用于文库构建和序列分析的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2017年4月19日提交的美国临时申请序列号62/487,423和于2018月4日提交的美国临时申请序列号62/657,544的优先权权益，所述两个申请的内容通过引用以其整体并入，并适用于所有目的。在某些方面，本公开内容涉及于2017年4月19日提交的美国临时申请序列号62/487,422，其内容通过引用整体并入，并适用于所有目的。
技术领域
本公开内容涉及例如通过多核苷酸测序进行基因和基因组分析的组合物、试剂盒、装置和方法。在特定方面，本文中提供了构建在测序期间具有提高的连接效率和转化率的文库的组合物、试剂盒和方法。在某些实施方案中，本文中的组合物、试剂盒和方法可用于分析多核苷酸片段，例如在受试者体内的循环多核苷酸片段，包括循环的肿瘤DNA。
背景技术
在下面的讨论中，出于背景和介绍目的描述了某些文章和方法。本文中所含的任何内容均不得解释为“承认”现有技术。申请人明确保留在恰当的时候证明此处引用的文章和方法不构成适用法律条文中的现有技术的权利。
尽管最近几年在文库构建方面有了一些改进，但用于下一代测序的文库构建过程仍然效率低下，导致在各个步骤中丢失了许多原始分子。双链连接效率仍然很低，其中～20-30％的分子被正确地连接。另外，在纯化和杂交捕获步骤中损失了许多分子，因此最终转化率约为10-20％。当探询低比例等位基因变体，例如在循环肿瘤DNA(ctDNA)中发现的变体时，灵敏度仍然很低。这限制了调用低等位基因比例突变体时的准确性，因为低效率将导致在查看具有低等位基因比例的文库时灵敏度损失。
需要改进的分析技术来克服现有技术的上述问题。本公开内容解决了这一需求和其他相关需求。
发明内容
本发明内容并不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。根据包括在附图和所附权利要求书中公开的那些方面的具体描述，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用和优点将是显而易见的。
在一个实施方案中，本文中提供了一种方法，其包括将一组接头连接至单链多核苷酸的文库。在一方面，该连接是由单链DNA(ssDNA)连接酶催化的。在另一方面，各单链多核苷酸在5'端被封闭以防止在5'端连接。在另一方面，各接头包含对所述接头所连接的单链多核苷酸进行标记的独特分子标识符(UMI)序列。在另一方面，各接头在3'端被封闭以防止在3'端连接。一方面，接头的5'端与单链多核苷酸的3'端通过ssDNA连接酶连接以形成线性连接产物。在前述实施方案的任一项中，可以得到线性单链连接产物的文库。
在另一个实施方案中，提供了一种方法，该方法包括将一组接头连接至单链多核苷酸的文库，并且在该方法中，该连接由单链DNA(ssDNA)连接酶催化，各单链多核苷酸在5'端被封闭以防止在5'端连接，各接头包含对所述接头所连接的单链多核苷酸进行标记的独特分子标识符(UMI)序列，各接头在3'端被封闭以防止在3'端连接，接头的5'端与单链多核苷酸的3'端通过ssDNA连接酶连接以形成线性连接产物，由此获得线性单链连接产物的文库。
在前述实施方案的任一项中，该方法可以在连接步骤之前还包括从样品获得单链多核苷酸的文库的步骤。一方面，获得步骤包括使来自样品的双链多核苷酸变性。
在前述实施方案的任一项中，样品可以是生物样品。在一些实施方案中，生物样品直接从没有接受任何治疗的受试者获得。在一些实施方案中，生物样品中的多核苷酸尚未进行亚硫酸氢盐转化。在其他实施方案中，生物样品中的多核苷酸已经进行了部分或完全的亚硫酸氢盐转化，在某些方面，生物样品来自患有或怀疑患有疾病或症状例如癌症或肿瘤的受试者。
在前述实施方案的任一项中，单链多核苷酸可以来自包含循环肿瘤DNA(ctDNA)的样品，例如血液、血清、血浆或体液样品或其任何组合。
在前述实施方案的任一项中，单链多核苷酸的长度可在约20至约400个核酸残基之间，例如长度为约80、约100、约120、约140、约160、约180、约200、约220或约240个核酸残基。
在前述实施方案的任一项中，ssDNA连接酶载体是嗜热菌噬菌体RNA连接酶，例如噬菌体TS2126 RNA连接酶(例如，CircLigaseTM和CircLigase IITM)，或古细菌RNA连接酶，例如嗜热甲烷菌RNA连接酶1。在其他方面，ssDNA连接酶是RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶【例如T4 RNA连接酶1(例如New England Biosciences，M0204S)、T4 RNA连接酶2(例如NewEngland Biosciences，M0239S)、T4 RNA连接酶2截短型(例如New England Biosciences，M0242S)、T4 RNA连接酶截短型2KQ(例如M0373S)或T4 RNA连接酶2截短型K227Q(例如NewEngland Biosciences，M0351S)】。在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包含热稳定的5'App DNA/RNA连接酶(例如New England Biosciences，M0319S)，或T4 DNA连接酶(例如New England Biosciences，M0202S)。
在前述实施方案的任一项中，各单链多核苷酸的封闭可包括去磷酸化以防止在其5'端连接。
在前述实施方案的任一项中，各接头的封闭可包括碳间隔、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、己二醇、三甘醇和/或六甘醇，以防止在其3'端连接。
在前述实施方案的任一项中，各接头可在5'端包含二核苷酸序列，例如GA(5'至3')，GG(5'至3')，AA(5'至3')或AG(5'至3')，这对于UMI序列是5'。
在前述实施方案的任一项中，各接头中UMI序列的长度可以在约6至约15个核酸残基之间，例如UMI序列是12聚体。
在前述实施方案的任一项中，连接反应可以在拥挤剂(crowding agent)的存在下进行。一方面，所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG；例如PEG 4000或PEG 6000)、葡聚糖和/或聚蔗糖(Ficoll)。
在前述实施方案的任一项中，所述方法还包括将线性单链连接产物的文库转换成线性双链连接产物的文库。在一方面，该转换使用引物或一组引物，各引物包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列。
在前述实施方案的任一项中，该方法可还以包括扩增和/或纯化线性双链连接产物的文库。一方面，纯化是基于磁珠的。在另一方面，所述纯化基于尺寸选择，例如，所述纯化步骤选择性地纯化长度为约50个核苷酸至约1000个核苷酸之间的多核苷酸，例如长度为约40个核苷酸的接头(和40bp的引物二聚体和/或引物-接头双链体)被除去。另一方面，纯化不包括使用特异性结合对(例如生物素/链霉亲和素)，所述特异性结合对其中的一个附着于线性双链连接产物而另一个附着于固体支持物(例如磁珠)。一方面，纯化是基于柱的，例如通过使用dsDNA或ssDNA纯化柱，例如来自Zymo或Qiagen的那些。
在前述实施方案的任一项中，该方法可还以包括扩增线性双链连接产物的文库，例如通过聚合酶链反应(PCR)，获得包含靶序列的序列信息的线性双链连接产物的扩增文库。在一方面，该方法包括使用引物或一组引物，各引物包含与接头反向互补和/或可与接头杂交的序列。在另一方面，该方法还包括使用可与靶序列(例如EGFR基因序列)杂交的引物。
在前述实施方案的任一项中，本文中的方法可以包括扩增线性双链连接产物的文库，例如通过聚合酶链反应(PCR)，使用各自包含与接头反向互补和/或可与接头杂交的序列的引物或一组引物，可与靶序列(例如，EGFR基因序列)杂交的引物，从而获得包含靶序列的序列信息的线性双链连接产物的扩增文库。
在前述实施方案的任一项中，靶特异性引物可包含选自下列中的任何一个或多个序列：SEQ ID No：4-1529，或其互补或基本上互补的序列。
在前述实施方案的任一项中，可以使用多个引物，其各自包括对靶序列具有特异性的序列，并且所述引物具有相同或不同的靶序列。在一方面，所述多个引物包括SEQ IDNo：4-1529中的任何一个或多个，例如约10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1400、1500个，或全部的1529个，或其互补或基本互补的序列，或其数值范围或子范围。
在前述实施方案的任一项中，靶序列的序列信息可以包括突变、单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)或表观遗传学改变。一方面，突变包括点突变、插入、缺失、倒位、截短、融合、扩增或其任意组合。
在前述实施方案的任一项中，线性双链连接产物的扩增文库可以是全基因组文库以外的文库，例如半靶向基因组文库。
