自动收集指定数目的细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月3日提交的美国临时专利申请序列号62/416,773的权益，其公开内容通过引用整体结合于此。本申请要求2016年11月3日提交的美国临时专利申请序列号62/416,775的权益，其公开内容通过引用整体结合于此。本申请要求2016年12月5日提交的美国临时专利申请序列号62/430,094的权益，其公开内容通过引用整体结合于此。本申请要求2017年6月28日提交的美国临时专利申请序列号62/526,177的权益，其公开内容通过引用整体结合于此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国家卫生研究院授予的授权号2R42GM106421的政府支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。
背景技术
从混合群体中选择和分离单细胞是在整个生物医学研究中进行的一个常见过程。例如，在基因工程细胞系、来源于干细胞的细胞系或从患者细胞系生长的细胞系的发展期间，必须分离单细胞，并且然后克隆以形成均质群体。存在多种策略来选择性地鉴定和收集来自混合群体的非粘附细胞，包括荧光活化细胞像素组合(FACS)、有限稀释、淘选、柱层析和磁像素组合；此外，基于微流控和介电电泳的新技术在这一领域也显示出应用前景。为了解决收集纯的或富集的贴壁细胞群体的需要，研究人员使用这些程序，将细胞从其生长表面解聚或剥离，以产生细胞悬浮液。不幸的是，酶或机械释放带来了显著的缺点，包括细胞形态的丧失、细胞表面标志物的去除、细胞膜的损伤、细胞生理学的改变和活性的丧失。
为了解决这一问题，开发了一种使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔阵列的细胞分离和回收系统，聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔阵列包括由生物相容性聚苯乙烯或其它材料形成的可释放的微制造元件，称为筏。这种系统的一个版本称为CELLRAFTTM系统。筏的大小可以从几十微米到几百微米变化，以便为单细胞或大的集落提供足够的生长面积。包括筏的PDMS微孔阵列可以使用例如倒置显微镜来可视化。包含所需细胞的单个筏可在微孔阵列的机械变形时从阵列中释放，例如通过施加诸如机械推动或连续振动的渐变能量。在一个示例中，包含所需细胞的单个筏可由研究人员或技术人员可视化，并且然后通过机械地将附接到显微镜物镜的探针推入筏中而从阵列中释放。
发明内容
本发明的实施例提供了一种使用从数字成像装置或系统获得的细胞及其周围的图像的计算机化分析来分离和收集细胞的自动化方法和系统。本发明的实施例利用“微孔阵列”，其可以包括形成的、弹性的压痕网格或“孔”。微孔阵列中的许多、大多数或所有孔可以包含可释放的、微制造的元件，其可以被称为“筏”。本发明的实施例提供了一种用于细胞收集的系统和方法，其包括具有分离的单个或特定一组或多组细胞的筏的计算机化的识别和收集，以消除对连续的人体识别和选择的需要。
在一些示例中，系统被配置为从微孔阵列释放细胞筏。该系统包括被配置为获得微孔阵列的图像的成像装置、被配置为从微孔阵列释放细胞筏的致动器、以及包括至少一个处理器和存储器的计算机系统。计算机系统被编程用于：使用成像装置获得微孔阵列的一个或多个图像；通过分析微孔阵列的一个或多个图像，识别所选择的细胞筏；以及控制致动器从微孔阵列释放所选择的细胞筏。
系统可以包括一个或多个电机，电机被配置为移动成像装置或微孔阵列或两者，并且获得微孔阵列中的一个或多个图像可以包括通过以下步骤执行阵列扫描：将微孔阵列划分为多个视场，使得视场共同包括细胞筏中的每个细胞筏；以及针对每个视场，控制一个或多个电机以使成像装置与微孔阵列的视场定向，并控制成像装置以在视场处获得相应图像。
系统可以包括用于成像系统的显微镜物镜，并且获得微孔阵列的一个或多个图像可以包括，针对每个视场，使用来自至少一个相邻视场的一个或多个聚焦位置来自动聚焦显微镜物镜。自动聚焦显微镜物镜可包括在多个样本聚焦位置处采样多个样本图像，以及根据样本图像的聚焦分数内插当前聚焦位置。
识别所选择的细胞筏可以包括，针对每个细胞筏，对细胞筏的子图像中描绘的细胞数目进行计数，并且识别承载单个分离细胞的至少一个单细胞筏。对子图像中描绘的细胞数目进行计数包括对子图像应用强度阈值以创建二值图像、识别二值图像中的唯一对象以及对所识别的唯一对象的数目进行计数。识别单细胞筏可以包括确定置信度分数，该置信度分数指示在确定单细胞筏容纳单个分离细胞时的置信度。
识别所选择的细胞筏可包括，针对每个细胞筏，检测在细胞筏的子图像中描绘的标志物，以及基于检测到标志物来选通细胞筏。识别所选择的细胞筏可以包括将所选择的细胞筏分配到收集板的映射位置。系统可以包括机械细胞筏收集器，并且计算机系统可以被配置为用于控制机械细胞筏收集器以在从微孔阵列释放之后收集所选择的细胞筏，并且用于控制机械细胞筏收集器在收集板的映射位置处沉积所选择的细胞筏。
在一些示例中，系统被配置为监视蜂窝过程。例如，系统可被配置为执行细胞或细胞组的时程分析，例如针对药物或试剂挑战，或针对基因表达或细胞条件的改变，诸如细胞毒性、细胞生长或代谢状态。系统包括被配置为获得微孔阵列的图像的成像装置，微孔阵列包括微孔阵列的微孔中的细胞筏。系统包括计算机系统，计算机系统包括至少一个处理器和存储器。计算机系统被配置为在第一次时使用成像装置确定至少一个细胞筏包含经受细胞处理的一个或多个细胞。计算机系统被配置为响应于确定至少一个细胞筏包含经受细胞处理的一个或多个细胞，将至少一个细胞筏的位置存储在微孔阵列上。计算机系统被配置为在比第一次晚一次或多次时，通过使用位置定位至少一个细胞筏并且使用成像装置获得至少一个细胞筏的一个或多个图像来监视细胞处理。
监视细胞处理可以包括存储一个或多个图像，并且将一个或多个图像中的每个图像与图像的相应拍摄时间和至少一个细胞筏的位置相关联。监视细胞处理可以包括在图形用户界面中呈现至少一个细胞筏的一个或多个图像和初始图像。
确定至少一个细胞筏包含经受细胞处理的一个或多个细胞可以包括：用指定波长的光照射至少一个细胞筏；响应于照射至少一个细胞筏，使用成像装置获得至少一个细胞筏的初始图像；以及检测初始图像中的细胞处理的荧光特征。监视细胞处理可以包括在图形用户界面中呈现一个或多个图像中随时间的荧光强度的曲线图。
确定至少一个细胞筏包含经受细胞处理的一个或多个细胞可以包括确定至少一个细胞筏是仅包含单个细胞的单细胞筏，以及使用初始图像量化基线荧光水平。监测细胞处理可以包括确定一个或多个图像与初始图像之间的所测量的荧光差。
在至少一些实施例中，计算机实现的收集细胞的方法包括存储关于包含多个筏的微孔阵列的信息，以及从多个筏中识别一个或多个细胞筏。类似于本文所述的系统可用于收集单细胞筏。单细胞筏是具有与其相关联的一个分离细胞的筏，并且通常这些是将被选择的细胞筏。然而，根据本发明的实施例的系统也可以或替代地用于分离具有除单个细胞之外的特定数目的细胞的筏，或者作为另一示例，具有一种类型的单个细胞和另一种类型的多个细胞的筏，或者不同类型的特定数目的细胞的组合。然后，该系统可以通过控制和使用致动器从微孔阵列释放细胞筏，并且例如使用磁体收集细胞筏。系统可以在移到下一筏之前可选地确认筏释放。关于微孔阵列的信息可存储在与执行计算机实现的方法的处理器相关联或连接到该处理器的存储器装置中。
在一些实施例中，存储关于微孔阵列的信息包括识别和存储微孔阵列的尺寸，识别和存储用于微孔阵列的最佳聚焦位置和最佳曝光，以及分割微孔阵列并存储将一组微孔匹配到视场所需的平移。在一些实施例中，存储关于微孔阵列的信息包括计算和存储致动器的偏移。
在一些实施例中，细胞筏的识别包括分割微孔阵列的多个筏并且对多个筏的每个筏的细胞核进行计数。在一些实施例中，计数包括执行流域变换以相对于荧光阈值定义细胞核。在一些实施例中，要释放的细胞筏的识别还包括通过检测标志物来选通或确定要释放细胞筏中的哪一个。作为示例，标志物可以包括一个或多个颜色通道的强度(其可以指示由染色引起的荧光)和/或细胞核、细胞本身或细胞内除核之外的结构的大小。
根据本发明的示例性实施例，诸如工作站、个人计算机、手持计算机或嵌入式处理系统的计算机系统可以用作系统的一部分和/或连接到成像装置、系统和/或硬件、致动器和其他装置，并且包括或访问非暂时性计算机程序代码，当由处理器执行时，非暂时性计算机程序代码使得系统执行全部或部分处理。计算机程序代码可以存储在存储装置中。
附图说明
图1A至图1C是用于细胞收集的示例系统的图。
图2A至图2B是用于细胞收集的示例装置的等轴视图。
图3A至图3B示出了用于细胞收集的示例方法。
图4A至图4E是示出根据本发明的示例实施例的系统的用户输入、图形用户界面功能、硬件和软件之间的交互的工作流程图。
图5是用于确定微孔阵列的阵列位置和类型的示例方法的流程图。
图6是用于导航微孔阵列的示例方法的流程图。
图7A至图7C示出了用于将显微镜透镜自动聚焦在微孔阵列的视场上的示例方法。
图8是用于识别微孔阵列中的单细胞筏的示例方法的流程图。
图9是用于选择细胞筏和绘制收集板的图形用户界面的示例画面的画面截图。
图10是图形用户界面的另一示例画面的画面截图。
