一种构建捕获文库的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及构建杂交捕获文库的方法和试剂盒。
背景技术
外显子捕获是利用探针捕获并富集外显子区域的DNA序列的技术，在科研和临床检测领域被广泛应用。与全基因组测序相比，其费用更低、周期更短、覆盖度更好、更加经济、高效。传统的外显子捕获文库的构建一般包括以下步骤：将基因组DNA片段化，进行末端修复和末端加A，然后连接接头和标签序列，并通过第一轮PCR扩增获得预文库；之后再在封闭序列存在下将预文库与杂交探针进行杂交，纯化后通过第二轮PCR扩增以获得最终的捕获文库(参见图1)。接头和标签序列对上机测序、样本区分和追溯原始DNA分子的来源有着重要的意义。然而，在构建预文库的第一轮PCR扩增过程中，这些接头和标签序列往往会形成长度较长(每端60bp左右)、反向互补的序列结构。这种序列结构在杂交捕获过程中非常容易相互退火，使得非目标序列在探针与特异性序列结合时被一同捕获下来，从而降低整体捕获的特异性。因此，在杂交捕获过程中需要将这些插入片段以外的非目标序列进行有效封闭，以防止非特异性结合的发生。目前，封闭序列采用的是与接头序列反向互补的序列，通过与接头序列的碱基互补配对完成对接头的封闭。具体而言，封闭序列分两部分，一部分与扩增引物P5及测序引物1(也称为Read 1测序引物)序列反向互补，另一部分与测序引物2(也称为Read 2测序引物)、index标签及扩增引物P7序列反向互补，通过与其对应部分的互补配对进行接头封闭。然而，这种接头封闭序列的结合在杂交过程中容易受到温度的影响，封闭序列之间也容易形成二聚体，从而导致封闭效率降低，进一步使得目标区域的捕获效率也降低。此外，在高通量测序时，通常涉及大量样本，需要多种标签序列进行区分。上述封闭策略意味着需要对每一种标签序列单独设计封闭序列，这无疑增加了实验操作的繁琐性，同时也增加了建库成本。
为了控制成本，有人提出用相应数目的次黄嘌呤来封闭标签序列的策略，即用次黄嘌呤修饰标签序列的末端以代替额外加入封闭序列的做法。然而，次黄嘌呤对封闭的碱基具有一定的偏好性，造成对有些标签序列封闭效果差，进而影响捕获效率。同时，合成次黄嘌呤成本比较昂贵。也有人提出桥式封闭设计策略，即，分别对目标片段两端的接头序列设计对应的封闭序列，对于中间部分的标签序列则采取用6-8个C3间臂进行桥式连接。CN108456713A还提出对接头末端进行封闭修饰，例如反向dT修饰、间臂修饰、氨基修饰、ddNTP修饰，从而实现对接头序列的封闭。但无论哪种策略，均需要额外加入封闭序列或对接头进行特殊的封闭修饰，对控制杂交成本的帮助比较有限。
此外，为了增加测序文库多样性并保证文库的丰度，一般要求用于进行杂交捕获的DNA量(即，预文库的含量)为500ng甚至更高。例如，在杂交捕获中常用的试剂盒TwistHuman Core Exome EF Singleplex Complete Kit,96Samples(Twist Bioscience，货号100790)和
发明内容
鉴于捕获文库构建中存在的以上问题，为了节约成本和简化文库构建过程中的繁琐性，发明人提出了一种无需PCR预扩增构建预文库，并且不需要加入封闭序列或对接头进行末端修饰的捕获文库构建方法。
本发明是基于发明人发现的以下两个事实：(1)在5-50ng DNA的起始量下，无需PCR扩增获得的预文库也可以达到很好的覆盖度和覆盖均一性。因而大量预文库(500ng-1000ng)并非杂交捕获所必需，PCR预扩增并非构建预文库的必要步骤；(2)通过将片段化DNA连接Y型接头，可以在杂交捕获时省去用于封闭接头和标签序列的封闭序列，并且不会对捕获效率、覆盖度和覆盖均一性产生任何影响，从而节约杂交捕获成本。
因此，在第一个方面，本发明提供一种构建捕获文库的方法，包括以下步骤：
(1)获得片段化的DNA；
(2)将片段化的DNA与Y型接头连接，获得预文库；
(3)在不存在封闭序列的情况下将预文库与杂交探针进行杂交，获得杂交产物；
(4)将杂交产物进行PCR扩增，获得捕获文库。
在一个实施方案中，所述片段化的DNA是指天然存在的短片段DNA或通过人工打断基因组DNA获得的短片段DNA。在一个实施方案中，片段化的DNA可以源自血液、血清、血浆、关节液、精液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液等。在一个优选的实施方案中，天然短片段DNA是外周血游离DNA、肿瘤游离DNA或自然降解的基因组DNA。在另一个实施方案中，基因组DNA可以有各种来源，例如来自外周血、干血斑、口腔拭子等。本领域技术人员知晓打断基因组DNA的方法，例如通过超声处理、机械打断或通过酶切等。由于超声处理和机械打断相对而言会损失较多的DNA，因此在起始DNA含量较少(例如，低至50ng)的情况下，优选用酶切的方法使DNA片段化。