在前述实施方案的任一项中，该方法可还以包括对线性双链连接产物的扩增文库进行纯化。一方面，纯化是基于磁珠的。在另一方面，纯化基于尺寸选择，例如所述纯化步骤选择性地纯化长度大于约150个核苷酸的多核苷酸。另一方面，纯化不包括使用特异性结合对(例如生物素/链霉亲和素)，所述特异性结合对其中的一个附着于线性双链连接产物而另一个附着于固体支持物(例如磁珠)的。一方面，纯化是基于柱的，例如通过使用dsDNA或ssDNA纯化柱，例如来自Zymo或Qiagen的那些。
在前述实施方案的任一项中，该方法可还以包括对纯化的线性双链连接产物的扩增文库进行测序。一方面，测序步骤包括将测序接头和/或样品特异性条形码连接到各线性双链连接产物上。在一个特定方面，使用聚合酶链反应(PCR)进行连接步骤。
在前述实施方案的任一项中，测序的转化率(文库中产生测序读数的单链多核苷酸的百分比)可以为至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
在任何前述实施方式中，所述方法可以用于诊断和/或预后个体的疾病或病况，预测个体对治疗的反应性，鉴别所述疾病/病况或治疗的药物遗传学标志物，和/或从群体中筛选遗传信息。在一个方面，疾病或病况是癌症或肿瘤，并且所述治疗是癌症或肿瘤治疗。
在另一方面，本文中公开了通过前述实施方案中的任一项的方法产生的线性单链连接产物的文库。
在又一方面，本文中公开了通过前述实施方案中的任一项的方法产生的线性双链连接产物的文库。
在另一方面，本文中公开了通过前述实施方案中的任一项的方法产生的线性双链连接产物的扩增文库。
在另一方面，本文公开了一种通过前述实施方案的任一项的方法产生的测序文库。
本文在另一方面公开了一种用于构建连接产物文库的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含单链DNA(ssDNA)连接酶。在另一方面，该试剂盒包括多个接头。在特定方面，各接头被封闭以防止在3'端连接，而接头的5'端可用于连接单链多核苷酸以形成线性单链连接产物。在另一个特定方面，各接头都包含对单链多核苷酸进行标记的独特分子标识符(UMI)序列。
在前述实施方案的任一项中，用于构建连接产物文库的试剂盒可包含ssDNA连接酶和多个接头，并且各接头均被封闭以防止在3'端连接，而接头的5'端可用于与单链多核苷酸连接以形成线性单链连接产物，并且各接头均包含对单链多核苷酸进行标记的UMI序列。
在前述实施方案的任一项中，所述试剂盒进一步包含变性试剂，用于使来自样品的双链多核苷酸变性以获得单链多核苷酸。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可包括嗜热菌噬菌体RNA连接酶，例如噬菌体TS2126 RNA连接酶(例如，CircLigaseTM和CircLigase IITM)，或古细菌RNA连接酶，例如嗜热甲烷菌RNA连接酶1。在前述实施方案的任一项中，试剂盒可包括RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶【例如T4 RNA连接酶1(例如New England Biosciences，M0204S)、T4 RNA连接酶2(例如New England Biosciences，M0239S)、T4 RNA连接酶2截短型(例如New EnglandBiosciences，M0242S)、T4 RNA连接酶2截短型KQ(例如M0373S)、或T4 RNA连接酶2截短型K227Q(例如New England Biosciences，M0351S)】。在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包含热稳定的5'App DNA/RNA连接酶，例如New England Biosciences，M0319S，或T4 DNA连接酶，例如New England Biosciences，M0202S。
在前述实施方案的任一项中，该试剂盒可还包括用于去除单链多核苷酸的5'磷酸基团的去磷酸化试剂。在前述实施方案的任一项中，各接头的封闭可包括碳间隔、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、己二醇、三甘醇和/或六甘醇，以防止在其3'端的连接。在前述试剂盒实施方案的任一项中，各接头可在5'端包含二核苷酸序列，例如GA(5'至3')、GG(5'至3')、AA(5'至3')或AG(5'至3')。在前述实施方案的任一项中，各接头中UMI序列的长度可以在约6至约15个核酸残基之间，例如UMI序列是12聚体。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包括用于连接反应的拥挤剂。在一方面，所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG，例如PEG 4000或PEG 6000)、葡聚糖和/或聚蔗糖(Ficoll)。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包括用于将单链多核苷酸转化为双链多核苷酸的引物或一组引物，各引物包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列。
在前述实施方案的任一项中，该试剂盒可还以包括用于除去引物二聚体和/或引物-接头双链体的试剂。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可包括引物，其包含对靶序列(例如EGFR基因序列)具有特异性的序列，用于获得包含所述靶序列的序列信息的扩增的线性双链连接产物。在前述实施方案的任一项中，所述靶特异性引物可包括选自SEQ ID No：4-1529中的任何一个或多个序列，或其互补或基本互补的序列。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可包括多个引物，其各自包括对靶序列具有特异性的序列，并且所述引物具有相同或不同的靶序列。在一方面，所述多个引物包括SEQID No：4-1529中的任何一个或多个，例如约10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个或全部1529个，或其互补或基本互补的序列，或其数值范围或子范围。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包括测序接头和/或样品特异性条形码，用于对扩增的线性双链连接产物进行测序。
在前述实施方案的任一项中，试剂盒可还包括用于每个组分的单独小瓶和/或使用所述组分的说明书。一方面，说明书包括从包含循环肿瘤DNA(ctDNA)的样品，例如血液、血清、血浆或体液样本或其任意组合中获得单链多核苷酸。
本文还公开了如下的多核苷酸，其包含AGATCGGAAGAGCGTCTCGTGTAGGGAAAGAGTG(SEQ ID NO：1)或其部分，例如包含约18至22个核苷酸残基的部分。
在一方面，本文中公开了如下的多核苷酸，其包含N1...NiAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG或其部分，其中N1至Ni是任何核酸残基，例如A、T、C或G并且i是约4至约25之间的整数。
在另一方面，本文中公开了如下的多核苷酸，其包含GANNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(SEQ ID NO:2)或其部分，例如包含约31至36个核苷酸残基的部分，其中N是任何核酸残基例如A、T、C或G。
在一方面，本文中公开了如下的多核苷酸，其包含CACTCTTTCCCTACACGACGC(SEQID NO:3)或其部分，例如包含约12至20个核苷酸残基的部分。
在另一方面，本文中公开了包含选自SEQ ID NO：4-1529的任何一个或多个序列的引物。在一方面，本文中公开了引物组，其包含SEQ ID NO：4-1529的任何一个或多个，例如约10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1400、1500个或全部1529个，或其互补或基本互补的序列，或其数值范围或子范围。在一方面，本文中公开了引物组，其包含SEQ ID NO：4-1529的任何一个或多个，例如约10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1400、1500个或全部1529个，或其互补或基本互补的序列，或其数值范围或子范围，以及包含CACTCTTTCCCTACACGACGC(SEQ ID NO：3)或其部分的引物。在另一方面，本文中公开了一种试剂盒，其包括SEQ ID NO：4-1529的任何一个或多个，例如约10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1400、1500个或全部1529个，或其互补或基本互补的序列，或其数值范围或子范围，包含CACTCTTTCCCTACACGACGC(SEQ IDNO：3)或其部分的引物，和/或包含AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(SEQ ID NO:1)或其部分的多核苷酸。