图11A至图11I是示出示例实验的框图(图11A)和一系列图像(图11B至图11I)。
具体实施方式
下面将参照附图更全面地描述本发明的实施例，附图示出了本发明的实施例。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解释为限于本文阐述的实施例。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意在限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也意在包括复数形式，除非上下文清楚地另外指示。将进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括”或“包含”时，特指所述特征、步骤、操作、元件或构件的存在，但不排除一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、构件或其组的存在或添加。此外，诸如“高于”、“低于”、“少于”、“多于”的比较性的定量术语旨在涵盖平等的概念，因此，“较少”不仅在最严格的数学意义上意味着“较少”，而且还意味着“低于或等于”。
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。应当进一步理解，本文中使用的术语应当被解释为具有与它们在本说明书和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且除非在本文中明确定义，否则将不会被解释为理想化的或过度正式的含义。还应当理解，当一个元件被称为“连接”或“耦接”到另一个元件时，它可以直接连接或耦接到另一个元件，或者可以存在中间元件。
单细胞分离可用于广泛的科学研究，包括单个细胞(例如，DNA、RNA、蛋白质)的分子分析，以及在转染后从包括细胞的单个细胞通过克隆繁殖获得集落。在每个孔(“微孔阵列”)中包括多个细胞筏的微孔阵列已被示出在单细胞分离和收集中是有用的。当寻求获得大量单细胞用于分析或繁殖时，通过使用标准显微镜的手动方法从微孔阵列中分离和收集单细胞可能需要相当长的时间。可以与本发明的实施例的系统和方法一起使用的具有细胞筏的微孔阵列的详情在美国专利9,068,155中描述，该专利通过引用结合于此。一种从已接种有受关注细胞的微孔阵列中收集细胞的自动化系统可以减少用单细胞进行科学和医学研究的时间和劳力，同时还包括诸如跨多个荧光通道成像的附加特征。
根据本发明的示例性实施例的用于收集细胞的系统包括致动器、成像装置和连接到致动器和成像装置的处理器，该处理器可通过使用存储的可执行计算机程序代码来操作以执行计算机实现的方法，例如，如图3A至图3B、图4A至图4E、图5至图6、图7A和图8所示。本发明的实施例的方法和系统在附图中通过示例的方式呈现为识别微孔阵列中的单个细胞筏上存在的单个隔离细胞，并且通过收集单细胞筏的方式来收集这些细胞。
图1A至图1C是用于细胞收集的示例系统100的图。系统100可用于识别和收集具有不同数目的不同类型的细胞的多个细胞、细胞集落和筏。图1A是系统100的概览图。系统100包括计算机系统102、仪器组件104、实验环境106(例如，一件或多件实验室装置，诸如电源和环境控制系统)和用户108。仪器组件104包括用于接收微孔阵列112的可选适配器板和用于接收已经被选择并从微孔阵列112释放的细胞筏的收集板114。收集板114可以被组织成标准化格式，例如，作为SBS收集板。尽管示出了收集板114，但系统100可替代地使用任何适当的收集结构，例如PCR条管。
典型地，用户108将在微孔阵列112上加载或接种培养基中的细胞，并允许细胞沉降到单个细胞筏中。然后微孔阵列112被放置到系统100的适配器板110中用于扫描和图像分析。然后，系统100可以通过控制和使用致动器从微孔阵列112释放细胞筏，并且使用例如磁体收集具有分离的细胞的细胞筏。例如，致动器可以是被配置为平移针或类似装置以释放筏的一个或多个电机。在一些示例中，系统100包括多个致动器，该多个致动器包括移动磁棒的可能的另一致动器，以及移动载物台的致动器、成像光学器件和系统的其他机械部件。
图1B是计算机系统102的框图。计算机系统102包括至少一个处理器120、存储器122、使用处理器120和存储器122实现为计算机程序的控制器124、以及图形用户界面(GUI)126。例如，计算机系统102可以是具有监视器、键盘和鼠标的台式计算机，或者计算机系统102可以是膝上型计算机或平板计算机或任何其他适当的装置。计算机系统102例如通过通用串行总线(USB)电缆可操作地耦接到仪器组件104。
控制器124被编程用于获得微孔阵列112的一个或多个图像；通过分析图像，识别微孔阵列112的所选择的的细胞筏；以及控制仪器组件104以释放所选择的细胞筏。控制器124可以执行参考图3A至图3B、图4A至图4E、图5至图6、图7A和图8进一步描述的示例性方法。GUI 126被配置为向用户108呈现各种控制和结果画面并且从用户108接收输入。
图1C是仪器组件104的框图。仪器组件104可包括用于将单个细胞筏130成像在微孔阵列130上并选择性地从微孔阵列释放细胞筏130以放置到收集板114中的各种构件。例如，仪器组件104可以包括电源分线板138和用于控制电机和致动器的各种控制板(例如，PS3控制板132、PS3XYZ控制板134和PS3滤光器控制板136)。电机控制板可包含TTL和快门功能，其允许控制器124控制或寻址仪器组件104的各种构件。
仪器组件104可以包括数码相机140或其他适当的成像装置、通信集线器(例如，USB集线器142)、荧光发光二极管(LED)引擎144和光导适配器146。荧光LED引擎144可包括多个窄带LED，该多个窄带LED经配置以经由光导适配器146的方式照亮微孔阵列112。
仪器组件104包括显微镜系统(例如，内部倒置数字显微镜)，该显微镜系统包括电动XY载物台148和配置成移动显微镜物镜152的自动聚焦电机150。典型地，相机140和荧光LED引擎144以及显微镜系统被布置为外延荧光配置。在一些示例中，显微镜系统包括释放探针154，释放探针154被配置为从微孔阵列112单独释放细胞筏130。释放探针154可由自动聚焦电机150致动。
在一些示例中，如果筏以分辨率小于每像素2微米在给定视场中具有100微米×100微米阵列，则显微镜系统支持在具有200微米×200微米尺寸的筏和大约8×8阵列特征的微孔阵列上成像至少约4×4阵列特征的区域。显微镜系统还可以支持使用明场成像(即白光照明和白光发射)来拍摄图像，以及在一个或多个荧光发射通道中拍摄图像。在一些示例中，假设在所有通道上的曝光时间为750ms，仪器组件104能够在不到20分钟的时间内扫描整个微孔阵列以用于所有三个荧光通道和明场。
释放探针154通常包括当暴露于盐水或细胞培养基时抗氧化的材料。在一些示例中，释放探针154是不锈钢100微米针。释放探针154相对于微孔阵列112的中心可以具有例如在X和Y方向上至少15mm的可能行进距离。
仪器组件104包括机架组件，机架组件包括用于移动机架组件的带驱动器156、用于在成像期间照亮微孔阵列112的明场LED 158、以及被配置为移动磁棒162以在释放之后收集细胞筏的线性致动器160。机架组件可选地使用导螺杆而不是带驱动器或任何其它合适的电机。线性致动器160可以是例如步进电机，步进电机被配置为将磁棒162提升到微孔阵列112和收集板104中以及将磁棒162从微孔阵列112和收集板104中下降排出。
仪器组件104包括位于收集板114下方的收集磁体164，以将细胞筏从磁棒162收集到收集板114中。收集磁体164可以具有与磁棒162相反的极化，以排斥磁棒162内的磁体并将细胞筏拉到收集板104的底部。磁棒162典型地包括能够被灭菌的材料(例如，在从仪器移除时用乙醇或异丙醇冲洗)，以便不污染释放的细胞筏或收集板104中使用的培养基。用于磁棒162的材料也通常被选择为使得与培养基的接触不会导致细胞活性或繁殖，或分子生物学试剂(诸如Taq聚合酶或逆转录酶)的性能的任何可检测的降低。
图2A至图2B是用于细胞收集的示例装置的等轴视图。该装置是图1C所示的仪器组件104的示例实现。如图2A所示，适配器板110和收集板114位于水平XY载物台148的顶部。一些构件(诸如电子控制板132、134和136)位于XY载物台148下方。XY载物台148被配置为移动微孔阵列112和收集板104。XY载物台148可电子控制，用于定位用于成像的细胞筏(使细胞筏与显微镜物镜152对准)、释放细胞筏(使细胞筏与释放探针154对准)和沉积细胞筏(使磁棒162和收集板104在收集磁体164上的选定位置对准)。
包括带驱动器156的机架组件垂直定位在XY载物台148上方。机架组件被配置为横向移动以定位用于成像的明场LED 158，并且还定位磁棒162。机架组件将磁棒162定位在微孔阵列112上方以在释放期间收集筏，并且然后机架组件将磁棒162定位在收集板114上方以将细胞筏沉积到收集板114的选定位置中。
相机140和自动对焦电机150位于XY载物台148下方，例如，使得自动对焦电机150可以相对于XY载物台148垂直移动。荧光LED引擎144和液体光导端口146位于XY载物台148下方并耦接到荧光滤光器立方体170。荧光滤光器立方体170被配置用于荧光成像，例如，以允许来自荧光LED引擎144的光到达微孔阵列112并阻挡该光到达相机140。