在一个实施方案中，所述片段化的DNA长度为150-400bp，优选180-230bp。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括在与Y型接头连接(即，步骤2)之前，将片段化的DNA进行末端修复和/或末端加A的步骤。在该实施方案中，可以用本领域技术人员已知的任何适用于末端修复的酶对DNA进行末端修复，例如T4DNA聚合酶、Klenow酶及其混合物。在该实施方案中，可以用本领域技术人员已知的任何适用于末端加A的酶对DNA进行末端加A。这种酶的实例包括但不限于Taq酶、klenow ex-酶及其混合物。在该实施方案中，末端修复和末端加A可以在两个反应体系中进行，即，在末端修复后，经过纯化再进行末端加A。可替换地且为优选地，末端修复和末端加A在一个反应体系中进行，即，末端修复和末端加A同时完成，之后再对核酸进行纯化。或者，更加优选地，将DNA片段化、末端修复和末端加A三者在一个反应体系中进行，之后再连接接头。这样不仅简化了操作步骤、节约成本，同时也降低了样本间的污染。
在一个实施方案中，末端补平和末端加A所用的温育时间和温度可以根据具体需要由本领域技术人员根据常规技术确定。
在一个实施方案中，步骤(2)可以用本领域技术人员已知的任何适用于连接接头的酶进行。这种酶的实例包括但不限于T4DNA连接酶、T7DNA连接酶或它们的混合物。进行连接反应的条件是本领域技术人员熟知的。
在本发明的上下文中，“Y型接头”是指不完全互补的两条链形成的接头，所述接头的一端由于两条链的碱基互补形成双链，而另一端由于两条链的碱基之间不完全互补，没有形成双链。目前常用的Y型接头主要包括长Y型接头(图3a)和截短Y型接头(图3b)。如图3a所示，常规的长Y型接头主要包括扩增引物序列(P5/P7)、index标签序列、read 1/read 2测序引物序列和index read测序引物序列，其中read 1/read 2测序引物序列和index read测序引物的序列不完全互补形成一部分双链。如图3b所示，常规的截短Y型接头主要包括read 1/read 2测序引物序列和index测序引物序列，或部分read 1/read 2测序引物序列和部分index测序引物序列，其中read 1/read 2测序引物和index read测序引物的序列不完全互补形成一部分双链。这种截短Y型接头通常需要搭配另外的包含P5/P7引物和index标签序列的接头一起使用。
举例而言，可用于本发明的Y型接头包含的两条链的序列如下：
SEQ ID NO：1
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
SEQ ID NO：2(5’端具有磷酸化修饰)
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC{index}ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
其中，下划线示出了两条链中碱基互补的部分。
对寡核苷酸进行磷酸化修饰的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以通过多核苷酸激酶使寡核苷酸5’端磷酸化，或在合成引物时直接在5’端加上磷酸基团。
在一个实施方案中，本发明方法的步骤(3)在液相杂交系统中进行。
在本发明的上下文中，“封闭序列”是指用于封闭接头和标签序列的序列，包括设计为与接头和/或标签序列反向互补的序列。在一些实施方案中，为增加封闭序列的封闭效果，在封闭序列的末端添加特殊修饰，如反向dT修饰、氨基修饰、ddNTP修饰(包括ddCTP、ddATP、ddGTP和ddTTP)、间臂(spacer)修饰、次黄嘌呤修饰、随机碱基修饰等。
在传统的捕获文库构建中，往往在连接接头和标签序列后进行PCR扩增，以放大目标DNA的含量，从而保证后续杂交步骤的效率，满足上机测序的要求。为了减少特异性结合，提高中靶率，通常需要在杂交体系中加入封闭序列，其作用在于通过碱基互补来封闭被扩增的接头和标签序列，使它们在杂交过程中不干扰目标序列与杂交探针的结合。然而，由于封闭序列与接头和标签序列是碱基互补的，因此在杂交过程中它们不仅能与接头和标签序列结合，其彼此之间也能互相结合。这种封闭序列之间的结合会导致封闭效果不够理想，进而降低捕获效率。此外，鉴于多个样品同时测序时会需要多种标签序列(有时多达96种)，而针对每种标签序列都需要单独设计封闭序列，这会加大后续测序数据分析的难度，并且增加实验成本。
出乎意料地，本发明人发现，在无需PCR预扩增制备预文库并且采用Y型接头的情况下，杂交体系中不需要加入任何封闭序列也能实现较好的捕获效率。