附图说明
图1示出了根据本公开内容的一方面的用于构建单链多核苷酸文库并使用该文库进行测序分析的步骤。
图2示出了根据本公开内容的一个方面的包含用于测序的靶分子的构建体。
图3示出了预期等位基因分数和使用本文中公开的方法观察到的等位基因分数之间的线性相关性，表明该方法具有很高的可重复性。
图4使用本文中公开的方法比较了在纠错之前和之后多个变体的等位基因分数。
图5比较了本文中公开的方法和用于文库构建和测序的常规杂交捕获方法的性能参数。
图6比较了本文中公开的方法(TitanSeq)和常规杂交捕获方法的转化率。
图7示出了另外的示例性引物或引物池。
详细说明
在下面的描述中阐述了许多具体细节，以便提供对本公开的透彻理解。提供这些细节是出于示例的目的，并且所要求保护的主题可以根据权利要求来实践，而无需这些特定细节中的一些或全部。应该理解的是，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其它实施方式并且可以进行结构上的改变。应当理解，在一个或多个单独实施方式中描述的各种特征和功能的适用性不限于描述它们的特定实施方式。相反，它们可以被单独地或以某种组合地应用于本公开的一个或多个其它实施方式，而不管是否描述了这样的实施方式，以及这些特征是否被表示为所描述的实施方式的一部分。为了清楚起见，没有详细描述与所要求保护的主题有关的技术领域中已知的技术材料，从而避免使所要求保护的主题模糊。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，以全文引用的方式并入，并适用于所有目的，其程度与每个单独出版物以引用的方式分别并入的程度相同。引用出版物或文档并不意味着承认它们中的任一者是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文档的内容或日期的任何承认。
所有标题都是为了方便读者，除非另有说明，否则不应将其用于限制标题后面的文字的含义。
除非另有说明，否则提供的实施方式的实施将采用常规技术和有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的描述，这些都是本领域技术人员的能力范围内的。这样的常规技术包括多肽和蛋白质的合成和修饰、多核苷酸的合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、杂交的检测以及核苷酸测序。合适的技术的具体说明可参考本文的实例。然而，当然也可以使用其它等效的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如Green等人编,《基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)》(第I-IV卷)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens编,《遗传变异：实验室手册(Genetic Variation:A LaboratoryManual)》(2007)；Dieffenbach,Dveksler编,《(PCR Primer:A Laboratory Manual)》(2003)；Bowtell和Sambrook,《DNA微阵列：分子克隆手册(DNA Microarrays:A MolecularCloning Manual)》(2003)；Mount,《生物信息学：序列与基因组分析(Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis)》(2004)；Sambrook和Russell,《分子克隆的精简方案：实验室手册(Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(2006)；和Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(2002)(均来自冷泉港实验室出版社)；Ausubel等人编,《分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》(1987)；T.Brown编,《基础分子生物学(Essential Molecular Biology)》(1991),IRL Press；Goeddel编,《基因表达技术(Gene Expression Technology)》(1991),Academic Press；A.Bothwell等人编,《真核基因的克隆和分析方法(Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes)》(1990),Bartlett Publ.；M.Kriegler,《基因转移和表达(Gene Transfer andExpression)》(1990),Stockton Press；R.Wu等人编,《重组DNA方法论(Recombinant DNAMethodology)》(1989),Academic Press；M.McPherson等人,《PCR：实用方法(PCR:APractical Approach)》(1991),Oxford University Press的IRL Press；Stryer,《生物化学(Biochemistry)》(第4版)(1995),W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)》(2002),IRL Press,London；Nelson和Cox,Lehninger,《生物化学原理(Principles of Biochemistry)》(2000)第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人,《生物化学(Biochemistry)》(2002)第5版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有这些标准实验室手册以全文引用的方式并入本文中，并适用于所有目的。
A.定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如果本章节中提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中提出的定义相反或以其它方式不一致，则本章节中提出的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
如本文所用，“一个(a/an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。如本文所用，单数形式的“一个”和“所述”包括复数个引用物，除非上下文另外明确指出。
在整个本公开中，以范围格式呈现了所要求保护的主题的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的固定的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值以及所陈述范围内的任何其它指定的值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，但要遵守所陈述范围内的任何明确排除的限制。在陈述的范围包括一个或两个界限的情况下，所要求保护的主题中还包括排除那些包括的界限中的一个或两个的范围。无论范围的广度如何，这都适用。
本文中所提及的“约”某值或参数包括(并描述)指向该值或参数本身的变量。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。另外，在任何数字系列之前使用“约”包括在所述系列中的“约”每个列举的数字。例如，提及“约X、Y或Z”的描述旨在描述“约X、约Y或约Z”。
除非上下文另外明确指出，否则本文所用的术语“平均”是指平均值或中值，或用于近似于平均值或中值的任何值。
如本文所用，“个体”是指可以对其施用或施加所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或生物体的一部分或组分。例如，个体可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。如本文所用，“哺乳动物”是指任何种类的哺乳动物，优选人类(包括人类、人类个体或人类患者)。哺乳动物包括但不限于家畜、竞技动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿动物，例如小鼠和大鼠。
