一种葡萄抗体库的制备方法
技术领域
本发明属于葡萄蛋白抗体研究领域，具体提供了一种葡萄高通量全蛋白组的抗体制备方法。
背景技术
葡萄(Vitis vinifera L.)属于葡萄科葡萄属浆果，它是我国第二大栽培果树，可以广泛地应用于酿酒、鲜食、制汁、制干。但是由于葡萄是多年生的杂合度高的果树，在分子生物学方面的研究较为滞后。随着葡萄基因组测序的完成，葡萄的研究进入了后基因组时代，大量的基因被注释和挖掘，其蛋白水平的研究越来越引起研究者的重视，抗体是研究蛋白功能的必须手段，但是由于葡萄抗体数量少，质量差，制备造价高，严重阻碍了葡萄蛋白功能的研究。
本发明的抗体制备方法成功克服了葡萄抗体制备的技术瓶颈，利用核心技术制备了覆盖葡萄花、叶、果实等重要器官蛋白的20000个抗体，并包含6000-7000个单克隆抗体，能够满足重要性状的蛋白功能研究。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种葡萄高通量全蛋白组的抗体制备方法，本发明提供了葡萄研究中的抗体芯片，可利用该芯片研究葡萄的重要形状，本发明的抗体芯片其包括来源与葡萄的花、叶、果实、等部位的抗性蛋白，共包含了20000个抗体，铺盖面较广。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种葡萄抗体库的制备方法，包括以下步骤：
(1)从葡萄中提取蛋白抗原，制得葡萄建库蛋白样本；
(2)将获得的蛋白抗原对小鼠进行免疫，免疫小鼠的脾脏及淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，获得杂交瘤细胞，并制备抗体；
(3)将获得的抗体点制在芯片上，获得葡萄抗体芯片；
(4)对获得的葡萄抗体芯片进行筛选，通过数据分析获得靶向所述葡萄蛋白质芯片上固定的蛋白质的富集的特异性抗体库。
上述方法中，所述步骤(1)中葡萄蛋白抗原来源与葡萄的器官，包括葡萄的皮、核、叶和果实。
上述方法中，所述步骤(1)中提取葡萄蛋白抗原的方法，包括以下步骤：通过SDS-PAGE分离葡萄蛋白样品，通过考马斯亮蓝染色对蛋白提取质量进行评估，提取的蛋白浓度大于20％为合格。
上述方法中，所述步骤(2)中制备抗体的方法，包括以下步骤：
(1)采用多点皮下注射免疫小鼠，四次常规免疫加一次冲击免疫；
(2)采用Western blot和ELISA检测并评估免疫小鼠血清中的抗体以及抗体效价；
(3)培养合格小鼠全脾和淋巴结与骨髓瘤SP2/0细胞系融合的融合细胞，取其细胞培养上清，ELISA检测融合效果；
(4)随机抽取融合细胞上清进行检测，得到IgG浓度分布，以细胞培养板上95％以上细胞株的上清IgG浓度≥5ug/ml作为合格建株杂交瘤细胞；
(5)将合格的建株杂交瘤细胞悬液注射进小鼠腹腔用于抗体生产，用产生的腹水提取抗体。
上述方法中，所述步骤(3)中所述抗体点制的方法，包括以下步骤：将抗体溶液使用点样仪在4℃条件下点制到包被了纤维素硝酸酯的基片上，并于-80℃下保存。
上述方法中，所述步骤(4)中葡萄抗体组芯片进行筛选的方法，包括以下步骤：将被标记的抗原蛋白与所述抗体芯片结合，使用芯片扫描仪扫描所述抗体芯片信号，并在570nm处检测Cy3的荧光信号值。
上述方法中，所述步骤(4)中数据分析的方法，包括以下步骤：对Cy3的荧光信号值进行定量分析，根据抗体点在不同样本间获得的Cy3荧光信号值的定量变化趋势，进行芯片(样本)间的层次聚类以及PCA主成分分析，来评估样品之间在蛋白表达谱方面的相似程度，并使用ImFit和eBayes函数计算差异抗体信号。
上述方法中，所述步骤(4)中的特异性抗体库包含葡萄的20000个抗体。
本发明的有益效果：本发明首次利用蛋白组制备了覆盖葡萄果皮、叶片、果实、核的抗体库；发明中获得抗体的方法通量高，获得了20000多个抗体，单个抗体成本低，效率高；本发明中制备抗体的质量好，可以满足western blot和IP实验的要求，可以直接在实验中应用。
附图说明
图1为实施例1葡萄建库材料考染结果示意图(图中A为蛋白考马斯亮蓝染色结果；B为蛋白转膜后丽纯红染色结果；图A、B中1表示玫瑰香果皮、果肉、核混合；2表示无核白果皮、果肉、核区混合；3表示刺葡萄叶子、果实混合；4表示康可果实、叶片混合；5表示红地球果实、叶片混合；6表示森田尼无核核区、果皮、果肉混合)。