图2B示出了显微镜物镜152和释放探针154的剖切图172。如图所示，释放探针154偏离显微镜物镜152的光轴，使得释放探针154不与显微镜物镜152的视场相交。由于释放探针154不与视场相交，用户可能无法实时可视化细胞筏的释放，使得系统在释放之后可能必须移动微孔阵列112以通过成像确认释放。然而，将释放探针154定位在显微镜物镜152的视场之外以提高成像速度可以是有用的。
在一些其它示例中，释放探针154位于显微镜物镜152的视场内。将释放探针154定位在显微镜物镜152的视场中允许用户实时可视化细胞筏的释放；然而，这样的位置可能需要通过丙烯酸窗成像，这可以减少激发和发射光的透射，并且在扫描期间需要更长的整合时间。
在任一情况下，校准显微镜物镜152的视场中心与释放探针154在微孔阵列112上的刺穿位置之间的偏移可以是有用的。校准可以例如，在每次更换针头之后，或者在每次实验开始时执行，或者在制造期间执行一次。在一些示例中，图1B的控制器124被编程为执行自动校准。
例如，控制器124可以移动微孔阵列112以用阵列边界定位显微镜物镜152的视场，自动聚焦显微镜物镜，并且然后用释放探针154刺穿阵列边界。然后，控制器124移动微孔阵列112以将刺穿位置定位在显微镜物镜152的视场内，获取图像(例如，使用明场LED 158)，并且分析图像以定位刺穿位置，例如，通过分割图像。然后，控制器124可以计算偏移。在一些示例中，控制器124通过移动到不同位置重复指定次数的处理，并且例如通过对偏移位置求平均值来基于偏移位置确定校准距离。
图3A至图3B示出了用于细胞收集的示例方法。图3A是用于从微孔阵列收集细胞的示例方法300的流程图。方法300可以由图1的控制器124执行，并且将相对于图1的系统100来描述方法300。
方法300包括初始化系统(302)和建立实验(304)，下面将参考图4A至图4B进一步描述这些实验。方法300包括例如通过使用GUI 126提示用户108来确定是否执行阵列扫描(306)。如果不执行阵列扫描，则方法300包括通过例如使用GUI 126接收的用户命令(308)来导航微孔阵列112。通过用户命令导航可以包括在用户导航微孔阵列112时实时呈现微孔阵列122的图像。然后，方法300包括接收(例如，使用GUI 126选择的)用于细胞收集的一个或多个细胞筏的用户选择(310)。
如果执行阵列扫描，则方法300包括通过在没有用户输入的情况下导航微孔阵列112来执行阵列扫描(314)。然后，方法300包括使用图像分析来选择用于细胞收集的一个或多个细胞筏(316)。图3B是使用图像分析选择细胞筏的示例方法350的流程图。方法350包括检测单细胞筏(352)，基于标志物检测对单细胞筏进行选通(354)，以及将选通的单细胞筏映射到收集板(356)上的位置。选通单细胞筏通常包括基于荧光标志物的检测来选择检测到的单细胞筏的子集。
下面参考图4C至图4D进一步描述阵列扫描、单细胞检测和自动或半自动细胞筏选择。在一些示例中，并行地执行阵列扫描和识别细胞筏。例如，控制器124可以并行地执行多个线程，或者使用任何适当的并行处理技术。
方法300包括释放和传送所选择的细胞筏(312)。下面将参考图4E进一步描述释放和转移。方法300可选地包括导出描述实验的数据，例如，接收到的用户输入、拍摄到的图像、检测到的单细胞筏的位置、释放的细胞筏的记录以及任何其他适当的数据。导出数据可以包括将数据存储在本地文件系统上的文件中，或者将数据发送到远程系统以进行存储。
如图3A至图3B所示，根据示例实施例的系统可用于手动选择模式，其中用户在实时成像期间(“实时成像模式”)识别单细胞筏，其可包括将这样的图像存储在存储器装置中，但也可用于计算机实现的细胞收集方法，称为“细胞测量图像分析”模式。根据一些实施例，用户108通过GUI 126选择以细胞测量图像分析模式或实时成像模式操作系统100。在实时成像模式中，用户108能够选择性地导航微孔阵列112内的成像视场，并且基于实时图像的视觉检查来选择用于分离的筏。在细胞测量图像分析模式中，执行微孔阵列的全扫描，并且然后定量图像处理(例如，荧光图像的)便于用于分离的细胞的用户选择或用于收集的细胞的自动选择。
在细胞测量图像分析模式中，系统扫描微孔阵列并在存储装置中存储关于包含多个筏的微孔阵列的信息，使用处理器执行图像分析并使用该信息来识别具有来自多个筏中的一个或多个细胞的细胞筏，并且使用处理器和致动器从微孔阵列释放细胞筏。在一些实施例中，存储关于微孔阵列的信息包括计算和存储致动器的偏移。在一些实施例中，系统确定微孔阵列中的多个微孔中的每个微孔的地址，以便通过依赖于特定筏的已知位置来加快未来的操作。系统可以基于标志物的检测，例如基于从成像装置确定的荧光颜色或明场通道的强度、细胞核或其它结构的尺寸或这些标志物的组合，来执行要由致动器释放的细胞筏的选通。在一些实施例中，系统使用磁体收集包含磁性纳米颗粒的细胞筏，并且可以可选地确认细胞筏实际上已经被释放。
图4A至图4E是示出根据本发明的示例实施例的系统的用户输入、图形用户界面功能、硬件和软件之间的交互的工作流程图。将参考图1的示例系统100描述工作流程图。每个工作流程图被水平地划分为四个区域。最顶部区域示出了由用户108执行的动作。最顶部区域下方的区域示出了使用GUI 126执行的动作。下一个区域示出了使用硬件(例如，仪器组件104)执行的动作。最底部区域示出了由控制器124执行的动作。
图4A示出了示例实验的开始。用户108例如从致动器取回细胞，并从板释放细胞。用户108预处理微孔阵列112并在微孔阵列112上接种细胞。用户108向仪器组件104和计算机系统102供电，并启动控制器124和GUI 126。在初始化期间，GUI 126可以显示初始化启动画面，同时仪器组件104设置相机参数并将电机移动到主位置，并且然后加载位置。控制器124启动并验证与仪器组件104的通信，包括电机控制器、LED照明器和相机。
图4B示出了示例实验的下一阶段，实验装置。GUI 126提示用户108将微孔阵列112放置在显微镜载物台上。用户108将微孔阵列112放置在XY载物台148上(例如，放置在适配器板110上)。GUI 126提示用户108选择细胞测量模式或实时分析模式，从用户108接收选择，并且然后显示指示系统正在校准微孔阵列112的阵列位置的画面。
控制器124执行阵列位置和类型例程，其包括控制仪器组件104以获得微孔阵列112的图像并识别微孔阵列112的取向和微孔阵列112的类型。微孔阵列112的类型可以表征例如微孔阵列112上的细胞筏的数目和尺寸。阵列位置和类型例程可以包括执行自动聚焦和导航例程以及识别细胞筏，例如，通过对明场图像执行图像分割。下面将参考图5进一步描述一个示例阵列位置和类型例程。在一些示例中，系统100向用户108提供用户界面控制以控制载物台电机和明场图像的视觉反馈以将微孔阵列112的拐角定位在视场内，并单击其来识别阵列位置和类型。
如果用户108选择实时成像模式，则控制器124执行实时图像采集例程。用户108设置成像参数和视场并实时地查看图像，即当仪器组件104导航微孔阵列112时的图像。控制器124响应于来自操纵视场位置的GUI 126的用户输入来控制XY载物台148和自动聚焦电机150。控制器124执行自动聚焦和导航例程以导航微孔阵列112，并且在新的视场处识别细胞筏。用户108在查看图像之后，选择一个或多个细胞筏用于释放和转移。如果用户108选择了细胞测量成像模式，则GUI 126可选地用户108呈现画面以设置阵列扫描的成像参数。可选地，可以从文件读取成像参数或通过网络连接接收成像参数。
图4C示出了如果用户108选择细胞测量模式、阵列扫描和单细胞检测，示例实验的下一阶段。GUI 126可选地在阵列扫描期间呈现状态画面。控制器124将阵列范围划分成离散的视场，例如，通过最大化每个视场内的细胞筏的数目(即，最小化视场的数目)，同时确保没有细胞筏丢失。
通常，控制器124使用迭代状态定位和筏分割处理来优化筏在每个视场中的位置，以使每个视场中的细胞筏的数目最大化，并计算对下一组细胞筏成像所需的平移。控制器124可以基于例如阵列中细胞筏尺寸和间距的一致性来执行迭代阶段定位和筏分割；视场中的全细胞筏与视场边缘之间的标称裕度；状态电机移动的精度；和计算时间以检测图像中的细胞筏。可选地，控制器124可以在视场之间平移给定距离，该给定距离确保至少重叠一个细胞筏宽度并且在处理期间解析重复的细胞筏图像。
仪器组件104将XY载物台148平移到第一视场。控制器124执行自动聚焦和导航例程，其可以包括识别视场中的细胞筏，以及然后控制器124执行图像获取例程。图像获取例程可以包括根据成像参数来点亮一个或多个特定光源，例如，是否指定特定的荧光通道，并且然后根据指定的，例如特定的曝光时间来控制相机140。
然后，控制器124控制XY载物台148移动到下一视场，并且重复自动聚焦和导航例程以及图像获取例程。阵列扫描继续，直到达到结束条件为止，例如，整个微孔阵列112或微孔阵列112的指定部分已经成像或达到时间限制。阵列扫描可以以任何适当的方向方式进行，例如，在一个方向上处理一行，并且然后在相反方向上处理下一行。在阵列扫描期间，控制器124为每个检测到的细胞筏分配地址。地址是有用的，例如，使得细胞筏的图像和其他数据可以与细胞筏相关联，并且使得细胞筏可以被定位以释放和转移。
