一种构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物和方法
技术领域
本发明涉及医药生物技术，尤其是涉及一种构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物和方法。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞属于机体固有免疫系统，具有抗病毒感染和消灭肿瘤细胞的功能([1]1.Guillerey C,Huntington ND,Smyth MJ.Targeting natural killer cells incancer immunotherapy.Nat Immunol 2016,17(9):1025-1036)。NK细胞免疫球蛋白样受体位于细胞膜表面，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，其能够与人淋巴细胞抗原Ⅰ型(HLA-Ⅰ)结合，通过信号转导作用激活或抑制NK细胞的杀伤作用。NK细胞免疫球蛋白样受体具有高度的多态性，能够特异性识别自身HLA-Ⅰ，抑制NK细胞活化对自身细胞进行杀伤。当细胞恶变或细胞受到病毒感染，HLA-Ⅰ表达下降，从而激活NK细胞对其进行靶向杀伤。检测NK细胞免疫球蛋白样受体多样性有助于深入了解其识别HLA-Ⅰ后活化或抑制的机制，在NK细胞免疫治疗、移植等方面具有广泛的应用([2]Lanier LL,Phillips JH.Inhibitory MHC class I receptorson NK cells and T cells.Immunol Today 1996,17(2):86-91；[3]Parham P,Norman PJ,Abi-Rached L,Guethlein LA.Human-specific evolution of killer cellimmunoglobulin-like receptor recognition of major histocompatibility complexclass I molecules.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2012,367(1590):800-811)。14个基因共同参与了NK细胞免疫球蛋白样受体构成，其中4个基因为固有基因，存在于所有个体，剩余的10个基因属于可变基因，这14种基因随机重组，表达在NK细胞膜表面，不同克隆的NK细胞表达1种或多种受体，共同组成了NK细胞免疫球蛋白样受体组库([4]SingleRM,Martin MP,Gao X,Meyer D,Yeager M,Kidd JR,Kidd KK,Carrington M.Globaldiversity and evidence for coevolution of KIR and HLA.Nat Genet 2007,39(9):1114-1119；[5]Campbell KS,Purdy AK.Structure/function of human killer cellimmunoglobulin-like receptors:lessons from polymorphisms,evolution,crystalstructures and mutations.Immunology 2011,132(3):315-325)。目前，关于NK细胞免疫球蛋白样受体多态性的检测还主要基于传统的PCR技术，针对每个受体基因设计特异性PCR引物进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳观察基因的表达与缺失情况。然而此种方法，PCR次数多、耗时长、步骤繁琐，不利于大规模检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的NK细胞免疫球蛋白样受体多样性检测效率低等问题，提供一种构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物和方法。
所述构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物为：
正向引物1：5’-gtgaccttgtcctgcagctc-3’；
反向引物1：5’-gggccctgccacccacggagg-3’；
正向引物2：5’-agcttggttcagtgggtgtg-3’；
反向引物2：5’-ccactgaggtcccaatcaga-3’。
所述构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的方法，包括以下步骤：
1)人外周血淋巴细胞分离；
在步骤1)中，所述人外周血淋巴细胞分离的具体方法可为：
1.1抗凝血3ml在紫色抗凝管中置好；
1.2无菌避光分装3ml Solarbio公司人外周血淋巴细胞分离液，再沿着试管壁缓慢添加3ml抗凝血；。
1.3 25℃800g离心25min。
1.4离心完成后见溶液分为4层，其中第1层血浆层与第3层分离液中间的就是淋巴细胞层(白膜层)，吸取白膜层至另一无菌15ml离心管中；
1.5向白膜层中加入10ml Solarbio公司HANK’S BALANCED SALT MIXTURE，25℃250g离心10min；
1.6吸掉上清，加入5ml Solarbio公司HANK’S BALANCED SALT MIXTURE重悬细胞，25℃250g离心10min；
1.7重复步骤1.6；
1.8吸掉上清之后的细胞即为淋巴细胞。