图2为实施例1成功制备的葡萄抗体芯片示意图。
图3为实施例2差异表达抗体分析结果示意图。
图4为实施例2有核3个品种-无核3个品种-1个无核处理样品，差异蛋白表达模式热图。
图5为实施例2Western blot小样本验证结果示例图(图中每一泳道所示为不同的抗体)。
图6为实施例3Western blot大样本验证结果示例图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1抗体库制备
1、从葡萄中提取蛋白抗原，制得葡萄建库蛋白样本：
采用BPP法从不同品种的葡萄(刺葡萄、无核白、玫瑰香、康可、红地球)中器官(果皮、叶片、果肉、核)中提取蛋白抗原；过SDS-PAGE分离蛋白样品，通过考马斯亮蓝染色对蛋白提取质量进行评估，对提取的蛋白浓度进行检测，大于20％为合格(葡萄建库材料考染结果如图1所示)；通过WB检测内参蛋白actin的信号，信号清晰，提取蛋白为合格。葡萄建库材料蛋白提取结果如表1所示。蛋白抗原提取的具体操作步骤如下：
(1)将样本(果皮、叶片、果肉或核)放入预冷的研钵中进行研磨，期间不断加入液氮保持低温，样本反复研磨的总时长大约20分钟，研磨结束后，将样本装管。
(2)处理后的样本按照样品质量(g)：提取液体积(mL)＝1:5的比例加入BPP裂解液，提取样本中的蛋白。
(3)将上述裂解混合液置于涡旋震荡仪上震荡5分钟，保证样本粉末在BPP裂解液中充分混匀，肉眼观察无大于0.2cm2的块状固体即为充分混匀；将混匀后的样本，放在4℃冰箱的垂直混匀仪上孵育裂解2个小时。
(4)孵育完成后，进行超声裂解，将超声仪的变幅杆插入样品溶液距离管底的1/3处，变幅杆不得倚靠管壁或者管底，呈悬空状态超声3秒～5秒，然后停顿10秒～20秒，反复超声30次；超声后，12500rpm，4℃离心30分钟，取上清。
(5)在上述上清液中加入等体积的Tris-饱和酚，混匀后12500rpm，4℃，离心15分钟，取上清；在上清液中加入等体积的BPP裂解液，混匀后，12500rpm，4℃，离心15分钟；取上清，该上清液即为蛋白粗提液。
(6)在上述蛋白粗提液中加入约5倍体积的饱和硫酸铵甲醇溶液，上下颠倒混匀30次，将蛋白粗提液置于-20℃冰箱中，过夜沉淀。
(7)将沉淀过夜后的蛋白粗提液12500rpm，4℃，离心30分钟，弃上清，保留沉淀；在沉淀中加入甲醇溶液，将沉淀吹散成颗粒状后，12500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清，保留沉淀；在沉淀中加入丙酮溶液，将沉淀吹散成颗粒状后，12500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清，保留沉淀；沉淀通风，但不能完全干透。
(8)在上述通风后的蛋白沉淀加入适量0.5％SDS，混匀使蛋白复溶，获得的上清即为蛋白原液。
表1：葡萄建库材料蛋白提取结果示例
如图1所示，葡萄建库材料考染结果表明，考马斯亮蓝染色显示蛋白条带大小分布比较均匀，条带比较清晰，未发现高丰度蛋白，能够检测到明显的内参蛋白actin的表达，表明成功制得葡萄建立抗体库所需的蛋白样本。
2、将获得的蛋白抗原对小鼠进行免疫，免疫小鼠的脾脏及淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，获得杂交瘤细胞，并制备抗体。具体操作步骤如下：
(1)免疫小鼠：采用多点皮下免疫小鼠，每组抗原免疫3只Balb/c小鼠(8-12周龄)，采用四次常规免疫加一次冲击免疫。
(2)血清检测和筛选：四次免疫后取血进行检测，包括Western blot验证检测和ELISA检测。Western Blot显示血清产生的抗体多样化，稀释呈现范围较宽的弥散带，无优势条带(灰度分析确定该条带灰度占总灰度的30％)，证明针对多种蛋白质组分产生了抗体，即为合格小鼠。同时ELISA进行血清效价检测。每组选取抗体多样化合格且效价最高的1只小鼠加强免疫一次并用于下步融合。
(3)融合及筛选：取合格小鼠的全脾和淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。融合后7-10天，取融合细胞上清100μL，ELISA检测融合效果。将ELISA检测合格的细胞株进行转孔扩培。