如本文所用，术语“样品”是指因可能含有靶分子而需要对其进行分析的任何物质，包括生物样品。如本文所用，“生物样品”可以指从活的或病毒来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括个体中任何可以从其获得核酸、蛋白质和/或其它大分子的细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。例如，经过扩增的被分离核酸构成生物学样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等、积液、骨髓样品、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液)，鼻、喉或生殖器拭子的提取物，来自消化的组织的细胞悬浮液，或粪便提取物，以及来自动植物的组织和器官样品和由其衍生的经处理的样品。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和其类似物或混合物。所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。其还包括例如通过烷基化和/或通过加帽修饰的多核苷酸，和未修饰形式的多核苷酸。更具体地说，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)；多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的；作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸；以及含有非核苷酸主链的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(“PNA”))和多吗啉代(可作为Neugene商购自Anti-Virals,Inc.,Corvallis,OR)聚合物；以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物以可使碱基配对和堆叠的方式含有核碱基，例如在DNA和RNA中所见。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'-DNA；寡脱氧核糖核苷酸N3'→P5'氨基磷酸酯；2'-O-烷基取代的RNA；DNA与RNA之间或PNA与DNA或RNA之间的杂合体；并且还包括已知类型的修饰，例如标记、烷基化、“帽”、一个或多个核苷酸被类似物取代、核苷酸间修饰(例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯，氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和带正电荷的键(例如，氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的修饰)、含有侧链部分的修饰(例如蛋白质(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))、具有插层(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、具有修饰键(例如α异头核酸等)的修饰以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。核酸通常会含有磷酸二酯键，不过在某些情况下，可能包括核酸类似物，其具有替代主链，例如亚磷酰胺、二硫代磷酸酯或甲基亚磷酰胺键；或肽核酸骨架和键。其它类似物核酸包括具有双环结构的那些，包括锁核酸、正骨架(positive backbones)、非离子骨架和非核糖骨架。可以进行核糖-磷酸骨架的修饰以增加分子的稳定性。例如，PNA:DNA杂合体在某些环境中可以表现出更高的稳定性。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可以包含任何合适的长度，例如至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50，100、200、300、400、500、1,000个或更多个核苷酸。
应当理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已被修饰的其它杂环碱基的那些部分。这样的修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸还可以包括对糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素、脂肪族基团置换，或被官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”旨在涵盖核苷和核苷酸。
术语“互补的”和“基本上互补的”包括在核苷酸或核酸之间，例如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与单链核酸上的引物结合位点之间的杂交或碱基配对或双链体形成。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)或C和G。当一条链的核苷酸进行最佳比对并比较时，两个单链RNA或DNA分子被称为基本上互补，且在有适当的核苷酸插入或缺失的情况下，与另一条链的至少约80％配对，通常至少约90％到约95％，且甚到约98％到约100％。在一个方面，核苷酸的两个互补序列能够杂交，在相对的核苷酸之间的错配优选少于25％、更优选地少于15％、甚至更优选地少于5％、最优选地没有错配。优选地，两个分子将在高严格条件下杂交。
如本文所用，对于参考序列，反向互补序列是呈反向次序的参考序列的互补序列。例如，对于5'-ATCG-3'，互补序列是3'-TAGC-5'，而反向互补序列是5'-CGAT-3'。
如本文所用，“杂交”可以指其中两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。在一个方面，所得的双链多核苷酸可以是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”通常会包括低于约1M、更通常的是低于约500mM且可能低于约200mM的盐浓度。“杂交缓冲液”包括缓冲盐溶液，如5％SSPE或本领域已知的其它此类缓冲液。杂交温度可以低至5℃，但通常大于22℃，且更通常大于约30℃，并且通常超过37℃。杂交通常在严格条件下进行，即，在所述条件下，一个序列将与其靶序列杂交而不会与其它非互补序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下有所不同。例如，更长的片段可能需要比短片段更高的杂交温度才能进行特异性杂交。由于其它因素可能会影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在以及碱基错配的程度，因此参数组合比单独使用任何一个参数的绝对度量值更为重要。通常，在确定的离子强度和pH值下，严格条件的选择应比特定序列的Tm低约5℃。解链温度Tm可以是一群双链核酸分子一半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的几个方程式是本领域众所周知的。如标准参考文献所示，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过方程式Tm＝81.5+0.41(G+C％)计算出Tm值的简单估计值(例如，参见Anderson和Young,《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》中的《定量过滤杂交(Quantitative Filter Hybridization)》(1985))。其它参考文献(例如，Allawi和SantaLucia,Jr.,《生物化学(Biochemistry)》,36:10581-94(1997))包括将结构和环境以及序列特征考虑在内的替代计算方法来计算Tm。