因此，在一个实施方案中，用于杂交的体系包括杂交缓冲液、Cot-1DNA和杂交探针，但不包括封闭序列。本领域技术人员根据实际需要可以调节杂交的条件，例如杂交温度、杂交时间等。设计和制备杂交探针的一般原理也是本领域技术人员熟知的。
进行步骤(3)PCR扩增的方法
在第二个方面，本发明提供一种用于构建捕获文库的试剂盒，其包括：
(1)用于连接接头的试剂，包括Y型接头；
(2)用于杂交的试剂，不包括封闭序列；
(3)用于PCR扩增的试剂。
在一个实施方案中，用于杂交的试剂包括杂交缓冲液、Cot-1DNA和杂交探针，但不包括封闭序列。
在一个实施方案中，用于PCR扩增的试剂包括缓冲液、PCR聚合酶和扩增引物。
在一个实施方案中，根据本发明方法制备的捕获文库可用于多种二代测序平台，包括但不限于如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等测序平台。
本发明的优异技术效果在于：(1)起始DNA的含量要求较低，甚至可以低至5ng，这大大提高了罕见样本的利用率，扩展了本发明的应用范围，例如本发明的方法和试剂盒可以应用于干血斑、口腔拭子、cfDNA等因DNA提取量少而无法满足普通外显子捕获流程的样本类型；(2)建库流程简单，本发明的方法在获得预文库之前无需经过PCR反应，因此仅需约2小时即可完成预文库构建，而传统的捕获文库构建方法中构建预文库则需要大约6小时；(3)由于本发明的方法在杂交体系中不包括封闭序列，因此能够在保证捕获效率和覆盖度不受影响的前提下大大节约建库成本。
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
图1：常规的捕获文库构建方法的流程示意图。
图2：本发明的捕获文库构建方法的一个实施例的流程示意图。
图3：Y型接头的结构示意图。
图4：封闭序列的结构示意图。
具体实施方式
实施例1：根据本发明的方法构建捕获文库
步骤1.获得片段化的DNA、末端修复和末端加A
根据制造商的说明，用5X WGS Fragmentation Mix试剂盒(Enzymatics，货号Y9410L)制备如表1所示的反应体系以一步完成片段化、末端修复和末端加A，并将该反应体系按以下程序进行反应：4℃,1分钟；32℃，16分钟；65℃，30分钟，然后保持在4℃。
表1
步骤2.连接接头
(1)制备接头
合成如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，其中SEQ ID NO：2的5’端具有磷酸化修饰。
SEQ ID NO：1
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
SEQ ID NO：2
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC{index}ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列在以下条件下退火，以形成长Y型接头：95℃，2min；95℃，2min，以0.1℃/s的速率降温到90℃，并保持2min；以0.1℃/s的速率降温到85℃，并保持2min；以0.1℃/s的速率降温到80℃，并保持2min；以此类推，直到以0.1℃/s的速率降温到25℃，并保持2min；最后保持在4℃。
(2)连接接头
使用WGS Ligase试剂盒(Enzymatics，货号L6030-WL)，用步骤1的反应体系制备如表2所示的连接体系，并将该连接体系在20℃温育15分钟，然后保持在4℃。
表2
连接反应结束后，用Beckman Agencourt AMPure XP试剂盒(Beckman，货号A63882)对连接产物进行纯化。
步骤3：捕获杂交
使用xGen Lockdown Reagents试剂盒(IDT，货号1072281)，在步骤2的纯化产物中加入14.5μl杂交试剂(9.5μl xGen 2×杂交缓冲液、3μl xGen杂交缓冲液增强剂和2μlCot-1DNA)，充分混匀后于室温孵育10分钟。孵育结束后，取12.75μl上清液到新的低吸附的0.2mL离心管中，然后加入4.25μl杂交探针。孵育结束后，充分混匀后瞬离，并运行如下程序：95℃30s；65℃，1分钟，37℃3s，60个循环；65℃16小时；然后保持在65℃。
杂交结束后，根据制造商的说明，用xGen Lockdown Reagents试剂盒(IDT，货号1072281)清洗并纯化杂交产物(即，与目标序列结合的磁珠)
步骤4：PCR扩增