(4)建株及筛选：细胞株扩培至24孔细胞培养板，后取细胞上清进行质量检测。对于建株上清进行ELISA检测IgG浓度，保证细胞上清质量，标准为95％以上细胞株IgG上清浓度≥5ug/ml，检测方法为随机抽取188个细胞上清(2块96孔板)检测，得到IgG浓度分布。检测合格后细胞进行扩增并冻存。
(5)腹水制备：将合格的建株杂交瘤细胞悬液注射进F1代雌性小鼠腹腔用于抗体生产，用产生的腹水提取抗体。
3、将获得的抗体点制在芯片上，获得葡萄抗体芯片：
芯片点制：使用Inkjet Microarrayer(Arrayjet Ltd.,Roslin,UK)点样仪在4℃下，取抗体溶液(1mg/ml)10μL点制到包被了纤维素硝酸酯的基片上(FAST chip,CapitalBio,Beijing,China)，将点制好的抗体芯片保存在-80℃，备用，获得葡萄抗体组芯片。具体操作步骤如下：
(1)将构建好的葡萄抗体库中的抗体通过Arrayjet点样仪点制到芯片载体上(Maine Manufactuing FAST slide)，制备成葡萄抗体芯片。
(2)从一批次点制的抗体芯片中随机选取一张芯片用来QC。取出芯片，置于有30ml的10％BSA封闭液的芯片孵育盒中，将芯片孵育盒用保鲜膜覆盖封口，置于4℃冰箱中的垂直摇床上，封闭过夜。
(3)将封闭液倒出，加入二抗(Streptavidin-Cy3和goat anti-mouse-cy5，1:3000稀释于1*PBS中)反应液，置于摇床上室温孵育45min。
(4)二抗反应结束后进行芯片洗涤，洗涤后进行芯片干燥。
(5)用芯片扫描仪读取数据，进行数据分析，合格标准：芯片扫描后点明亮、大小均匀、排列整齐，连点、漏点率小于5％，同时进行阳性抗体计数，芯片结果见芯片扫描数据。
如图2所示，芯片扫描后点明亮、大小均匀、排列整齐。说明成功制备葡萄抗体芯片。
4、对获得的葡萄抗体芯片进行筛选，通过数据分析获得靶向所述葡萄蛋白质芯片上固定的蛋白质的富集的特异性抗体库，具体步骤如下：
(1)芯片筛选：将所需筛选的抗原蛋白样本稀释成0.1μg/μl，并使用NHS-biotin(Molecular Probes,Carlsbad,CA,USA)进行标记，备用；提前将点制好的抗体芯片取出，使用TBS+0.1％Tween20洗两次，使用TBS+10％BSA+0.1％Tween20封闭，4℃过夜；封闭后的芯片使用TBS+0.5％Tween20洗4次，每次15分钟；上样30ug蛋白样本(加了NHS-biotin标记)，和芯片室温孵育1小时(使蛋白抗原与抗体芯片结合)；使用TBS+0.5％Tween20洗4次(多次洗涤去除非特异结合信号)；之后上样Cy3-streptavidin(1:5000)，室温孵育1小时(与荧光标记的亲和素反应，由于biotin与亲和素的结合而使得抗体点上显示出荧光信号)，使用TBS+0.5％Tween20洗4次，再用超纯水冲洗4次，将芯片在1500rpm离心2分钟，去除残余的液体，晾干；使用GenePix芯片扫描仪(Axon Instruments,Union City,CA,USA)来扫描抗体芯片信号，使用532nm的激光激发，并在570nm检测Cy3的荧光信号值。
(2)数据分析：使用GenePix 6.0软件(Axon Instruments)分析Cy3的荧光信号值，并使用limma package(http://bioconductor.org/)进行以下定量分析：原始信号值需要进行背景修正(background Correct函数)以及芯片间的数据均一化(normalize BetweenArrays函数)；根据抗体点在不同样本间的定量变化趋势，进行芯片(样本)间的层次聚类以及PCA主成分分析，来评估样本之间在蛋白表达谱方面的相似程度；使用ImFit和eBayes函数计算差异抗体信号，这些差异信号反映了对应抗体所结合的蛋白在细胞中的表达量差异，最终成功获得葡萄有核与无核性状的特异性抗体库，该抗体库包含20000个葡萄抗体。
实施例2葡萄果实无核性状的早期小样本检测