大体上，杂合体的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，然后进行严格性不同但更高的洗涤。示例性的严格条件包括在约7.0到约8.3的pH和至少25℃的温度下至少0.01M至不超过1M的钠离子浓度(或其它盐)的盐浓度。例如，5×SSPE(750mM NaCl、50mM磷酸钠、5mM EDTA，在pH 7.4下)和温度约30℃的条件适用于等位基因特异性杂交，不过合适的温度取决于杂交区域的长度和/或GC含量。在一个方面，用于确定错配百分比的“杂交严格性”可以如下：1)高严格性：0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃；2)中严格性：0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃(也称为中等严格性)；和3)低严格性：1.0×SSPE、0.1％SDS、50℃。应理解，使用其他的缓冲液、盐和温度也可以达到等效的严格性，例如，中等严格性杂交可以是指允许核酸分子(例如探针)结合互补核酸分子的条件，杂交的核酸分子通常具有至少60％的同一性，包括例如至少70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性中的任何一种。中等严格性条件可以是等同于以下的条件：在42℃下在50％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液(Denhardt's solution)、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在42℃下在0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤。高严格性条件可以例如通过以下提供：在42℃下在50％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在65℃下在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤。低严格性杂交可以指等同于以下的条件：在22℃下在10％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液、6×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在37℃下在1×SSPE、0.2％SDS中洗涤。丹哈特氏溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、EDTA)含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M EDTA。其它合适的中等严格性和高严格性杂交缓冲液和条件是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press),Plainview,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,《分子生物学中的简短方案(Short Protocols in Molecular Biology)》,第4版,John Wiley&Sons(1999)。
另外，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补链杂交时，存在实质上的互补。通常，当在一段至少14至25个核苷酸上具有至少约65％的互补性，优选至少约75％，更优选至少约90％的互补性时，将发生选择性杂交。参见M.Kanehisa,《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》12:203(1984)。
本文所用的“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点，并从其3'端沿模板延伸，从而形成经过延伸的双链体。在延伸过程期间添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。引物通常通过聚合酶，例如DNA聚合酶延伸。
“连接”可以指在模板驱动的反应中，在两个或更多个核酸(例如寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之间形成共价键或键联。所述键或键联的本质可以是广泛多样的，而且连接可以是以酶促方式进行的。如本文所用，连接一般以酶促方式进行，以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5'碳与另一个核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯键联。
如本文所用，“扩增”通常是指产生多个拷贝的所需序列的过程。“多个拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”并不一定意味着与模板序列具有完美的序列互补性或一致性。例如，拷贝可以包括在扩增期间出现的核苷酸类似物(例如脱氧肌苷)、有意的序列改变(例如通过包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)和/或序列错误。
“序列测定”等包括测定与核酸的核苷酸碱基序列有关的信息。这样的信息可以包括核酸的部分以及全部序列信息的鉴别或测定。可以以不同程度的统计可靠性或置信度来确定序列信息。在一个方面，所述术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的身份和顺序。
术语“测序”、“高通量测序”或“下一代测序”包括使用以本质上平行的方式测定许多(通常成千上万个)核酸序列的方法进行序列测定，即准备用于测序的DNA模板不是一次一个，而是一次批量处理，并且大量序列优选并行读取，或者使用本身可以并行化的超高通量串行过程读取。这样的方法包括但不限于焦磷酸测序(例如，如由454Life Sciences,Inc.提供，康涅狄格州布兰福德(Branford,CT))；连接法测序(例如，如在SOLiDTM技术中，由Life Technologies,Inc.提供，加利福尼亚卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))；使用修饰的核苷酸边合成边测序(如由以下生产商提供：加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)的Illumina，Inc.的TruSeqTM和HiSeqTM技术；马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA)的HelicosBiosciences Corporation的HeliScopeTM；加利福尼亚门洛帕克(Menlo Park,CA)的Pacific Biosciences of California,Inc.的PacBio RS)；通过离子检测技术测序(例如Ion TorrentTM技术，加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies))；DNA纳米球的测序(Complete Genomics,Inc.，加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA))；基于纳米孔的测序技术(例如，由英国牛津(Oxford,UK)的Oxford Nanopore Technologies,LTD开发)，以及类似的高度并行的测序方法。
“SNP”或“单核苷酸多态性”可以包括个体之间的遗传变异；例如，生物体DNA中的单个含氮碱基位置是可变的。SNP的存在遍及整个基因组；个体之间的许多遗传变异是由于SNP位点的变异，通常这种遗传变异会导致个体之间的表型变异。本公开中使用的SNP和其各自的等位基因可以来自许多来源，例如公共数据库(加州大学圣克鲁兹分校人类基因组浏览器网关(U.C.Santa Cruz Human Genome Browser Gateway)(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)或NCBI dbSNP网站(ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，或可以如美国专利第6,969,589号和标题为“《人类基因组多态性(Human Genomic Polymorphisms)》”的美国公开第2006/0188875号中所述通过实验方式确定。尽管在本文呈现的一些实施方式中描述了SNP的使用，但应当理解，也可以使用其它双等位基因或多等位基因遗传标志物。双等位基因遗传标志物具有两种多态形式或等位基因。如上所述对于与性状相关的双等位基因标志物，与对照组相比在病例组的遗传组成中更丰富的等位基因称为“相关等位基因”，而另一等位基因可以称为“非相关等位基因”。因此，对于与给定性状(例如疾病或药物反应)相关的每个双等位基因多态性，存在相应的相关等位基因。可以与本文提出的方法一起使用的其它双等位基因多态性包括但不限于多核苷酸改变、插入、缺失和易位。
将进一步理解的是，本文中提及的DNA可以包括基因组DNA、线粒体DNA、游离型DNA和/或DNA的衍生物，例如扩增子、RNA转录物、cDNA、DNA类似物等。在关联研究中筛选的多态性基因座可能处于二倍体或单倍体状态，且理想情况下，将来自跨越基因组范围的多个位点。测序技术可以用于SNP测序，例如可以使用BeadArray平台(GOLDENGATETM分析)(Illumina,Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)(参见Fan等人,冷泉港定量生物学研讨会(ColdSpring Symp.Quant.Biol.),68:69-78(2003))。
