用实施方案42至60中任一项所述的方法进行识别所述第一或所述第二捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列。
163.实施方案157至162中任一项所述的方法，其中所述第一捕获物体和所述第二捕获物体各自是实施方案1至22中任一项所述的捕获物体。
164.实施方案157至163中任一项所述的方法，其中所述第一捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述第一引发序列不同于所述第二捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述第二引发序列。
165.实施方案157至164中任一项所述的方法，其中所述第一捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述第一捕获序列不同于所述第二捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述第一标记插入捕获序列。
166.实施方案157至165中任一项所述的方法，其中所述第一捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列与所述第二捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的所述条形码序列相同。
167.一种提供条形码化B细胞受体(BCR)测序文库的方法，包括：
从B淋巴细胞产生条形码化cDNA文库，其中所述产生根据实施方案86至109中任一项所述的方法来进行，其中所述条形码化cDNA文库置于包括多个捕获寡核苷酸的捕获物体上，所述多个捕获寡核苷酸中的每一个均包括Not1限制性位点序列；
扩增所述条形码化cDNA文库；
从所述条形码化cDNA文库中选择条形码化BCR序列，从而产生富含条形码化BCR序列的文库；
环化来自富含条形码化BCR序列的所述文库的序列，从而产生环化的条形码化BCR序列文库；
使所述环化的条形码化BCR序列文库重新线性化以提供重排的条形码化BCR序列的文库，每个BCR序列将所述BCR序列3’的恒定(C)区呈递到相应的可变(V)子区和/或相应的多样性(D)子区；并且，
添加测序接头并对所述V子区和/或所述D子区进行亚选择，从而产生条形码化BCR测序文库。
168.实施方案167所述的方法，还包括扩增所述BCR测序文库以提供条形码化BCR子区序列的扩增文库。
169.实施方案167或168所述的方法，其中使用通用引物进行扩增所述条形码化cDNA文库。
170.实施方案167至169中任一项所述的方法，其中所述选择BCR序列区包括对BCR序列选择性进行聚合酶链反应(PCR)，从而产生所述条形码化BCR区选择性扩增DNA文库。
171.实施方案167至170中任一项所述的方法，其中所述选择条形码化BCR序列还包括添加至少一种测序引物序列和/或至少一种索引序列。
172.实施方案167至171中任一项所述的方法，其中环化来自富含条形码化BCR序列的所述文库的序列包括将每一个条形码化BCR序列的5'末端连接至其各自的3'末端。
173.实施方案167至172中任一项所述的方法，其中使所述环化的条形码化BCR序列文库重新线性化包括在所述Not1限制性位点消化所述环化的条形码化BCR序列文库中的每一个。
174.实施方案167至173中任一项所述的方法，其中添加所述测序接头和对V子区和/或D子区进行亚选择包括进行PCR，从而添加测序接头并对所述V子区和/或D子区进行亚选择。
175.实施方案167至174中任一项所述的方法，其中所述捕获物体是根据实施方案1至22中任一项所述的捕获物体。
176.实施方案167至175中任一项所述的方法，还包括：
使用实施方案42至60中任一项所述的方法识别所述捕获物体的所述多个捕获寡核苷酸的条形码序列。
177.实施方案176所述的方法，其中在扩增所述条形码化cDNA文库之前进行所述识别。
178.实施方案177所述的方法，其中在产生所述条形码化cDNA文库的同时进行所述识别。
179.实施方案167至178中任一项所述的方法，其中任何以下步骤在位于微流体装置的外壳内的隔离坞中进行：所述扩增所述条形码化cDNA文库；对条形码化BCR序列选择性进行所述聚合酶链式反应(PCR)；环化序列；在所述Notl限制性位点处使所述环化的条形码化BCR序列文库重新线性化；和添加所述测序接头和对V子区和/或D子区进行亚选择。
序列表信息