根据制造商的说明，用2×KAPA HiFiHotStartReadyMix试剂盒(KAPA，货号KK2602)，制备如表3所示的扩增体系，并按照以下程序进行PCR：95℃45s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，12个循环；72℃1分钟；保持在4℃。
扩增引物的序列如下：
P5引物：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'；
P7引物：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'。
表3
PCR程序完成之后，用Beckman Agencourt AMPure XP试剂盒(Beckman，货号A63882)对进行纯化，即获得最终的捕获文库。
对照实施例1
本实施例的文库构建方法与实施例1基本相同，区别仅在于在步骤3的杂交试剂中还包括2μl封闭序列，所述封闭序列是xGenUniversal Blockers-TS Mix(IDT，货号1075475)。
对照实施例2
本实施例的文库构建方法与实施例1相同，区别仅在于在步骤2结束后，对纯化产物进行PCR预扩增制备预文库，并在步骤3的杂交试剂中加入2μl封闭序列。具体地，用2×KAPAHiFiHotStartReadyMix试剂盒(KAPA，货号KK2602)，制备如表4所示的预扩增体系，并按照以下程序进行PCR：95℃45s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃1分钟；保持在4℃。
预扩增引物的序列如下：
P5引物：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'；
P7引物：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'。
表4
PCR程序完成之后，用Beckman Agencourt AMPure XP试剂盒(Beckman，货号A63882)对进行纯化，然后进行捕获杂交。步骤3的杂交试剂中加入的封闭序列是xGenUniversal Blockers-TS Mix(IDT，货号1075475)。
对照实施例3
本实施例的文库构建方法与对照实施例2相同，区别仅在于在步骤3中，杂交体系中未加入封闭序列。
将以上实施例1和对照实施例1-3制备的捕获文库进行qPCR定量，然后按照测序仪标准操作流程，用Illumina NovaSeq 6000测序平台对文库进行测序(150bp双端测序)，每个样本测得10G数据。测序结果如表5所示。
表5
从表5可以看出，在没有PCR预扩增的情况下，是否添加封闭序列对最终的捕获效率、覆盖度和比对率没有显著影响，所制备的捕获文库均满足测序的质量要求(实施例1vs对照实施例1)。
此外，比较对照实施例1与对照实施例2的测序结果发现，在添加封闭序列的情况下，捕获效率、覆盖度和比对率没有显著差异，说明PCR预扩增可以省略而不会影响最终文库的质量。而比较实施例1与对照实施例3的测序结果发现，在不添加封闭序列的情况下，PCR预扩增反而会造成捕获效率和20×覆盖度等质控参数显著降低。
最后，将对照实施例2和对照实施例3进行比较可以发现，在进行PCR预扩增的情况下，不添加封闭序列会导致捕获效率和20×覆盖度等质控参数显著降低。这表明，当连接接头后的DNA通过PCR预扩增形成预文库后，在与杂交探针的杂交过程中必须加入封闭序列，否则将严重影响最终捕获文库的质量，使其无法满足上机测序和后续数据分析的要求。
实施例2：根据本发明的方法构建捕获文库
根据实施例1所述的方法，分别用外周血gDNA、干血斑gDNA、口腔拭子gDNA制备捕获文库。将捕获文库进行qPCR定量，然后按照测序仪标准操作流程，用Illumina NovaSeq6000测序平台对文库进行测序(150bp双端测序)，每个样本测得10G数据。测序结果如表6所示。
表6
由上表可见，本发明的测序文库的构建方法可适用于多种样本类型，尤其是DNA含量较少的外周血、干血斑、口腔拭子等样本。
实施例3：DNA起始量对捕获文库的影响。
根据实施例1所述的方法，用不同起始量的基因组DNA样本构建捕获文库。将捕获文库进行qPCR定量，然后按照测序仪标准操作流程，用Illumina NovaSeq 6000测序平台对文库进行测序(150bp双端测序)，每个样本测得10G数据。测序结果如表7所示。
表7
由上表可见，在5ng-200ng的范围内，根据本发明方法构建的捕获文库在捕获效率、覆盖度和比对率方面没有显著差异。这表明，根据本发明的方法可以使用起始DNA含量低至5ng的样本，所制备的捕获文库完全满足上机测序和后续数据分析的要求。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