在一些实施方式中，术语“甲基化状况”或“甲基化状态”是指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列内一个或多个特定CpG甲基化位点(各自具有两个CpG二核苷酸序列)的甲基化状态包括“未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。术语“半-甲基化”或“半甲基化”是指其中仅一条链被甲基化的双链DNA的甲基化状态。术语“高甲基化”是指受测DNA样品的DNA序列中这样的一种平均甲基化状态，其对应于在一个或多个CpG二核苷酸处相对于在正常对照DNA样品中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的量增加。术语“低甲基化”是指受测DNA样品的DNA序列中这样的一种平均甲基化状态，其对应于在一个或多个CpG二核苷酸处相对于在正常对照DNA样品中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的量减少。
本文中的“多重”或“多重分析”可以指其中可以通过使用多于一种标志物同时分析多个靶(例如多个核酸序列的存在和/或量)的分析或其它分析方法，所述多于一种标志物各自具有至少一种不同的检测特征，例如荧光特征(例如激发波长、发射波长、发射强度、FWHM(半峰全宽)或荧光寿命)或独特的核酸或蛋白质序列特征。
如本文所用，“疾病或病况”是指生物体中由例如感染或遗传缺陷引起的病理状况，并以可识别的症状为特征。
B.通过文库构建和多核苷酸测序进行多核苷酸片段分析的概述。
在一方面，本方法的靶(或模板)多核苷酸是片段化的多核苷酸，例如，范围从约100个残基到约1000个残基，并且在一些实施方案中，范围从约150个残基到约400个残基。
靶DNA或模板DNA可以包括常规的基因组DNA、染色体DNA、染色体外DNA(如线粒体DNA)或其片段。在其他实施方案中，靶DNA或模板DNA是加工过的DNA，例如经过酶消化、交联、化学或物理剪切、亚硫酸氢盐转化和/或降解的DNA。
亚硫酸氢盐转化是一种使用亚硫酸氢盐确定DNA甲基化模式的方法。DNA甲基化是一种生化过程，涉及在胞嘧啶或腺嘌呤DNA核苷酸上添加一个甲基。当细胞分裂并从胚胎干细胞分化成特定组织时，DNA甲基化稳定地改变细胞中基因的表达。在亚硫酸氢盐转化中，靶核酸首先用亚硫酸氢盐试剂处理，所述处理可将未甲基化的胞嘧啶特异性转化为尿嘧啶，而对甲基化的胞嘧啶没有影响。亚硫酸氢盐转化的一个结果是原始靶标的双链构象由于丧失序列互补性而被破坏。在样品制备以及分析或诊断测试期间，靶序列以两个独立的单链DNA的形式存在。靶核酸序列也经常以非常低的浓度存在。这对于循环肿瘤DNA(也称为“无细胞肿瘤DNA”或“ctDNA”)而言是一个特别重要的考虑因素，因为其在循环中的浓度通常很低且变体等位基因分数也很低。
在一些实施方式中，本文公开的所关注的核酸分子是无细胞DNA，例如无细胞的胎儿DNA(也称为“cfDNA”)或ctDNA。cfDNA在怀孕母亲的体内(例如血液中)循环并代表胎儿基因组，而ctDNA在癌症患者的体内(例如血液中)循环，并且通常是预先片段化的。在其它实施方式中，本文公开的所关注的核酸分子是古老的和/或受损的DNA，例如归因于储存在破坏性条件下，例如在福尔马林固定的样品或部分消化的样品中的。
随着癌细胞的死亡，它们将DNA释放到血液中。这种DNA被称为ctDNA，是高度片段化的，平均长度约为150个碱基对。一旦去除了白细胞，ctDNA通常仅占剩余血浆DNA的很小一部分，例如，ctDNA可能构成血浆DNA的不到约10％。通常，此百分比小于约1％，例如小于约0.5％或小于约0.01％。另外，血浆DNA的总量通常非常低，例如约10ng/mL血浆。
ctDNA中的变体可以使用包括下一代测序在内的多种方法进行探询。由于ctDNA对血浆DNA的比例低，由于PCR和测序错误，很难以高置信度调用变体。独特分子标识符(UMI)通常用于标记原始分子，这样看到的任何变体都可以与共有序列相比较。这是区分真假阳性的有效方法。如果该变体与共有序列相匹配，则它是真正的阳性。否则，将其从分析中删除。此外，将高百分比的原始分子转化为测序文库至关重要，以保持高灵敏度，即，不会因丢失而遗漏变体。因此，连接效率在文库构建中极为重要。
一方面，本文提供了一种在保持靶向基因组的选定区域的同时大大提高连接效率的技术。在一个实施方案中，首先将要通过测序检测的多核苷酸例如ctDNA去磷酸化以除去5'磷酸，以防止ctDNA与其自身连接。然后将ctDNA变性，使所有DNA均为单链。CrrcligaseTM是一种单链DNA连接酶，用于将接头连接到ctDNA的3'端。一方面，接头在5'端包含2个特异性碱基以优化连接效率，其后包含UMI。一方面，接头的3'端包含碳间隔，以防止接头自连接。在另一方面，使用拥挤剂例如PEG 4000进一步优化连接反应。在一方面，在连接之后，使用与接头反向互补的引物使分子成为双链。这样可以在标准纯化时有效除去多余的未连接的接头而不会除去可用的DNA。
一方面，所述DNA随后用半靶向PCR扩增。一个引物与接头反向互补，而另一个(例如，作为引物池中的一种引物)退火至基因组的特定靶区域。设计特异性引物以将引物-二聚体相互作用和脱靶退火最小化。一方面，靶标特异性引物被进一步优化，以凭借其小的DNA尺寸着落于特定变体附近。再次纯化后，进行PCR添加全长的测序接头和条形码。然后，例如在Illumina机器上对最终的文库进行测序。
一方面，尽管具有相对较小的～30,000bp的靶区域，但半靶向PCR使得原始分子集富集了＞约40,000倍。一方面，本方法的总转化率至少为60％，这意味着与标准文库构建和杂交捕获相比，至少约3倍多的原始分子被转化为可测序材料。在其他实施方案中，总转化率在约60％至约70％之间，在约70％至约80％之间，在约80％至约90％之间，或超过90％。一方面，本发明的方法因此能够以极低的突变等位基因分数，例如低至0.01％，准确地调用基因或基因组变体，例如SNV、插入缺失、CNV和融合。在其他方面，基因或基因组变体的等位基因分数为约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％或约2％。
以下各节更详细地描述了本方法的某些步骤。
C.单链多核苷酸文库及其构建方法。
用于例如针对ctDNA的下一代测序的文库构建通常由几个步骤组成，包括末端修复，A-加尾和接头分子的双链连接。然后可以使用杂交捕获将这些连接的分子在某些基因组区域富集1000-2000倍。尽管在过去的几年中文库构建有了一些改进，但该过程仍然效率低下，导致在各个步骤中丢失了许多原始分子。双链连接效率仍然很低，大约～20-30％的分子被正确连接。另外，在纯化和杂交捕获步骤中丢失了许多分子，因此最终转化率接近10-20％。当探询ctDNA中发现的低比例等位基因变体时，灵敏度仍然很低。这限制了调用低等位基因分数突变体时的准确性，因为低效率将导致在查看低等位基因分数的文库时灵敏度下降。
另外，某些多核苷酸如ctDNA的尺寸小，阻止了基于片段的文库构建的使用。例如，多核苷酸首先被标记(例如，用生物素)以产生靶向文库，然后通过捕获标签(例如，通过链霉亲和素)富集。这样，目标区域的文库可以富集约1000-2000倍。最后，进行PCR以扩增和标引用于测序的分子。但是，基于PCR的方法被证明很难将UMI添加到原始分子中并导致较高的错误率。
一方面，本文所述的组合物、试剂盒和方法解决了上述问题。在一些实施方案中，所述组合物、试剂盒和方法可用于对核酸分子进行测序，包括但不限于各种文库的构建、各种扩增反应(例如通过PGR和/或引物延伸)、构建文库的纯化以及测序读数的分析。
在某些方面，可以例如从含有片段化的多核苷酸(例如片段DNA)的样品制备测序文库。一方面，样品是例如直接从受试者获得的天然样品，例如组织液或体液，包括但不限于血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、痰、泪液、粘液或羊水。在其他方面，可通过形成DNA的片段(例如，通过剪切DNA)并将本文的接头连接至所述DNA片段来制备测序文库。在特定的实施方案中，片段化的多核苷酸和接头是单链的。
有时将这些片段(例如ctDNA或通过将更长的DNA链片段化而形成的片段)称为“插入序列”，因为它们能够被“插入”或“连接”到与本文中公开的接头(如单链接头)相邻的位置。RNA分子也可以被测序，例如通过反转录RNA分子以形成连接至接头的DNA分子。
在一个方面，提供了一种方法，该方法包括将一组接头连接至单链多核苷酸的文库，并且在该方法中，所述连接由单链DNA(ssDNA)连接酶催化。如本文所用，ssDNA连接酶能够在不存在互补序列的情况下连接ssDNA的末端。例如，CircLigaseTM ssDNA连接酶和CircLigaseTM II ssDNA连接酶都是热稳定的连接酶，其通常用于催化具有5'-磷酸基团和3'-羟基的ssDNA模板的分子内连接(即环化)。不同于T4 DNA连接酶和
