DNA编码化合物库构建中通过Suzuki偶联反应得到On-DNA芳烃化合物的方法
技术领域
本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库构建中On-DNA芳卤与三氟硼酸钾类试剂通过Suzuki偶联反应得到On-DNA芳烃化合物的方法。
背景技术
美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381, 专利：US5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过 DNA独有的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。
DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA 模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的 DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen 公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。
除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN201711263372.3，CN201711318894.9)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN201711247220.4)，再通过DNA 合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN201810378969.0)。
DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称On-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的On-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的On-DNA化学反应种类有50多种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，On-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终库的合成成功率才越高，得到的库的多样性才越丰富。
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件
在On-DNA化学反应中，缓冲液的选择十分重要，我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利：CN201811181396.9)，并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利：CN201811181396.9，CN201811546746.7)。
目前DNA编码化合物库构建中最常使用的成键化学反应有：形成酰胺键反应、其他胺的盖帽反应(还原氨化、取代、(硫)脲的形成、氨基甲酸酯的形成、磺酰化等)、Suzuki 偶联反应、Buchwald偶联反应、Click反应等(参考文献：Angew.Chem.Int.Ed.,2019,58,10.1002/anie.201902489)。其中，Suzuki偶联反应具有反应条件温和、功能团容忍性高，参与反应的硼酸或硼酸酯类小分子试剂种类多、稳定易得、易于存储等优点，是目前DNA编码化合物库合成中应用最为广泛的偶联反应之一。
目前公开报道的适合于DNA编码化合物库合成中使用的On-DNA Suzuki偶联反应条件主要有四种：GSK公司的Ding等在2015年报道使用Pd(PPh3)4和Na2CO3在水相中于80℃条件下催化On-DNA芳基溴或碘化物与芳基硼酸或硼酸酯反应的Suzuki-Miyaura偶联反应(参考文献：ACS.Med.Chem.Lett.,2015,6,919；ACS Comb.Sci.,2015,17,1-4)，Roche公司的Satz等在2015年报道使用Pd(OAc)2、TPPTS和Na2CO3在水相中于65℃条件下催化 On-DNA芳基碘化物与芳基硼酸或硼酸酯反应的Suzuki-Miyaura偶联反应(参考文献：Bioconjugate Chem.,2015,26,1623-1632)，GSK公司的Ding等在2016年报道使用POPd、sSPhos和KOH在水相中于80-100℃条件下催化On-DNA芳基氯化物与芳基硼酸或硼酸酯反应的Suzuki-Miyaura偶联反应(参考文献：Bioconjugate Chem.,2016,27,2597)，贝勒医学院的Li等在2018年报道使用sSPhos-Pd-G2预催化剂和CsOH在水相中于80℃在短时间内即可催化On-DNA芳基氯、溴或碘化物与芳基硼酸或硼酸酯反应的Suzuki-Miyaura偶联反应(参考文献：Bioconjugate Chem.,2018,29,3841–3846)。