当扫描完成时，GUI 126呈现用于从用户108接收单细胞检测参数的可选画面。用户108可以输入例如颜色通道和颜色通道的阈值。控制器124对在扫描期间获得的图像执行图像分析以识别单细胞筏。例如，控制器124可以使用所选图像的提取的子图像来分割每个细胞筏中的细胞核。典型地，微孔阵列112的视场的图像将包括多个细胞筏。提取特定细胞筏的子图像可以包括分割图像以识别细胞筏的位置，以及然后分离图像中描绘特定细胞筏的部分。下面将参考图8进一步讨论如何识别单细胞筏。然后，控制器124可以计算和编译在所选图像中分割的细胞筏和细胞核的度量。
图4D示出了如果用户108选择细胞测量模式、标志物选通和板映射时的示例实验的下一阶段。在标志物选通期间，GUI 126为用户108呈现画面以指定标志物选通参数。用户108定义荧光选通器。例如，用户108可以指定阈值颜色强度。控制器124计算并编译用于选通的单细胞筏的度量，并且GUI 126呈现显示结果的画面。
标志物是细胞特征，其可以由核酸、蛋白质、其它类型的有机或无机分子、或诸如形态特征和细胞器大小和结构的细胞特征表示，在给定细胞内对其的检测用于识别或分类给定细胞，或用于将其与可能不包含给定标志物或在不同程度上包含给定标志物的其它类型的细胞区分。可以使用一系列方法和材料来检测标志物的存在、相对量或定量。这些包括使用染料，染料包括荧光染料，染料标记细胞、细胞器或其它细胞特征，诸如细胞分裂素、细胞核、线粒体和一系列其它细胞器隔室。这种染料在本领域中是公知的。它们还可以包括使用用于光学可检测探针检测天然分子的方法和材料，该天然分子可以由具有与标志物序列互补序列的核酸、抗特定标志物蛋白的抗体或转基因方法表示，其中表达标志物的基因被设计为包括非天然部分，诸如荧光基序(例如绿色荧光蛋白)、抗原(例如HisX6)或酶活性(例如荧光素酶或碱性磷酸酶)。
在本说明书的上下文中，标志物还可以是荧光染料，其单独地或与一个或多个化学或亲和基团组合，可用于确定细胞是否存在，或者给定细胞是否死亡、活着、完整、不完整，或者任何其它细胞状况或过程。本文术语标志物还可用于描述信号，诸如荧光或其它光学可检测信号，信号通过自动化系统中的图像分析检测，并用于识别或分类给定细胞，或用于将其与其它类型的细胞或具有不同特性或特征的细胞区分。
在板映射期间，GUI 126呈现用于将细胞筏分配给收集板114中的孔的画面。例如，用户108可以从细胞筏的图形显示中手动选择细胞筏，并且将细胞筏分配给收集板114中的孔的图形显示。在另一示例中，控制器124可以随机地将细胞筏分配给收集板114中的可用孔。控制器124可以基于用户指定的标准来选择细胞筏，例如，通过选择被确定为单细胞筏(例如，具有至少指定的置信度水平)并且具有存在的指定标志物(例如，至少在阈值水平下存在检测到的标志物)这两者的每个细胞筏。控制器124编译用于收集板孔的细胞筏位置的列表。
在一些示例中，对于当前选择的标志物选通器内的所有细胞筏，GUI 126显示微孔阵列112上的细胞筏的近似位置和一个或两个成像通道内的荧光强度的2D直方图或散点图。选通的群体内的每个细胞筏在散点图上由不同的视觉指示器(例如，单个黄色填充圆)表示，每个细胞筏的(x，y)位置等于对应于两个轴的相应成像通道内的细胞筏的荧光强度。荧光强度跨整个细胞筏被整合，并且相对于该成像通道的整个单细胞驻留群体内的最大整合细胞筏强度被缩放。沿着每个轴的其它指示器，例如彩色的标志，允许用户108容易地切换给定轴的成像通道。
在一些示例中，GUI 126可以提供允许用户108在荧光强度散点图上创建标志物选通器的用户界面控件：
·象限-在散点图上单击左键定义一组十字准线的位置。在十字准线定义的四个象限中的任何一个内双击都会为该象限创建一个新的选通器。每个象限都可以用来创建单独的选通器。
·线-在散点图上单击两次左键定义横跨散点图的无限条线的轨迹。双击线的任一边就会创建一个新的选通器。线的两边都可以用来创建单独的选通器。
·椭圆-在散点图上第一次单击左键定义椭圆的中心。第二次单击鼠标定义椭圆相对于中心的一个轴和半径。第三次点击鼠标定义相对于第一轴的正交半径。在椭圆内双击左键可以创建一个新的选通器。给定用于定义椭圆的方法，椭圆可以延伸超出散点图的范围。
·多边形-在散点图上连续单击左键定义多边形的顶点。要关闭多边形，请左键单击原始顶点。尽管多边形的边不能相互交叉，但是可以定义的顶点数量没有限制。在多边形内双击左键就会创建一个新的选通器。
在一些示例中，系统100将允许用户108在单个2D散点图上定义多个椭圆和多边形。如果这样的选通器重叠，则当用户选择重叠区域时，根据原始选通器几何形状创建新选通器。在一些示例中，当选择先前创建的标志物选通器(父选通器)作为当前标志物选通器时，GUI 126仅在散点图和阵列示意图上显示所选选通器内的细胞筏。因此，当在散点图上绘制新的标志物选通器几何形状并用于创建新的标志物选通器(子选通器)时，仅筛选父标志物选通器内的细胞筏以包括在子选通器中，尽管在整个单细胞驻留群体内的附加细胞筏可能落在子选通器几何形状内。
图4E说明了示例实验的下一阶段，筏的释放和转移。所选择的细胞筏从微孔阵列112释放并转移到收集板114上的映射位置。仪器组件104在控制器124的控制下，将释放探针154与第一校准细胞筏位置对准，并将磁棒162与释放探针154对准。然后，仪器组件104致动释放探针154以释放细胞筏，将磁性棒162降低到微孔阵列112中，并且然后将棒升高远离微孔阵列112。
控制器124执行确认细胞筏释放和收集例程。例如，在释放细胞筏之后，控制器124可以移动XY载物台148以使被释放的细胞筏成像。然后，控制器124可以对所获得的图像执行图像分析，以确定在所拍摄的图像中是否描绘了细胞筏。如果未描绘细胞筏，则控制器124可以确认释放。如果描绘了细胞筏，则控制器124可以用释放探针154重复释放例程，例如指定次数，直到停止以报告错误为止。
在确认释放之后，控制器124将释放的细胞筏转移到收集板114中为该细胞筏分配的孔。GUI 126可以更新状态画面，该状态画面描绘例如已经释放的细胞筏和剩余用于释放的细胞筏。然后，控制器124选择另一个细胞筏用于释放，对准释放探针154，致动释放探针154，并且然后控制磁棒162以收集释放的细胞筏。
控制器124对已被选择释放的每个细胞筏重复该过程。当选择用于释放的每个细胞筏已经被转移时，GUI 126呈现指示完成的画面。用户108从系统检索微孔阵列112和收集板。
用户108可以使用GUI 126来保存总结文件，例如，保存到本地硬盘驱动器。总结文件可以与任何合适的数据库结构兼容，并且通常包括以下方面的数据：1)用于细胞识别的成像通道；2)用于细胞测量分析的成像通道；3)用于细胞测量通道(例如，圆的中心点和半径)的所选标志物的荧光信号选通器的描述；4)用于每个成像通道的曝光时间；5)总扫描时间(如果执行)；6)分配给收集板114的每个孔的微孔阵列112中的单细胞筏的位置；7)每个收集的细胞筏的每个成像通道中的平均荧光信号强度(相对荧光单位-RFU)；以及8)当用户108确认将微孔阵列112放置在系统上时执行日期和时间运行。
图5是用于确定微孔阵列的阵列位置和类型的示例方法500的流程图。方法500可以由图1的控制器124执行，并且将相对于图1的系统100进行描述。通常，方法500包括使用例如在图像中检测到的已知阵列几何形状、制造公差和细胞筏以自动化方式搜索微孔阵列112的指定位置(例如，拐角)。
方法500包括将XY载物台148移动到初始位置(502)，例如用于成像微孔阵列112的拐角之一的估计位置。方法500包括自动聚焦显微镜系统、执行图像获取例程、以及分割所获取的图像以确定所获取的图像内的细胞筏的位置(504)。方法500可以包括计算平均细胞筏尺寸，例如，对于方形细胞筏，计算边(L)的长度。
方法500包括确定是否移动XY载物台148以定位微孔阵列112的拐角(506)，例如，确定在所获得的图像中是否描绘了拐角。例如，如果在图像顶部的阈值距离(例如，距离2×L)内检测到一个或多个细胞筏，则方法500可包括确定朝顶部平移(例如，距离L)；并且如果在图像左侧的阈值距离内检测到一个或多个细胞筏，则方法500可以包括确定朝左平移(例如，距离L)。
如果移动XY载物台148，则该方法包括移动XY载物台148以更接近微孔阵列112的拐角(508)并且重复对微孔阵列112的拐角的搜索。当找到拐角时，方法500包括510可选地基于拐角的位置将XY载物台148移动到最终位置，以确定阵列类型和取向，并自动聚焦和获得最终位置处的图像。
方法500包括基于在最终位置处的图像来确定阵列类型和取向(512)。例如，阵列类型可以通过将图案编码到微孔阵列112的指定角(例如左上角)中而被编码到微孔阵列112中。细胞筏可以通过存在或不存在(即，使得微孔被填充或未填充)来提供数字信息。方法500包括确定是否对微孔112的附加区域成像以确定类型和取向(514)。例如，方法500可针对微孔阵列112的四个拐角中的每一个重复。
图6是用于自动聚焦和导航例程的示例方法600的流程图。方法600可以由图1的控制器124执行，并且将相对于图1的系统100进行描述。