CircLigaseTM ssDNA连接酶或CircLigaseTM II ssDNA连接酶均可用于本公开内容。两种酶的不同之处在于，CircLigase I的腺苷酸化程度远比CircLigase II小，并且需要ATP才能发挥最佳活性。CircLigase I在ATP存在下重新环化ssDNA。CircLigase II几乎被100％腺苷酸化，因此无需在反应缓冲液中添加ATP。CircLigase II是一种化学计量反应，其中该酶在其活性位点结合腺苷酸化的寡核苷酸的5'-末端，然后连接该寡核苷酸并终止。由于该反应不含ATP，因此CircLigase II以酶:寡核苷酸为1:1的配置起作用。环化完成后，环化的ssDNA从活性位点释放且反应停止。也可以使用其他合适的ssDNA连接酶。例如，可以使用热稳定的5'App DNA/RNA连接酶(例如New England Biosciences，M0319S)，或T4DNA连接酶(例如New England Biosciences，M0202S)，或T4 RNA连接酶【例如T4 RNA连接酶I(例如New England Biosciences，M0204S)，T4 RNA连接酶2(例如New EnglandBiosciences，M0239S)，T4 RNA连接酶2截短型(例如New England Biosciences，M0242S)，T4 RNA连接酶2截短型KQ(例如M0373S)，或T4 RNA连接酶2截短型K227Q(例如New EnglandBiosciences，M0351S)】。
一方面，各单链多核苷酸在5'端被封闭以防止在5'端连接，各接头均包含对所述接头所连接的单链多核苷酸进行标记的独特分子标识符(UMI)序列，各接头在3'末端被封闭以防止在3'末端连接，并且该接头的5'末端通过ssDNA连接酶连接到单链多核苷酸的3'端以形成线性连接产物，由此获得线性单链连接产物的文库。不依赖模板的单链DNA环化描述于WO2010/094040A1中，其公开内容整体并入本文中，但是WO2010/094040A1仅公开了单链多核苷酸的分子内连接(例如环化)。
因此，本方法以非常规的方式使用ssDNA连接酶，例如CircLigase或CircLigaseII。本发明的连接方法旨在在单链靶多核苷酸和接头分子之间产生线性连接产物，而不是环化。一方面，本公开内容使用ssDNA连接酶进行分子内连接，例如将接头连接至单链多核苷酸。为此，一方面，单链多核苷酸在5'端被封闭以防止环化。这样，可以防止ssDNA的3'端与其自身5'端的分子内连接以及ssDNA的3'端与同一文库中的另一ssDNA的5'端的分子间连接。因此，一方面，在连接反应期间，既防止了单链多核苷酸的环化，又防止了线性多连体(包含单链多核苷酸和/或接头)的形成。如图1所示，所述各单链多核苷酸的封闭可包括在其5'末端去磷酸化以防止在该末端的连接。
在另一方面，各接头在3'端封闭以防止在3'端连接。这样，防止了接头的3'端与其自身的5'端的分子内连接以及一个接头分子的3'端与另一接头分子的5'端的分子间连接。各接头的封闭可包括碳间隔、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、己二醇、三甘醇(TEG)和/或六甘醇，以防止在其3'端连接。因此，一方面，在连接反应过程中既防止了单链接头的环化，也防止了线性多连体(包含单链多核苷酸和/或接头)的形成。
接头可以以任何合适的组合包括一个或多个间隔子的一个或多个拷贝。例如，Gansauge和Meyer公开了包含十个C3间隔子拷贝和生物素化TEG间隔子的接头。Gansauge和Meyer(2013)，“Single-stranded DNA library preparation for the sequencing ofancient or damaged DNA”，Nature Protocols，8(4):737-48，通过引用将其全文并入本文。然而，该参考文献要求在连接后立即通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用捕获已连接的ssDNA。此步骤可能会导致文库中的ssDNA分子大量损失。该文献然后将捕获的ssDNA转换为dsDNA，而所述ssDNA仍捕获在磁珠上。
如图1所示，本公开内容不需要在连接后立即捕获连接的ssDNA。相反，当将连接的ssDNA转化为dsDNA时，其仍保留在连接反应体系中。
一方面，文库中ssDNA的连接效率很高，例如样品中至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的单链多核苷酸连接至接头。在特定实施方案中，连接效率为约80％。即便具有这样大大提高的连接效率，目前要求保护的方法仍然能够靶向基因组的选定区域，下边将会解释。
一方面，接头具有以下结构：/5'Phos/N1N2...Ni-UMI-M1M2...Mj-封闭剂，其中“5'Phos”代表5'磷酸基团，“N1N2...Ni”表示从5'端到UMI序列的序列，“M1M2...Mj”代表从3'端到UMI序列的序列，“封闭剂”指示接头的3'端被封闭以防止与其连接。i和j都是整数，其中i可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30；并且j可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或大于50。在特定实施方案中，i可以是2。在一些实施方案中，在N1N2...Ni的5'端的二核苷酸序列N1N2可以是GA(5'至3')、GG(5'至3')、AA(5'至3')或AG(5'至3')，以提高连接效率。
一方面，M1M2...Mj序列的一部分或全部在后续步骤中用于设计反向互补序列，所述反向互补序列可用作引物以将连接的单链多核苷酸转化成双链多核苷酸，和/或用于半靶向PCR来扩增选定的靶序列(引物对中的另一个引物是靶特异性引物)。在一方面，M1M2...Mj序列包含AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(SEQ ID NO:1)或其包含约18至22个核苷酸残基的部分。
在另一方面，“封闭剂”包含碳间隔、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、己二醇、三甘醇(TEG)和/或六甘醇，所述封闭剂包含一个或多个封闭基团的一个或多个拷贝，在5’至3’方向上以任何合适的组合和顺序排列。
一方面，使用UMI有助于确定、选择和/或分离靶序列的无错测序读数，并且测序读数能够以高精度和高通量加以选择。这种经过验证的无错测序读数可用于需要序列保真度的任何技术中以防止方法学上的偏差，所述技术包括已知序列的较大分子的构建、多态性和/或突变筛选、大规模并行测序以及定量方法。
一方面，独特分子标识符与连接的构建体结合并唯一确定该连接的构建体，所述连接的构建体包含单链靶多核苷酸和接头。换句话说，可以将具有相同序列的两个单链靶多核苷酸连接至两个不同的接头，其UMI序列是彼此不同的；这样获得的连接产物是不同的，并且每个连接产物(而不是具有相同序列的靶多核苷酸)都由UMI唯一确定。在另一方面，当将单链连接产物转化成双链多核苷酸并扩增时，即使可使用非常高保真度的聚合酶，也可能在重复复制期间引入扩增错误。结果，即使是较低的错误率也可能具有显著影响，尤其是在大型文库的构建中。尽管大规模并行测序在成本和通量方面均具有优势，但读数的准确性可能受到扩增和/或检测技术的限制。
通过使用UMI，本方法能够识别无错误的扩增产物和/或测序读数，并从分析中排除具有技术错误的那些。具有相同UMI的扩增产物和/或测序读数可以被确认为相关(血统上相同)，因此具有相同UMI的分子之间的序列差异可以被识别为技术错误，而不是序列中的实际差异(例如，野生型序列与癌症相关突变序列之间的差异)。换句话说，由于每个单链连接产物均可以通过其UMI进行唯一确定，因此如果没有技术错误的引入，其所有后代(由于扩增和/或测序)都应具有相同的靶序列。但是，如果在扩增和/或测序过程中在靶序列中引入了例如单核苷酸插入的错误，则血统上相同(例如，具有相同的UMI)的某些扩增产物和/或测序读数将具有插入而其他则不会。具有插入的产物与不具有插入的产物之间的确切比例会有不同，这取决于扩增和/或测序过程中何时发生错误。通常，当使用非常高保真度的聚合酶时，没有错误的产物将占大多数。在另一方面，因为可以鉴定血统上相同的扩增产物和/或测序读数，所以可以使用来自多个分子的数据确定共有序列，从而实现高通量测序的高精度。
一方面，UMI是简并的核酸序列，并且UMI中的核苷酸数目是这样设计的：它使得潜在和实际由UMI序列表示的序列的数目大于初始库中靶标单链靶多核苷酸的总数。一方面，可以通过使用序列的简并集合来提供UMI序列多样性(或对于每个单个UMI序列来说的“独特性”)，所述序列是通过用全部四种碱基的混合物在每个位置上合成而随机产生的。或者，可以合成一组不同但预先确定的序列并将其连接至初始的单链多核苷酸文库。UMI集合的多样性必须足够，这样才能确保不会将血统上无关的分子弄错。一方面，“独特的”分子标识符不必是绝对唯一的，并且可以在不同的靶标单链多核苷酸上使用，只要清楚它们是不同的并且不会被误认为是血统上相同的分子即可。大量的UMI序列可以由核苷酸的随机装配产生，这为唯一确定每个单独的连接产物提供了高可能性。例如，如果UMI在各位置上包含由A、C、G和T的混合物合成的12聚体，则有412种可能的序列。如果UMI在各位置包含由A、C、G和T的混合物合成的20聚体，则有420个(约1012个)可能的序列。这种随机标识符的使用使得大文库成为可能，这种大文库中的单链靶多核苷酸能够彼此相互区分。