但是以上On-DNA Suzuki偶联反应都是针对芳基硼酸或硼酸酯的，得到的产物主要是 On-DNA联芳环类化合物，这些方法应用于烷基/烯烃基/炔烃基硼酸或硼酸酯时，产率较低，底物适用性也受限，主要原因可能是这类硼酸或硼酸酯试剂不稳定，容易变质。
为了解决如上问题，我们希望开发一种简便、快捷、可以将On-DNA芳基卤代物的卤素功能团原位转化为其他非芳环类功能团的方法，以便能快速扩大DNA编码化合物库的多样性，并适应大批量多孔板的DNA编码化合物库生产的需求。而三氟硼酸盐类试剂可以通过作为稳定的、受保护形式的硼酸来缓解烃类硼酸或硼酸酯的这类问题，并在小分子试剂的Suzuki偶联反应领域得到较广泛应用，因此，我们的研究以三氟硼酸钾盐类试剂与On-DNA的芳基卤代物的Suzuki偶联反应为起点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种用于DNA编码化合物库构建中的由三氟硼酸钾参与的、On-DNA芳基卤代物为底物的Suzuki偶联反应。其中，所述On-DNA芳基卤代物的结构式为：DNA-Ar-X，烃类三氟硼酸钾的结构式为：R-BF3K；
其中，结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；X是氯、溴、或碘；
其中，结构式中的Ar是单环或双环的芳香环；所述On-DNA芳基卤代物中的X连接于Ar的环上；
其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA 与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，是通过三个连续的化学键连接。
具体的，Ar可以选自以下基团：
R1为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、 C1-C6烯烃基、C1-C6炔烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧基、C1-C6烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R1基团；R2为连接DNA部分的功能团，具体是一个可以与DNA上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种， R2可以直接与Ar相连，也可以间隔多个化学键相连；Y为O、S、NH或烷基取代氨基中的任意一种。
其中，三氟硼酸钾R-BF3K是商售的，或是通过R-B(OH)2与KHF2原位合成的；
R为醛基、羧基、酯基、叠氮基、羟基、氨基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6烯烃基、C1-C6炔烃基、C3-C8环烷基、芳基甲酮、烷基甲酮中的任意一种至多种的随机组合。
本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种可以将On-DNA芳基卤代物原位转化为 On-DNA芳烃化合物的方法。
以On-DNA芳基卤代物为原料，以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一项或几项为溶剂，在钯催化剂和配体的存在下，与三氟硼酸钾试剂和碱在20～100℃的条件下反应0.5～24小时，具体反应方程式如下：
所述的On-DNA芳基卤代物是On-DNA芳基氯代物，On-DNA芳基溴代物，On-DNA芳基碘代物；优选地，是On-DNA芳基溴代物；
所述钯催化剂是氯化钯、溴化钯、碘化钯、双(乙腈)二氯化钯、乙二胺氯化钯、三氟乙酸钯、乙酸钯、硫酸钯、硝酸钯、二丙酸钯、乙酰丙酮钯、六氟乙酰丙酮钯、二氯(降冰片二烯)钯、(1,5-环辛二烯)二氯化钯、二氯(N,N,N,N-四甲基乙二胺)钯、二氯(1,10-菲咯啉)钯、双(二亚苄基丙酮)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、四(乙腈)二(三氟甲磺酸)钯、四(三苯基膦)钯、四(三邻甲苯基膦)钯、三苯基膦醋酸钯、双(三-o-甲苯磷)钯、双[1,2-双(二苯基膦)乙烷]钯、双(三叔丁基膦)钯、二氢二氯双(二叔丁基羟亚膦基)钯、双(三苯基膦)二氯化钯、(1,3-双(二苯基膦)丙烷)氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、二溴双(三叔丁基膦)二钯、1,1'-双(二-叔丁基膦)二茂铁二氯化钯、双(三环己基膦)二氯化钯中的一种或几种的混合物；优选地，所述钯催化剂是乙酸钯。