方法600包括在微孔阵列112的特定视场处自动聚焦并获得初始图像(602)。方法600包括检测初始图像内的细胞筏(604)。方法600包括移动XY载物台148以使视场中的细胞筏的数目最大化(606)。例如，如果细胞筏在初始图像中是倾斜的，则移动XY载物台148可以包括移动XY载物台148以使细胞筏与视场的边界对中。方法600包括在移动之后获得新图像(608)。方法600包括检测新图像中的细胞筏(610)。方法600包括例如通过将地址分配给在新图像中检测到的每个细胞筏来索引新图像中的细胞筏(612)。地址可以是例如行地址和列地址。
例如，当对微孔阵列112成像时，可以以视场中的每个增量执行以下处理：
1.执行自动对焦例程，并选择在图像堆栈内具有最佳自动对焦分数的明场图像进行分割。
2.使用OpenCV例程，使用Otsu方法来计算两个像素强度阈值，这两个像素强度阈值使图像中的三个像素类别之间的方差最大化。上阈值仅应用于将明场灰度图像转换为二值图像。
3.使用OpenCV例程，计算每个唯一检测到的对象的边界框，即相邻亮像素的集合。
4.随后对边界框进行带通滤波，以消除面积偏离标称细胞筏面积超过15％的任何物体；而且由于细胞筏是标称正方形的，因此也消除了X和Y尺寸彼此偏离超过10％的物体。
5.选择包含最多细胞筏对象的细胞筏行，以确定阵列在视场内的偏斜。使用到细胞筏边界框的中心的线性回归计算一阶多项式，并且斜率指示倾斜方向。
6.选取四个拐角细胞筏对象，并且基于其倾斜方向，利用其边界框计算细胞筏与视场边缘之间的边界。
7.XY载物台被移动到标称细胞筏子阵列在视场内的中心，并且Z聚焦驱动被调整到在自动聚焦例程期间内插的最佳聚焦点。
8.获取新的明场图像并重复步骤2至步骤4。
9.分段的细胞筏按行和列排序，并基于分配给先前视场的索引和XY载物台的平移方向适当地索引。
图7A是用于自动聚焦显微镜物镜的示例方法700的流程图。方法700可以由图1的控制器124执行，并且将相对于图1的系统100进行描述。
在一些示例中，系统100在实验开始时执行粗略的自动聚焦功能，并且然后随着成像显微镜视场中的每个偏移执行精细的自动聚焦功能。在加载微孔阵列112并且系统开始初始化之后，执行用于给定实验运行的第一自动聚焦程序。系统配置文件可以指定XY载物台148的X和Y位置，所述X和Y位置使显微镜物镜和系统视场与单储层微孔阵列的左上象限或四储层微孔阵列的左上储层对准。系统导航到该位置并执行如下粗略的自动对焦过程：
1.焦点驱动器被移动到配置文件中定义的焦点搜索范围中的最小位置。
2.使用例如2x像素组合和动态确定的曝光时间来获取明场图像。
3.并行地：
a.从相机传送图像数据，并且计算聚焦分数，该聚焦分数基于图像上的像素强度的变化来量化图像对比度。
b.聚焦驱动上移，例如100μm。
4.如果焦点驱动尚未到达配置文件中定义的搜索范围的顶部，请重复步骤2和步骤3。如果已到达，则软件提取具有最大聚焦分数的聚焦位置。
然后，系统100可以使用任何适当的技术将显微镜物镜自动聚焦在特定的视场处。例如，控制器124可以执行Z堆栈例程以搜索Z轴上的自动聚焦位置。Z堆栈例程选择沿Z轴的底部和顶部搜索限制以及样本聚焦位置之间的固定步长。在一些示例中，在阵列扫描期间，搜索限制可以应用于微孔阵列112内的每个视场。然后，Z堆栈例程获取图像并计算每个样本聚焦位置处的聚焦分数，并且然后提取具有最佳聚焦分数的位置或者基于样本聚焦位置内插最佳聚焦位置。搜索例程的其他示例包括黄金搜索(Golden Search)方法和布伦特(Brent's)方法。
图7所示的方法700可以被认为是对Z堆栈例程的修改，以利用从相邻视场获得的信息。方法700可以是有用的，例如，在阵列扫描期间，使得搜索限制可以潜在地变窄，以提高自动聚焦的速度或精度或两者。
方法700包括将XY载物台148移动到新的视场，以及将显微镜物镜沿着Z轴移动到可能的聚焦范围的端点(例如，底部或顶部)(702)。在一些示例中，方法700包括基于来自微孔阵列112的至少一个相邻视场的聚焦位置来确定如果可用时可能的聚焦范围(或以其他方式确定样本聚焦位置的数目)。
例如，来自相邻视场的焦点位置通常在阵列扫描的开始时不可用，但通常随着扫描的进行而可用。在一些示例中，方法700包括基于已经在八个相邻视场内确定的任何聚焦位置的平均值，选择沿着Z轴的顶部和底部搜索限制以及样本聚焦位置之间的步长。图7B示出了沿Z轴的样本聚焦位置的范围。
方法700包括使用相机140获取样本聚焦位置处的图像(704)。方法700包括，例如通过以固定步长(诸如28微米)向上移动显微镜物镜，沿着Z轴将显微镜物镜移动到下一样本聚焦位置(706)。在方法700中，包括将图像数据传送到计算机系统102(708)并计算图像的聚焦分数(710)。可以将任何适当类型的定量焦点度量用于焦点分数，例如，可以基于灰度级方差来确定焦点分数。
方法700可任选地包括与将显微镜物镜移动到下一样本聚焦位置并行地计算聚焦分数。如果需要，方法700包括等待(712)两个操作完成。方法700包括确定是否有更多的样本聚焦位置要采样(714)，例如显微镜物镜是否在可能的聚焦范围的顶部(或底部)。如果有更多的样本聚焦位置要采样，则方法700重复成像并计算下一位置的聚焦分数。
方法700包括使用样本焦点的Z位置和样本焦点处的焦点分数内插最佳焦点的Z轴位置(716)。图7C示出了样本聚焦位置(在水平轴上)和聚焦分数(在垂直轴上)的示例曲线图。例如，方法700可以包括提取具有最佳聚焦分数的样本聚焦点(图7C中的Z1，FS1)的Z轴位置和该样本聚焦点的任一侧(沿Z轴)上的两个样本聚焦点(图7C中的Z2，FS2和Z3，FS3)的Z轴位置。然后，可以如下计算内插的Z轴位置(Z焦点)：
符号运算符根据Z2和Z3的Z轴位置之间的差异产生正或负符号，以及Z步长是样本聚焦位置之间的步长。然后，内插的聚焦位置可用于系统100的任何适当成像。
尽管系统100被描述为在每个视场处自动聚焦，但系统100通常可以使用用于聚焦显微镜物镜的任何适当技术。例如，通过将表面拟合到相对于阵列内的(x，y)位置测量的焦平面子集，系统可以在阵列内的任何阵列位置执行焦平面的插值。表面拟合可以基于例如从阵列的物理性质(维数、弹性等)和储层内流体的重量导出的模型。例如，系统100可以使用薄板样条，其：计算表示表面和控制点之间的最小二乘最小化的最小弯曲(即，最小二阶导数)光滑表面；在控制点之间使用径向基函数U(r)＝r2ln(r)；并且使用L-U分解来计算作为(x，y)的函数的表面的二阶多项式权重和一阶系数。
图8是用于识别微孔阵列中单细胞筏的示例方法800的流程图。方法800可以由图1的控制器124执行，并且将相对于图1的系统100进行描述。
方法800包括，对于所选择的细胞筏，提取细胞筏的子图像(802)。方法800包括去除图像的外部边界(例如，通过掩膜)(804)，并将强度阈值(例如，用户指定的阈值)应用于图像以创建二值图像(806)。
方法800包括例如使用任何适当的对象检测算法来识别二值图像内的唯一对象(808)。方法800包括基于尺寸，例如，通过丢弃具有少于阈值数目的像素(例如，10个像素)的所识别的唯一对象，过滤所识别的唯一对象(810)。方法800包括对滤波后的剩余对象进行计数(812)，并且如果仅描绘单细胞，则识别所选择的细胞筏。
方法800可选地包括，如果所选择的细胞筏被标识为单细胞筏，则确定表示在所选择的细胞筏是单细胞筏的确定中的置信度的置信度分数(814)。例如，可以使用所选择的细胞筏的荧光形态进一步处理所选择的细胞筏，以将置信度水平分配给单细胞类别。对于每个候选单细胞筏：
·使用平滑和膨胀过程的组合来识别检测到的荧光对象的灰度图案内的局部最大值：
ο9×9平面结构元素(SE)定义为其原点处为零。
ο使用SE，将灰度膨胀应用于掩模图像(I)：GD＝I SE
ο在结构元素的原点处的零点具有这样的效果，即GD的灰度强度等于在9×9局部区域上I内的最大强度位置处的I的强度。
ο从膨胀图像(GD)中减去掩膜图像(I)：
SI(x,y)＝GD(x,y)-I(x,y)
οSI(x，y)内的元素等于零表示原始掩模图像I(x，y)内的局部极大值。
·分析局部极大值以确定对象对应于单个核的置信度分数。细胞筏以高置信度开始。对于荧光对象的灰度图像内两个检测到的局部极大值的每个组合：
ο将沿着两个局部极大值之间的线的像素强度与它们之间的理论线性梯度进行比较。如果实际强度在直线上的任何一点下降到线性梯度的75％以下，则细胞筏将被减除一个级别(从高到中、从中到低或从低到从候选列表中移除)。如果强度下降到线性梯度的50％以下，则细胞筏将被分为两个等级。(注意：所有已识别的局部极大值组合的缺点都是累积的。)
ο作为对象的圆形度的测量，将两个极大值之间的距离(D)与其从检测到的对象的边缘起的相应距离(DT1，DT2)进行比较(通过应用于阈值图像的补码的距离变换值来测量)。
ο如果2*D＞(DT1+DT2)2，则从单细胞候选列表中删除细胞筏。
在一些示例中，在剔除处理之后剩余的任何细胞筏候选根据它们的置信度被分类，并且在被包括在用于标志物选通的初步单细胞群体中之前基于置信度、尺寸或最大强度可用于过滤。