选取6个品种(有核品种为红地球，玫瑰香，阳光玫瑰；无核品种为森田尼无核，无核白，红脸无核)在3个发育期进行差异蛋白筛选。采用本发明实施例1的制备方法获得葡萄果实无核性状的早期小样本抗原蛋白，点制得到葡萄抗体组芯片，并对有核品种和无核品种的不同发育期进行了蛋白表达差异筛选(如表2所示)。对所获得的数据做背景修正和均一化之后(如图3所示)，进行了差异表达抗体分析结果如表3和图4所示。
表1：不同品种抗体芯片筛选材料
表3：mAbarry芯片分析差异表达蛋白
注：赤霉酸处理有核品种为无核品种，未处理的为有核品种，无核化处理为把有核的品种无核化。
参照芯片筛选结果，挑选差异表达蛋白所对应的抗体：提取葡萄总蛋白，并进行WB，WB参照以下标准：丽春红染色清晰；WB结果条带特异，主带≤3条，无过曝；分子量marker在胶片上指示位置精确。记录通过以上标准的抗体，进入IP实验鉴定抗体的靶标蛋白，用WB的方法对芯片筛选结果中大量潜在的差异表达蛋白的表达情况进行了验证，取WB验证中特异性腹水，进入IP-ID鉴定环节，具体步骤如下：
(1)抗体纯化和QC：通过上一步WB验证的抗体，取腹水进行IgG亲和纯化；纯化后进行SDS-PAGE分离并考染，每个抗体跑5g，另取5g BSA做浓度对照。要求：杂带少，尤其是白蛋白。使用纯化抗体对上一步WB实验中高表达的蛋白样本进行WB实验，要求条带清晰正确，与腹水实验结果一致。
(2)抗体偶联：将抗体和IP用凝胶珠进行偶联，偶联后上清跑胶看不到或很微弱的IgG重轻链，偶联后的beads有清晰的重轻链，且重链要弱于轻链带。
(3)IP实验：将偶联后的抗体与IP用蛋白样品进行孵育，必要的时候使用透析来去除IP用蛋白样品中的变性剂成分；孵育后进行3～9次的洗涤和蛋白洗脱，洗脱液平均分为两份保存，分别用于银染-WB质检和切胶进行质谱分析。IP产物QC：IP洗脱产物进行SDS-PAGE分离和银染实验；同时使用input蛋白和IP洗脱蛋白进行WB实验，上样量均为20g，曝光时间为1s，20s，1min，3min。
(4)IP实验质控标准：
a.产物银染条带应清晰，不拖尾，不弥散；泳道上无污染物，无指印；显色时间充分，可以看到弱的条带信号，但整块胶要有白色背景；
b.IP产物的条带和纯化抗体QC中WB显现条带大小一致，且在其他IP产物中没有该条带，结果如图5所示。
(5)质谱测序确认蛋白ID：确定IP产物条带后，跑胶分离并切相应条带，使用LC-MS/MS进行肽段序列鉴定；搜库需比对指定物种的基因库；数据输出包括蛋白ID，MW，Peptide Count，Unique Peptide，Peptide Sequence，Peptide可靠性Coverage。
质谱分析成功判定标准：至少有一个蛋白，UniquePeptide数≥5，对于一类条带蛋白含量高的样本，要求UniquePeptide>10，或对小分子量蛋白可根据分子量要求Coverage>15％，但要求Peptide Count>Min(15,2*UniquePeptide)；目的抗原在IP(Immunoprecipitation)产物含量中排名前三，分子量与实际WB分子量偏差小于等于10kD。符合标准的蛋白需要唯一，否则数据待定，需要重复IP-ID(ImmunoprecipitationIdentify，免疫共沉淀鉴定)或者用其它方法确定抗体对应蛋白。
本实施例通过亲和纯化获得纯化抗体，通过WB确认抗体纯化效果(结果如图5所示)。将成功纯化的抗体偶联在beads上。取偶联后的上清与beads，SDS-PAGE分离后考染，确认抗体成功偶联在beads。用成功偶联的beads进行了IP实验，IP后的样品通过SDS-PAGE分离后银染，切下目标条带，对其进行质谱鉴定。
实施例3葡萄果实无核性状的早期大样本检测
选取20个品种和3个时期的样本进行大样本验证。蛋白提取、QC、WB参照实施例2的实验过程进行。
提取蛋白，除进行常规质控之外，还要进行考染调平，用调平的样品进行Westernblot。参照以下标准：丽春红染色清晰；WB结果条带特异，主带≤3条，无过曝(如图6所示)。
通过大样本验证及文献调研，最终筛选到115个差异表达的蛋白，见表5。
表5：大样本验证筛选到差异表达的115个的蛋白
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