所述配体是三苯基膦、三[3,4-双(三氟甲基)苯基]膦、三(4-氟苯基)膦、三(3-溴苯基)膦、三(2-甲氧基苯基)膦、三(4-甲氧基-3,5-二甲苯基)膦、三(4-二甲氨基苯基)膦、三(4-氯苯基)膦、三(3-氯苯基)膦、三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐、三(2,5-二甲苯基)膦、三对甲苯基膦、4-二苯基膦苯甲酸、2-二苯基膦苯甲酸、二苯基(邻甲氧基苯基)膦、4-二苯基膦基苯磺酸钠、4-(二甲氨基)三苯基膦、3-二苯基膦氟苯、2-二苯基膦基苯腈、双(4-甲氧基苯基)苯基膦、二水合双(对 -磺酰苯基)苯基膦二钾盐、双(3-磺酸苯基)(3,5-二-三氟甲基苯基)膦酸二钠单水合物、双(4-三氟甲基苯基)(3-磺酸苯基)膦、3-二苯基磷苯磺酸钠二水合物、1,1-双(二苯基膦)甲烷、1,2-双(二甲基膦)乙烷、1,2-双(二苯基膦)乙烷、1,3-双(二苯基膦)丙烷、1,4-双(二苯基膦)丁烷、2,3-双(二苯基膦)丁烷、二苯基环己基膦、二苯基乙氧基膦、甲基二苯基膦、乙基二苯膦、羧基甲基二苯基膦、苯基二环己基膦、二甲基苯基膦、二叔丁基苯基膦、2-(二叔丁基膦)联苯、1,1'-联萘 -2,2'-双二苯膦、2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基联苯、2-二环己基膦-2'-甲基联苯、2-二环己基膦 -2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、2-二环己基膦基-o-2',6'-二甲氧基联苯、2-二-叔丁基膦基-2',4',6'- 三异丙基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-甲基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-二环己基膦基-o-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-(二-叔丁基膦基)联苯、2-二苯基膦基-2'-(N,N- 二甲基氨基)联苯、2-二环己基膦-2,6-二异丙基-3-磺酸基-1,1-联苯钠盐水合物，4-(2,6-二甲氧基苯基)-3-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氢-1,3-苯并氧磷杂环庚三烯、2-(二环己基膦基)联苯、 [4-(N,N-二甲基氨基)苯基]二-叔丁基膦、三(2-羧乙基)膦、三(3-羟基丙基)膦、三环己基膦、4,5- 双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽或是1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁中的一种或几种的混合物，优选地，所述配体是二烷基膦联苯类配体；更优选地，所述配体是2'-二环己基膦基-2,6-二甲氧基 -1,1'-联苯基-3-磺酸钠水合物或4-(2,6-二甲氧基苯基)-3-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氢-1,3-苯并氧磷杂环庚三烯。
所述碱为硼酸钠、硼酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、或是碳酸氢钾中的一种或几种的混合物；优选地，所述碱为碳酸盐。
本发明中的On-DNA芳基卤代物可以由DNA-NH2和含有羧酸芳卤二元化合物原位缩合反应制得。
本发明为DNA编码化合物库构建中On-DNA Suzuki偶联反应提供新的方法，本发明使用廉价易得、稳定性好的三氟硼酸盐类试剂作为反应原料，反应条件温和、操作方便，可以快速将On-DNA的芳基卤代物转化成可以继续进行盖帽反应的其他On-DNA芳烃化合物，可以快速增加该DNA编码化合物库的多样性，适合大批量多孔板的DNA编码化合物库的生产。
附图说明
图1为本发明的原料制备方法，由DNA-NH2制得On-DNA芳基溴代物的化学反应式和转化率分布(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。
图2为本发明用On-DNA芳基溴代物制得On-DNA芳基乙烯化合物的化学反应式和转化率分布(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。
图3为本发明用芳基溴代羧酸二元化合物两步制得On-DNA芳基乙烯化合物的代表结构式和两步反应产率。
图4为本发明用On-DNA芳基溴代物制得On-DNA苄胺化合物的两步化学反应式。
图5为本发明用On-DNA芳基溴代物制得On-DNA Boc保护的苄胺化合物的转化率分布 (转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，On-DNA芳基溴代物的合成
DNA-NH2(例如专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，与溴代芳基羧基二元化合物(共计 569个)使用EDCI作为缩合剂和s-NHS缩合活化剂反应得到相应的On-DNA芳基溴代物(简写为DNA-Ar-Br，参考文献：Nat.Chem.,2015,7,3,241)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的还原反应(该化学反应式和制得的On-DNA芳基溴代物的转化率分布见图1)。
我们共计反应了589个不同的溴代芳基羧基二元化合物，但是为了减少第一步缩合反应产率不一致对第二步Suzuki偶联反应产率计算的影响，我们只统计纯度>70％的419个 On-DNA芳基溴代物的后续Suzuki偶联反应产率分布情况。
实施例2，On-DNA芳基烯烃化合物的合成