通常，控制器124可以使用任何适当的图像分析技术来识别单细胞筏。在一些示例中，对于细胞筏的子图像，控制器124可以阈值化该子图像；如果离散对象的数目是阈值化后的一个，则计算阈值化图像的补码的距离变换；创建距离转换的负值；将背景像素设置为-Inf(或其他适当的占位符值)；识别和标记局部极小值，以区分单个细胞和细胞簇；并执行流域变换以绘制细胞周围的边界。
图9是用于选择细胞筏和映射收集板的图形用户界面的示例画面的画面截图，例如，如上参考图3A描述的实时成像模式。图9示出了组合系统控制和样本拍摄的多个元素的示例“成像”画面GUI(例如，来自图1的GUI 126)。用户界面还提供用户界面控件，该用户界面控件允许用户在每个方向上移动视场或通过单次鼠标点击移动到任何位置，以及允许用户调整成像光学器件的焦点或启动自动对焦。用户界面还允许用户打开或关闭明场和红、绿、蓝荧光通道，设置每个荧光通道的曝光时间和增益，设置每个荧光通道的像素组合，并允许用户独立地调整每个活跃成像通道的曝光时间。
如图9所示，用户可以点击或选择任何图像中受关注的筏，检查筏的缩放图像，并选择特定筏进行分离。用户界面向用户指示微孔阵列上当前显示的视场的位置。GUI画面还显示收集板的映射(作为示例显示的96孔格式)，并允许用户将选择用于分离的单细胞筏分配到实验开始时指定的收集板内的特定位置。
使用图9中的显示元素，GUI还可以产生一个画面，用于监视释放和传输过程。GUI画面可以显示选择用于分离的筏的列表，允许用户经由从微孔阵列释放筏来启动分离过程，经由磁棒将筏转移到收集板，并且通过在收集板映射中显示完成时间和每个沉积物来跟踪分离过程的进展。
当在细胞测量图像分析模式下使用系统100时，可以显示包含类似于图9的元素的“成像”标签GUI，允许用户在微孔阵列内导航系统视场并可视化实时图像和像素直方图，以便设置用于在微孔阵列的全自动扫描期间使用的三个荧光成像通道的成像参数。可以显示细胞测量图像分析模式内的“阵列扫描”标签GUI，其允许用户启动微孔阵列的全扫描，跟踪扫描的进展，并且暂停/恢复微孔阵列的全自动扫描。GUI显示阵列中当前视场的位置以及从该视场获取的图像。
图10是图形用户界面的另一个示例画面的画面截图。图10示出了细胞测量图像分析模式中的“细胞选通器”或细胞识别标签GUI。细胞选通器标签GUI允许用户设置参数，通过这些参数分割主成像通道内的荧光对象，以确定阵列内每个筏上的细胞数目。这些控件允许用户设置对象分割的强度阈值，检查设置变化对分割的影响，并在单细胞筏的群体中应用各种滤波器以从群体中进一步筛选候选筏。这些设置可以应用于用于单细胞检测的方法800，使得用户可以以大于95％的效率优化单细胞筏的系统识别。用户界面显示用于“细胞识别”通道的信号直方图，其中X方向表示像素强度，以及Y轴表示给定信号强度下全阵列扫描内的像素数目。用户可以使用鼠标在直方图上设置当前单细胞选通阈值的指示器。
用户界面允许用户将单个细胞选通阈值改变为表示归一化百分位的值，该值计算为在全阵列扫描期间检测到的最小(0％)和最大像素强度(100％)的函数以及阵列上单细胞计数的置信度区间的函数。GUI画面还将向用户指示在微孔阵列的全阵列扫描期间被识别为包含细胞的筏的总数，以及满足用户指定的用于随后分离的阈值参数的单个细胞驻留筏的数目。
用户界面可以在细胞测量图像分析模式内显示“标志物选通器”标签。在完成细胞选通处理之后，用户界面中的附加画面将显示完整微孔阵列的图像，其中突出显示单细胞驻留筏位于的位置以及在阵列上发现的单细胞驻留筏的总数。用户界面画面还可以显示2D直方图，提供表示每个单细胞筏的单点，该单点沿着X轴和Y轴为用户指定的两个细胞测量标志物通道中的每一个绘点。界面还可以提供用户界面控件，该用户界面控件允许用户以任何适当的格式在直方图上应用细胞测量标志物选通器，例如，如上文参考图4D所述。
用户界面还允许用户使用鼠标点击微孔阵列的完整图像内或2D散点图上的单细胞驻留筏的位置，以及在所有活跃荧光通道和明场中查看所选择的单细胞筏的图像。界面还允许用户(例如，在实时成像模式下)随机选择所有活跃荧光通道和明场中的单细胞筏。使用类似于图9所示的板映射显示器的板映射显示器，用户可以将所选择的单细胞筏分配到实验开始时指定的收集板内的特定位置。
本说明书中描述的系统和方法可应用于细胞生物学中的许多问题，其中通过时变荧光特征来监视细胞处理。特异性转基因、siRNA或小分子对细胞增殖或存活的影响可以在模型细胞系统中容易地监测，并且可以分离表现出异常特性的细胞，诸如极端基因表达、细胞增殖或延长存活时间，用于扩增和更详细的研究。在癌症生物学领域，系统还可用于包含不同细胞群体的原发性人类肿瘤，以分离和研究具有独特时间特性的单个细胞。
例如，可以使用细胞测量图像分析模式中固有的功能来完成时间过程分析。在涉及药物或试剂挑战的应用的情况下，为了1)识别阵列内的单细胞筏和2)量化报告荧光成像通道之一内的基线荧光水平的目的，可以在t＝t1-在添加药物或试剂之前执行全阵列扫描。在加入药物或试剂和足够的培养时间之后，可以在t＝t2处执行第二全阵列扫描。系统随后可以通过计算和显示t1和t2之间测量的荧光差并且通过允许用户基于该差创建选通器来实现用于分离的单细胞筏选择。
在两个不同的时间点之间比较荧光值的情况下，该工作流可以进行各种排列。如果两个时间点相隔几分钟或几小时，细胞可能会留在仪器内。如果两个时间点相隔数小时或数天，则可以在成像运行之间从仪器中取出包含细胞的微孔阵列，并将其放置在标准细胞培养箱中。
两点时程分析的另一个应用是在用荧光报告基因进行转染实验期间评估克隆集落增殖。初步扫描将识别克隆集落所需的单细胞筏。二次扫描将允许评估总集落荧光，指示总集落大小和集落内转染的效果。
为了进一步提高时程能力，系统可以在时间t＝t3、t4、…、tN处执行任意数量的附加阵列扫描，量化报告成像通道内的荧光强度，并显示测量的强度相对于时间的曲线图。除了如上所述基于单时间点荧光强度或两个时间点之间的强度变化来创建单细胞筏群体选通器之外，软件还可以使用户能够基于荧光时间曲线的形状来创建选通器。基于曲线形状的选通能力可以使用维数降低、聚类和分类技术来促进，诸如主成分分析、傅立叶变换、小波变换、分层聚类分析或线性判别分析。
虽然荧光强度是单个细胞内分析物丰度的极佳测量，但也有可能利用这种能力来检查给定细胞内分析物的定位。例如，许多膜蛋白是通过内化，通常是通过内吞作用，并转位到其它细胞隔室或细胞器(如细胞核)来响应给定配体或其它刺激。分析显示这种行为的蛋白质不仅需要监测荧光强度，而且需要监测其荧光信号的定位模式的变化。例如，在上述情况下，将蛋白质的质膜连接信号与其核连接信号相比较可提供通过给定路径的整体信号转导的指示。许多类型的分析物可以利用这种方法的优点，包括蛋白质、核酸和细胞器本身，诸如内质网、内体或线粒体。用于这些类型的时程实验的图像分析算法可能采用基于分割的方法，识别对象并将其几何形状输入以预测它们被定位到的细胞隔室的性质，或者允许用户将特定荧光信号归属于给定细胞隔室。
图11A至图11I示出了一个示例实验，其中包括致动器、成像装置和处理器(包括图像处理和分析算法)的自动化计算机控制微孔释放和收集系统与微孔阵列一起用于检查和分离转染的K562细胞(人髓性白血病细胞系)。用含有白血病相关S34F突变的单链寡脱氧核苷酸修复模板以及含有编码Cas9核酸酶的基因、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和设计用于结合U2AF1基因中的特定序列的两种sgRNA之一的质粒，使用标准技术转染细胞。细胞转染后在37℃、含5％CO2的2ml预平衡培养基中培养24小时。然后，将转染的细胞用1μM钙黄绿素AM或细胞示踪器(远红)(CellTracker Deep Red)染色30分钟，按照各自的染色方案洗涤并成像，并接种到微孔阵列上。细胞筏被立即成像以识别具有单个细胞的细胞筏的位置。从随后的分析中排除具有大于一个细胞的细胞筏。然后每12小时对阵列成像一次，直到转染后72小时。
自动化系统的构件，其中大体上类似于图1的系统100的构件。自动系统中的成像装置包括MVX10宏观直立显微镜(Olympus，Center Valley，PA)，该显微镜配有ORCA-Flash4.0 CMOS相机(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)，用于获取明场和荧光图像。平面复消色差物镜(1X，其中数值孔径0.25)与放大率变焦成对，在成像期间实现了宽范围的有效放大率(0.63X至6.3X)。使用PS3H122电动聚焦驱动器和H138A电动XY平移载物台(PriorScientific Inc.，Rockland，MA)使样本和物体移动自动化。λ10-3滤光片转换器定位发射滤光片轮(LB10-NWE)、具有智能快门的激励滤光片轮(LB10-NWIQ)和独立智能快门快门(IQ25-SA)(Sutter Instrument，Novato，CA)。一个滤光片组(89000-ET-Sedat Quad；Chroma Technology Corp，Bellows Falls，VT)具有5个激发带通(350±50nm、402±15nm、490±20nm、555±25nm、645±30nm)和4个发射带通(455±50nm、525±36nm、605±52nm、705±72nm)，允许在蓝色、绿色、红色和远红色波长中进行荧光测量。弧光灯(Lumen 200，PriorScientific Inc.，Rockland，MA)用于照明。所有显微镜装置由MATLAB(Mathworks，Natick，MA)编写的自自定义软件控制，并使用微管理器(Open Imaging，San Francisco，CA)内核。