2)提取淋巴细胞中RNA、反转录；
在步骤2)中，所述提取淋巴细胞中RNA、反转录的具体方法可为：
2.1准备好提取出的淋巴细胞样本；
2.2使用TIANGEN的RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，严格按照说明书中的操作步骤进行淋巴细胞中RNA的提取；
2.3对提取出的RNA进行浓度检测；
2.4利用Roche公司cDNA合成试剂盒将提取出的200ng RNA样本反转录为cDNA；
反转录体系为：
RNA 200ng
试剂盒中5#试剂或6#试剂二选一2μL
ddH2O 补齐到13μL
在PCR仪中设定65℃×10min+4℃×2min；
将PCR产物取出，再依次加入：
在反应管中将试剂小心混匀，轻度离心后在PCR仪中设定55℃×30min+85℃×5min。
3)将完成的cDNA样本通过多重PCR扩增。
在步骤3)中，所述将完成的cDNA样本通过多重PCR扩增的具体方法可为：
PCR体系：
在PCR仪中设定95℃/15min+(94℃/30s+57℃/30s+72℃/30s)×40次+72℃/10min；
对扩增后的PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶，在90V、100mA的电泳条件下跑电泳30min进行鉴定、测定其浓度。
本发明具有以下突出的技术效果：
本发明采用多重PCR的方法，在统一体系中快速扩增NK细胞免疫球蛋白样受体表达基因，组成NK细胞免疫球蛋白样受体文库，通过高通量测序技术即可检测NK细胞免疫球蛋白样受体基因表达情况，该方法操作简单，重复性好，实现快速、低成本检测NK细胞免疫球蛋白样受体基因多样性的目的，可广泛用于科研、临床诊断。
附图说明
图1为本发明实施例的电泳图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
所述构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物为：
正向引物1：5’-gtgaccttgtcctgcagctc-3’；
反向引物1：5’-gggccctgccacccacggagg-3’；
正向引物2：5’-agcttggttcagtgggtgtg-3’；
反向引物2：5’-ccactgaggtcccaatcaga-3’。
所述构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的方法，包括以下步骤：
1)人外周血淋巴细胞分离，具体方法为：
1.1抗凝血3ml在紫色抗凝管中置好；
1.2无菌避光分装3ml Solarbio公司人外周血淋巴细胞分离液，再沿着试管壁缓慢添加3ml抗凝血；。
1.3 25℃800g离心25min。
1.4离心完成后见溶液分为4层，其中第1层血浆层与第3层分离液中间的就是淋巴细胞层(白膜层)，吸取白膜层至另一无菌15ml离心管中；
1.5向白膜层中加入10ml Solarbio公司HANK’S BALANCED SALT MIXTURE，25℃250g离心10min；
1.6吸掉上清，加入5ml Solarbio公司HANK’S BALANCED SALT MIXTURE重悬细胞，25℃250g离心10min；
1.7重复步骤1.6；
1.8吸掉上清之后的细胞即为淋巴细胞。
2)提取淋巴细胞中RNA、反转录，具体方法为：
2.1准备好提取出的淋巴细胞样本；
2.2使用TIANGEN的RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，严格按照说明书中的操作步骤进行淋巴细胞中RNA的提取；
2.3对提取出的RNA进行浓度检测；
2.4利用Roche公司cDNA合成试剂盒将提取出的200ng RNA样本反转录为cDNA；
反转录体系为：
RNA200ng
试剂盒中5#试剂或6#试剂二选一 2μL
ddH2O补齐到13μL
在PCR仪中设定65℃×10min+4℃×2min；
将PCR产物取出，再依次加入：
在反应管中将试剂小心混匀，轻度离心后在PCR仪中设定55℃×30min+85℃×5min。
3)将完成的cDNA样本通过多重PCR扩增，具体方法为：
PCR体系：
在PCR仪中设定95℃/15min+(94℃/30s+57℃/30s+72℃/30s)×40次+72℃/10min；对扩增后的PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶，在90V、100mA的电泳条件下跑电泳30min进行鉴定、测定其浓度(本发明实施例的电泳图参见图1，其分别为4例人外周血单核细胞cDNA样本多重PCR后琼脂糖电泳条带结果)。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种构建人NK细胞免疫球蛋白样受体文库的多重PCR引物和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 1
gtgaccttgt cctgcagctc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 2
gggccctgcc acccacggag g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 3
agcttggttc agtgggtgtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 4
ccactgaggt cccaatcaga 20