原位生成的DNA-Ar-Br重新溶解于超纯水中，配制成1mM浓度溶液，取出两份，分别分装到新的96孔板中(5μL,5nmol,1mM水溶液)，依次加入乙烯基三氟硼酸钾(1.25μL,250nmol,200mM二甲基乙酰胺溶液,50eq.)，碳酸铯溶液(3.75μL,750nmol,200mM水溶液,150eq.)，离心让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，置换氮气3次，再次加入乙酸钯(Pd(OAc)2)和2'-二环己基膦基-2,6-二甲氧基-1,1'-联苯基-3-磺酸钠水合物(sSPhos)的预先混合溶液(1.5 μL,体积比＝2/1,10mM的二甲基乙酰胺溶液/40mM的二甲基乙酰胺溶液,2eq./4eq.)，再次置换氮气3次，封膜，96孔板在PCR仪器中80℃下反应2小时(盖温：100℃)。
除钯：反应完毕后，向96孔板的每个孔中加入二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液(3.0μL,300 nmol,100mM水溶液,60eq.)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，96孔板在PCR仪器中80℃下反应30分钟(盖温：105℃)，反应完毕，产生大量沉淀，以4000G的离心力离心5分钟，将上清液转移到新的96孔板中进行乙醇沉淀。
乙醇沉淀：向96孔板的每个孔加入反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率。
纯度>70％的On-DNA芳基溴代物转化为On-DNA芳基乙烯化合物，>50％的转化率达到 77％(见图2)，底物普适性很好，部分代表结构式见图3。得到的On-DNA芳基乙烯化合物可以直接用Heck反应、Michale加成、Diels-Alder环加成等作为盖帽反应，相较于原来的On-DNA芳基卤代物进行的盖帽反应(Suzuki偶联反应、Sonogashira偶联反应、Heck偶联反应、Buchwald偶联反应，Ullmann偶联反应)进行的子库合成，子库个数可以增加60％，可以显著增加该DNA编码化合物库的多样性。
用本实施例的方法，可以使用含有炔烃基的三氟硼酸钾盐，如三甲基硅烷保护的乙炔基三氟硼酸钾与On-DNA芳基卤代物反应，得到On-DNA芳基乙炔基化合物，该类化合物可以使用Click反应、Sonogashira偶联、Michale加成等反应作为盖帽反应，也可以显著增加该 DNA编码化合物库的多样性。
实施例3，On-DNA苄胺化合物的合成
向96孔板中DNA-Ar-Br(5μL,5nmol,1mM水溶液),依次加入N-Boc-氨基甲基三氟硼酸钾(3.75μL,750nmol,200mM二甲基乙酰胺溶液,150eq.)，碳酸钾溶液(7.5μL,1500nmol,200mM水溶液,300eq.)，离心让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，置换氮气3次，再次加入乙酸钯(Pd(OAc)2)和4-(2,6-二甲氧基苯基)-3-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氢-1,3-苯并氧磷杂环庚三烯(rac-BI-DIME)的预先混合溶液(5.0μL,体积比＝1/1,10mM的二甲基乙酰胺溶液/40 mM的二甲基乙酰胺溶液,5eq./20eq.)，再次置换氮气3次，封膜，96孔板在PCR仪器中95℃下反应2小时(盖温：105℃)。
反应完毕后，向96孔板的每个孔中加入二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液(3.0μL,300nmol, 100mM水溶液,60eq.)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，96孔板在PCR仪器中 80℃下反应30分钟(盖温：105℃)，反应完毕，产生大量沉淀，以4000G的离心力离心 5分钟，将上清液转移到新的96孔板中进行乙醇沉淀。
得到的On-DNA Boc保护的苄胺化合物溶于超纯水配制成1mM的水溶液，再向每个孔中加入NaOAc水溶液(5μL,75mM水溶液,75eq.)和MgCl2水溶液(2.5μL,1mM水溶液,0.5eq.)，离心让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在PCR仪器中90℃下反应 16小时(盖温：105℃)，乙醇沉淀得到目标产物。
纯度>70％的On-DNA芳基溴代物转化为On-DNA Boc苄胺化合物，>50％的转化率达到 55％(见图4)，进一步脱除叔丁氧羰基保护基后，得到On-DNA苄胺化合物，>50％的转化率达到49％(见图4)，反应的底物普适性好，部分代表结构式见图5。得到的On-DNA苄胺化合物可以使用DNA氨基编码化合物库常见的盖帽方法(酰胺化、还原氨化、成脲、成硫脲、氨基甲酸酯形成、取代、磺酰化、Michale加成等)进行相应子库的合成，相较于原来的On-DNA芳基卤代物进行的盖帽反应(Suzuki偶联反应、Sonogashira偶联反应、Heck偶联反应、Buchwald偶联反应，Ullmann偶联反应)合成，子库个数可以增加160％，可以显著增加该DNA编码化合物库的多样性。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