在不同的时间，获得微孔阵列的明场和荧光图像。在所有实验中，成像视场之间的重叠至少为300μm(细胞筏间距+细胞筏宽度)，以确保完全的图像覆盖。为了识别EGFP-表达K562细胞，首先用细胞示踪器(远红)对细胞进行染色。转染后24h至72h，每隔12h获得阵列的明场和荧光图像。
利用自定义的MATLAB程序对系统中的显微镜进行控制，在指定的时间点自动采集明场和荧光阵列图像，并对图像进行处理和分析。图形用户界面(例如，类似于图1的GUI126)启用了用户输入，包括荧光通道选择、相机曝光时间和微孔阵列几何形状。用户界面还用于指导用户手动定位并聚焦于微孔阵列的四角和中心。将来自每个阵列的5个识别点拟合到薄板样条，以便基于插值平面从基于阵列维数的拟合中预测阵列的每个视场的位置和焦平面。
在所有的放大倍率下，细胞筏在明亮的光场下都具有高对比度的边界。利用明场图像对细胞筏进行分割，并对细胞筏分配阵列定位。对每个明场图像执行平场校正以校正不均匀的照明强度。使用大津法(Otsu's method)对每个明场图像进行阈值分割，并且基于其高于或低于阈值的值将像素分配为1或0。为了去除阵列上的碎片，进一步处理二值图像以填充每个细胞筏边界的内部，并从分析中去除大于1.5倍或小于0.5倍已知细胞筏尺寸的物体。使用该策略，在每个时间点和细胞筏分离之前识别所有细胞筏的位置。通过应用顶帽滤波器从荧光图像中去除背景噪声。然后使用大津法对每个图像进行阈值分割，并将图像转换为二进制。将流域算法应用于二值图像以分离接触的细胞，从而能够对荧光细胞进行计数。综合考虑像素尺寸、阵列成像时间、细胞筏分割精度和细胞识别成功率，对图像采集所需的空间分辨率进行了优化。
自动系统中的释放探针由两个Delrin构件组成：用于小型步进式线性致动器(2010DAM10D2U-K；15mm行程；Portescap，West Chester，PA)的电机外壳和针座。针座有一个透明的聚碳酸酯窗，其中窗上有一个小孔，针可以通过小孔固定。透明的聚碳酸酯窗允许在针头就位的情况下进行明亮的视场显微镜检查。线性致动器由一个自定义MATLAB程序控制，该程序与配备电机屏蔽(Adafruit公司，纽约，NY)的Arduino UNO(Sparkfun电子装置，Boulder，Co)接口。利用MATLAB中编写的定制软件开发了一个自动化机械系统，以在由成像分析软件(例如，类似于图1的系统100)提供目标细胞筏列表时释放单个细胞筏。步进线性致动器控制释放探针的Z位置，释放探针用于刺穿微孔阵列并将细胞筏移出单个微孔。释放探针和电机安装在显微镜载物台下方，与显微镜物镜的光路对准。用户界面使用户能够在细胞筏释放的致动期间选择Z行程距离。根据释放探针在目标位置处刺穿微孔阵列的次数，以94％至100％的效率成功地移除针对自动释放的细胞筏。
自动化系统中的机动磁棒被设计成捕获、转移和沉积超顺磁性细胞筏到收集囊泡中。通过将(直径为3.175mm，长度为25.4mm)圆柱形NdFeB磁体置于(外径为4.76mm，内径为3.18mm，长度为63.5mm)中空聚碳酸酯圆柱体内，制成取回棒。圆柱体两端被阻挡，使磁体能够沿着圆柱体的中心轴线自由移动。使用Delrin构件将取回棒安装到显微镜物镜上，并且其垂直运动由线性致动器(L12-30-50-06-R；Firgelli技术Inc.，Victoria，BC，加拿大，30mm的行程距离)控制。线性执行器由一个自定义的MATLAB程序控制，该程序与装备有电机屏蔽的Arduino UNO接口。为了捕获细胞筏，将磁收集棒放置在离释放的细胞筏2mm内的微孔阵列上方的培养基中。一旦从阵列移除，细胞筏被棒内的圆柱形磁体以及棒尖上的液滴的表面张力保持在棒尖上。细胞筏以100％的效率沉积在96孔板中。
在从阵列中回收细胞筏之前，记录释放针在视场中的位置。还校准了收集棒相对于阵列的X-Y-Z位置及其相对于96孔板中的孔的位置。为了释放细胞筏，通过使用细胞筏释放系统用针刺穿PDMS基板，将选定的细胞筏从微孔阵列中排出。将磁收集棒浸入阵列介质中，吸引释放的磁细胞筏。然后收集棒移动到附近的一个96孔板的孔中并浸入其中，该孔板包含培养基。96孔板下方的NdFeB块磁体(101.6×76.2×6.35mm)将细胞筏吸引到孔中。块磁体也被定位成使得收集棒中的圆柱形磁体被块磁体排斥。
使用自定义的MATLAB程序和用户界面来整合系统的各个构件的动作，允许细胞筏释放探针在成像期间的协调移动、释放筏时的细胞筏收集和显微镜载物台移动，以将收集的细胞筏放置到96孔板中。使用用户界面，用户启动一个细胞筏释放，调整行进距离，直到针刚刚穿过PDMS。用户识别针位置，并且软件存储与XY载物台位置相关的针位置。接下来，GUI允许用户操作XY载物台和细胞筏收集系统，以将棒尖放置到细胞筏阵列的4个角和96孔板的4个角孔中。然后，该信息用于内插每个细胞筏的收集和沉积位置。
使用自动化系统识别单个细胞的细胞筏位置，并跟踪每个细胞的EGFP荧光持续时间和强度。在72小时时段内每12小时检查一次EGFP阳性细胞。在完成成像时程时，通过图像分析软件识别在任何时间点包含EGFP表达细胞的细胞筏。总共220个细胞筏，从在成像时间内含有至少一个荧光细胞的单个细胞开始，对应于1.9％的转染效率。对包含荧光细胞的细胞筏进行了100％灵敏度的识别，并且自动细胞筏系统能够以大于98％的效率释放细胞筏，并且以100％的效率收集细胞筏。将单细胞筏定向释放并收集到96孔板中。对扩增成集落的细胞进行遗传学分析，以确定存在成功的基因编辑。在U2AF1中产生了包含S34F突变的两个K562集落，证明了基于荧光蛋白表达的时间演变对细胞进行分类的能力，并提供了成功基因编辑的选定的细胞和集落。
该自动化系统还用于分析微孔阵列上转染细胞中EGFP表达的时间演变，以及EGFP表达是否存在预测细胞筏分离后细胞是否增殖的可识别趋势。使用成像系统在72小时内获得的每个细胞的平均荧光来将单个细胞筏上的细胞分类为整个持续时间内的低荧光、整个持续时间内的高荧光、低表达后高表达以及高表达后低表达。分离后增殖的细胞随机分布在四组中。分离后增殖组和非增殖组在任何单一时间点的荧光表达均无明显差异，并且微孔阵列上细胞的增殖与细胞筏分离后的增殖无相关性。对EGFP表达时间演变的分析还表明，转染后K562细胞使用72小时表达EGFP。此外，自动化系统允许用户将在微孔阵列中的单细胞筏上随时间取得的表达数据与下游分子分析相关联，在这种情况下，确定从在微孔阵列上测定的单细胞衍生的分离克隆中成功的基因编辑。
图11A示出了用于识别和分离含有转染的K562细胞的细胞筏的图像处理和分析示意图。图11B示出微孔阵列的原始明场图像。图11C示出了施加平场校正后同一微孔阵列的明场图像。图11D示出了校正图像的阈值处理产生了标志物细胞筏边界的二值图像。图11E示出了应用于填充细胞筏和移除任何接触图像边界的细胞筏的形态滤波。图11F示出了两个加载钙黄绿素AM的接触细胞的荧光图像。图11G示出了应用于荧光图像以去除背景噪声的顶帽滤波器。图11H示出了顶帽滤波图像的阈值处理产生了连接两个细胞的二值图像。图11I示出了应用流域算法来分离接触细胞的结果。
在本发明的一个实施例中，包括致动器、成像装置和包括图像处理和分析算法的处理器的自动化的、计算机控制的微孔释放和收集系统与微孔阵列一起用于检查T细胞功能的同时测量和单个T细胞的修复。
使用自动化系统(类似于图1的系统100)在阵列上的功能测定中测量单个T细胞杀伤靶细胞群体的能力，并测量T细胞介导的杀伤或细胞毒性“阵列上”的时间依赖性。该系统还被用于将特定细胞有效地分类到96孔板中，用于克隆群体，该板可用作探针，用于在不同情况下和不同细胞类型下监测抗原呈现。
生成抗流感M1p抗原的人体T细胞培养物。使用分离的外周血单个核细胞，用标准方法获得CD8+细胞。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养是将CD8+T细胞与M1p脉冲DC在CTS AIM V培养基中与添加IL-21的10％人体AB血清(完全培养基，CM)培养。培养3d后，每2d向细胞添加CM和IL-7及IL-15。在含有IL-21、IL-7和IL-15的CM中培养11d后，用M1p脉冲DC重新刺激CTL。培养开始后19d加入IL-2。在培养开始后21d、34d进行重估CTL，培养开始后41d进行等分冻存。冻存的CTL经M1p脉冲DC解冻后进行重估。3d后，用CD8+T细胞分离盒分离CTL，并将其保存在添加IL-7、IL-15和IL-2的CM中。CD8+T细胞于2d～3d后贴壁于微孔阵列上。M1p/HLA-A*02:01四聚体计数显示，48.4％的CD8+T细胞对M1p具有特异性。与用白血病相关抗原PR1脉冲的自体DC相比，大体积培养显示抗原特异性细胞毒性对抗M1p脉冲的自体DC。
用CD34微珠试剂盒超纯(Miltenyi Biotec)从UNC医院造血干细胞实验室获得的冻存白细胞单采物中分离出CD34+细胞，并将其分化为树突状细胞(DC)。CD34+细胞在CTSAIM V培养基中与10％人体AB血清(完全培养基，CM)培养12d，如补充方法中所述，添加GM-CSF、Flt3-Ligand、SCF和IL-4以产生未成熟DC，该未成熟DC被冻存以供将来使用。将未成熟DC与GM-CSF、IL-4和TNF-a培养2d，以及GM-CSF、IL-4、TNF-a、IFN-a和IL-6培养2d，分化为成熟DC。成熟DC与肽(M1p或PR1)共培养至少18h。
微孔阵列用0.1wt％牛明胶包被在PBS中，并以37℃培养大于等于2h，这之后抽吸明胶溶液，并且阵列用PBS洗涤×3后进行细胞电镀。
用于分析的微孔阵列由规则图案(70×70)的细胞筏组成，在细胞筏上培养细胞并通过显微镜进行时间测定。由磁性聚苯乙烯制备的细胞筏具有120μm深度的凹面，增强了在测定设置和性能期间细胞在其表面上的滞留能力。将用M1p或PR1肽脉冲并用Hoechst染料标志物的自体DC(“靶”细胞)接种微孔阵列。将靶细胞以每细胞筏(每阵列147,000个细胞)30个细胞的比例应用于含人体AB血清、青霉素、链霉素和HEPES的无酚红RPMI1640中的阵列。CD8+T细胞用细胞示踪器(远红)标记，并以1:1的细胞/细胞筏比放置在阵列上，以最大化包含单个T细胞的细胞筏的数目。细胞以随机方式落在阵列上，使得阵列上的每个孔中的细胞数遵循泊松分布，这意味着大约1/3的孔(36.8％或1803孔)被预测为具有单个CD8+T细胞，26.4％(1294)被预测为包含大于1个T细胞，并且36.8％(1803)被预测为具有0个T细胞。覆盖阵列的培养基包含Sytox Green，一种膜不渗透的DNA结合染料。
该测定被设计用于识别含有单个T细胞的细胞筏，并且显示出对靶细胞的高细胞毒性，这通过在6小时的时程中增加绿色荧光来证明。由于靶细胞和T细胞都通过微孔阵列施加到培养基上，单个细胞筏可以具有不同的靶细胞和T细胞的数目和比率。图像采集、处理和分析以与上面参照图1的系统100描述的方式类似的方式完成。每隔30分钟获得阵列的荧光图像，持续6小时，同时在装有显微镜的培养箱中测量每个细胞筏的绿色荧光随时间的发展。
以与上面参照图4A至图4E描述的处理类似的方式处理荧光图像。分析荧光图像以确定显示每个荧光团(Hoechst、Sytox Green和细胞示踪器(远红))的细胞的强度、面积、位置和数目。对每幅图像应用顶帽滤波和Otsu阈值处理，以生成微孔阵列上细胞的二值掩模。在每个荧光团创建的掩模内，记录每个细胞筏的强度、位置和像素数。将流域算法应用于远红色通道中的每个图像(对应于用细胞示踪器(远红)染色的细胞)，以对每个细胞筏上的单个细胞的数目计数。
在图像采集的同时，MATLAB程序对采集到的图像进行处理和分析。使用MATLABGUI选择所需的明场和荧光通道组合进行成像。每组图像的处理时间都快于显微镜载物台的移动和图像采集，因此在总扫描时间中没有增加额外的时间。明场图像用于识别单个细胞筏位置。由于PDMS的弹性体性质，需要对图像进行分析，以准确定位细胞筏在阵列上的确切位置。细胞筏分割方法包括背景估计、平场校正、阈值分割和形态滤波。绝大多数细胞筏(99.8±0.8％)被正确识别，而无假阳性(n＝100个图像，每个图像100-121个细胞筏)的情况。
在微孔阵列上进行的分析比较了在含有0或1个CD8+T细胞的细胞筏中绿色荧光随时间的发展。T细胞数为0的细胞筏被认为是对照，并反映了在调查期间自发靶细胞死亡的速率。用于扫描细胞筏的总放大倍数为4倍，导致像素尺寸为1.62μm/像素。之所以选择这种放大倍数，是因为它可以方便地识别单个细胞，同时保持较大的视场，以最小化图像采集时间。在此放大倍数下，每个70×70微孔阵列每通道需要49个图像，图像重叠5％。使用明场(100ms相机曝光)和3个荧光通道(每个通道200ms相机曝光)对单个阵列进行图像采集需要216±4s才能完成(n＝10)。使用自动聚焦算法对每幅图像保持聚焦，并且完成聚焦需要99±2s。所有自动获取的焦平面与手动选择的焦平面(n＝50)相比，在4倍放大倍数(±21.8μm)时，都能精确地在显微镜物镜的景深范围内。获得的总的微孔阵列扫描时间(自动聚焦和图像采集)为315±5s。
利用图像处理和分析软件确定单个细胞筏的位置。用细胞示踪器(远红)荧光法对含有单个CD8+细胞的细胞筏进行了识别。根据Sytox Green荧光强度的增加对这些细胞筏进行分类。明胶包封后，自动识别的细胞筏被重新筛选，以确保单个细胞跟踪示踪器深红色(远红)阳性细胞保留在细胞筏上。
自动化系统和方法能够测量通过荧光显微镜测量的单个细胞的T细胞介导的杀伤率，在每个细胞筏中定量，每个细胞筏被设计为包含荧光标志物的抗原呈递靶细胞的群体和1个CD8+T细胞。这使得在2小时内就能识别出高细胞毒性的CD8+T细胞。通过将每个细胞筏上的Hoechst荧光区域内的Sytox Green像素强度相加来测量细胞毒性或细胞杀伤。使用每个细胞筏上的Hoechst阳性区域作为Sytox Green荧光的掩模，大大减少了由于碎片和细胞及其碎片的崩解而导致的虚假测量。在每个时间点记录每个细胞筏的效应细胞计数和细胞毒性信息，以产生对应于存在的效应细胞的特定数目的细胞毒性的时间痕迹。单个CD8+T细胞的靶细胞死亡率变化很大；然而，单个T细胞在整个实验的时程中保持其细胞毒性率，从而能够快速识别高细胞毒性CD8+T细胞。
细胞毒性测定完成后，阵列上复盖一薄层明胶，如前所述。刚好在阵列的明胶覆盖之前，将显微镜周围的培养箱冷却至24℃。用5wt％的牛明胶代替阵列上的培养基，并将阵列离心。然后将阵列在37℃培养10分钟，抽吸多余的明胶，并且然后在4℃培养5分钟以固化细胞筏内的明胶。将冷却的(4℃)培养基覆盖在阵列上。然后，用浸渍在阵列上方的培养基中的覆盖磁棒容易地捕获具有凝胶封装的细胞的细胞筏(多个)。然后，将具有捕获的细胞筏的棒放置到96孔板的孔中，该孔板由板下的磁体促进，以将细胞筏拉下到孔的底部。
使用针释放装置从阵列中单独释放含有CD8+T细胞且显示高靶细胞死亡率的细胞筏。然后用安装在计算机控制的3轴电机上的磁棒捕获释放的筏，并以与上面参照图1描述的方式类似的方式沉积到96微孔板中。使用耦接到显微镜的针释放装置，将具有高活性CD8+T细胞的细胞筏单独转移到包含饲养细胞的96孔板的孔中。克隆性扩增了3种分类的T细胞。三个克隆均表达M1p/HLA*02:01四聚体的高亲和力T细胞受体。
该方法可用于确定已知对所选靶细胞具有细胞毒性的克隆中T细胞受体(TCR)的序列，并该数据可用于免疫治疗学的发展。TCR是由TCRα链配对TCRβ链组成的异二聚体蛋白复合物，在T细胞表面表达。成对的链以高亲和力结合靶肽/MHC，在这种情况下，靶肽/MHC是M1p/HLA-A*02:01复合物。TCRα和TCRβ链中赋予与靶肽/MHC相互作用特异性的部分称为CDR3区。如果已知TCRα和TCRβ链的CDR3区和侧翼V和J段，则可产生全长转基因TCR构建体并转染原人体T细胞以改变其对靶肽/MHC的特异性。这种方法在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用，其中可以用含有TCRα和TCRβ链序列的转基因TCR转导肿瘤患者的T细胞，该转基因TCR靶向肿瘤特异性肽/MHC复合物。当T细胞疗法被开发用于临床时，在非常短的时间尺度内确定少量效应T细胞活性的能力也可用于免疫监测。这种测定可用于筛选针对多种抗原的抗原特异性的T细胞培养物，以降低在早期T细胞治疗研究中观察到的非靶细胞毒性的风险。此外，阵列几何结构的修改可以容易地被修改以识别稀有的细胞毒性T细胞，这可以使得识别和随后克隆稀有的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞成为可能。这类测定可替代地用于询问同时相互作用的多个细胞群体的效应，诸如研究调查靶细胞对T细胞介导的细胞毒性的抗性或筛选调节T细胞活性的候选药物。
处理器与致动器、相机、电机、磁体和其他构件以及可执行代码一起可以形成用于执行本发明的实施例的各种装置。在一些实施例中，使用诸如DSP、微控制器或微处理器的通用处理器，并且非瞬时固件、软件或微码可以存储在与系统相关联的有形存储装置中。诸如个人计算机、移动计算机或基于嵌入式控制器的系统的自包含计算机可以连接到其它硬件。任何这种功能在本文可以指“处理器”或“微处理器”。存储装置可以是集成到处理器中的存储器，或者可以是由控制器或处理器寻址以执行控制功能的存储器芯片。这种固件、软件或微码可由处理器执行，并且当执行时，使处理器执行其控制功能。这种固件或软件还可以存储在诸如光盘的装置中或装置上，或者存储在诸如连接到细胞分离系统或在细胞分离系统内的盘驱动器的传统的可移动或固定磁介质中。
应当注意，为了开发目的或者为了维护和更新目的，可以将支持本发明的任何实施例的指令的执行所必需的任何软件以及任何数据和信息放置在可移动存储介质中。这种存储装置可以直接访问，也可以通过包括互联网在内的网络访问。
尽管本文已经示出和描述了特定实施例，但是本领域普通技术人员应当理解，被计算以实现相同目的的任何布置都可以代替所示出的特定实施例，并且本发明在其它环境中具有其它应用。本申请旨在覆盖本发明的任何修改或变型。所附权利要求绝不旨在将本发明的范围限制于本文所描述的特定实施例。