在特定方面，UMI是5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体、25聚体或更长的简并序列。一方面，接头具有以下结构：/5'Phos/GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG/3SpC3/，其中“NNNNNNNNNNNN”代表12聚体UMI序列，而“3SpC3”代表3'碳间隔。GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG的序列为SEQID NO：2。
通过添加缩合剂例如己胺钴和生物型多胺例如亚精胺，或者通过使用拥挤剂例如聚乙二醇(PEG)，能够人工增加DNA的浓度，使用拥挤剂还增加有效的酶浓度。一方面，添加剂如己胺钴可仅产生分子间反应，从而产生线性连接产物而不是环状产物。因此，在单链靶多核苷酸的5'端和单链接头的3'端可能没有被完全封闭以防止连接的情况下，可以使用例如己胺钴的添加剂来增强分子间反应并进一步防止单链靶多核苷酸和/或接头的环化。
在一些实施方案中，可以在同一连接反应中使用超过一种的接头构造。例如，可以使用如下的两种接头构造：
构造No.1:/5'Phos/N1N2...Ni-UMI1-M1M2...Mj-封闭剂1和
构造No.2:/5'Phos/P1P2...Pk-UMI2-Q1Q2...Ql-封闭剂2。
N1N2...Ni和P1P2...Pk可以相同或不同，UMI1和UMI2可以相同或不同，M1M2...Mj和Q1Q2...Ql可以相同或不同，并且封闭剂1和封闭剂2可以相同或不同。在一个实施方案中，UMI1不同于UMI2(例如，UMI1是12聚体简并序列，而UMI2是13聚体简并序列)，而接头的其他特征是相同的。在另一个实施例中，N1N2...Ni与P1P2...Pk不同(例如，一个是AG，另一个是GA)，而接头的其他特征相同。在又一个实施例中，M1M2...Mj不同于Q1Q2...Ql，而接头的其他特征是相同的。在又一个实施例中，封闭剂1和封闭剂2不同，而接头的其他特征相同。
连接反应后，无需纯化(例如，将连接产物与过量的未连接的接头分子分离)，单链连接产物可以立即转化为双链连接产物。另外，单链靶多核苷酸和接头都不需要为了随后将连接产物转化成双链多核苷酸和/或扩增步骤而捕获在固体支持物上(例如，通过生物素-链霉抗生物素蛋白介导而与磁珠结合)。因此，本发明的方法避免和/或减少了由于单链连接产物的纯化或分离而导致在DNA样品如ctDNA中已经很小的等位基因分数的突变体的损失。相反，一方面，单链连接产物保留在将进行引物延伸的溶液中。
D.单链多核苷酸文库向双链多核苷酸文库的转化。
在图1所示的一方面，在构建包含单链连接产物的文库之后，该方法可还包括将线性单链连接产物的文库转化为线性双链连接产物的文库。一方面，该转化使用引物或一组引物，各引物包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列。
对于具有以下结构的接头：/5'Phos/N1N2...Ni-UMI-M1M2...Mj-封闭剂，引物可以包含与M1M2...Mj反向互补和/或可与其杂交的序列。在此实例中，当引物与结构为ssDNA-N1N2...Ni-UMI-M1M2...Mj-封闭剂的连接产物杂交时，引物延伸反应可将ssDNA-N1N2...Ni-UMI序列(和任选地，M1M2...Mj序列的全部或一部分)转化为双链多核苷酸。在一个特定实例中，反向互补引物包括SEQ ID NO：3中所示的序列：CACTCTTTCCCTACACGACGC(5'至3')。
在一些实施方案中，引物可能不是M1M2...Mj或其部分的完美反向互补；尽管如此，该引物在严格条件下仍可与M1M2...Mj(由此与接头连接的ssDNA)杂交。
在前述实施方案的任一项中，该方法可还包括扩增和/或纯化线性双链连接产物的文库。一方面，双链连接产物经纯化和尺寸选择以除去未结合的接头分子和/或未结合的引物，和/或在接头及其反向互补引物之间形成的复合物。可以使用任何合适的方法来除去通常比所需的双链连接产物短的这些片段。例如，使用Qiagen的PCR纯化柱可以帮助清除样品中较小的片段，在2％认证的低量程超琼脂糖凝胶(certified low range ultraagarose gel)上运行柱纯化的样品可以帮助选择所需的片段大小。包括AMPure法在内的基于磁珠的DNA纯化也有助于除去较小的片段。在一些实施方案中，所需的双链连接产物的尺寸为约100bp至约600bp、例如约100bp至约400bp、约150bp至约200bp、约200bp至约250bp、和250bp至约300bp。在一个实施方案中，例如通过对悬浮在Tri-EDTA缓冲液中的磁珠进行洗脱来纯化和收集dsDNA(>150bp且<400bp)。
一方面，纯化是基于磁珠的。在另一方面，纯化基于尺寸选择，例如，纯化步骤选择性地纯化长度为约50个核苷酸至约1000个核苷酸之间的多核苷酸，例如除去长度为约40个核苷酸的接头(以及约40bp的引物二聚体和/或引物-接头双链体)。一方面，纯化是基于柱的，例如通过使用dsDNA或ssDNA纯化柱，例如来自Zymo或Qiagen的那些。
在另一方面，纯化不包括使用特异性结合对(例如生物素/链霉亲和素)，所述特异性结合对的其中一个连接到线性双链连接产物上，而另一个连接到固体支持物(例如磁珠)上。
在前述实施方案的任一项中，本文的方法可还包括扩增线性双链连接产物的文库，通过聚合酶链反应(PCR)，来获得包含靶序列的序列信息的线性双链连接产物的扩增文库。该扩增可以是无偏扩增，例如通过将通用接头对连接至双链连接产物的末端，并用通用引物对扩增所有标记的双链连接产物。在其他实施方案中，进行半靶向扩增，以代替无偏扩增或作为无偏扩增的补充。半靶向扩增可以在无偏扩增之前或之后进行。
E.双链多核苷酸文库的半靶向扩增。
在图1所示的一方面，双链连接产物文库的半靶向扩增包括使用包含与接头子反向互补和/或可与其杂交的序列的引物，和可与靶序列(例如EGFR基因序列)杂交的引物，或可与相同靶序列或多个靶序列杂交的引物。
对于具有以下结构的接头：/5'Phos/N1N2...Ni-UMI-M1M2...Mj-封闭剂，所述引物可以包含与M1M2...Mj反向互补和/或可与其杂交的序列。这样，当所述引物与dsDNA的一条链杂交，而所述靶标特异性引物与dsDNA的另一条链杂交时，PCR产物将包含靶序列以及N1N2...Ni-UMl序列(和任选地，M1M2...Mj序列的全部或一部分)。在一个具体实例中，反向互补引物包含SEQ ID NO:3中所示的序列：CACTCTTTCCCTACACGACGC(5'至3')。
一方面，可以使用多个靶标特异性引物，其各自包含对相同或不同靶标序列具有特异性的序列。换句话说，引物可以具有相同或不同的靶序列。在一些实施方案中，靶标特异性引物池包含约5、约10、约25、约50、约100、约150、约200、约250、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、大约1000或大于大约1000个不同的引物，例如大约104个、大约105个、大约106个或更多个引物。在其他实施例中，所述池包括约20至约60、约60至约100、约100至约140、约140至约180、约180至约220、约220至约260、约260至约300个、约300至约350个或约350至约400个不同的引物。一方面，靶标特异性引物池与一个共同的反向互补引物一起使用，其中所述共同反向互补引物与池中的每个单独的靶标特异性引物形成引物对，以在引物之间以半靶向的方式扩增靶序列。因此，在这个方面，半靶向扩增不是全基因组扩增。
由于ctDNA随机片段化，一方面，靶特异性引物的引物位置可能很重要。例如，如果引物着落(primer landing)跨越断裂点，则可能导致较低的转化率。更大的靶特异性引物池和/或对同一靶序列使用多个部分重叠的引物可以解决该问题。
一方面，靶序列的序列信息可包括突变、单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)或表观遗传改变。在一方面，该突变包括点突变、插入、缺失、倒位、截短、融合、扩增或其任何组合。
在一些实施方案中，线性双链连接产物的扩增文库可以是除全基因组文库之外的文库，例如半靶向基因组文库。
在一些实施方案中，该方法可还包括对线性双链连接产物的扩增文库进行纯化。可以使用任何合适的方法来除去包括引物二聚体的较小片段。例如，使用来自Qiagen的PCR纯化柱可以帮助清除来自样品的较小片段，将柱纯化的样品在2％认证的低量程超琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳可以帮助选择所需的片段尺寸。包括AMPure法的基于磁珠的DNA纯化也有助于除去较小的片段。在一些实施方案中，扩增产物的大小为约100bp至约600bp、例如约100bp至约400bp、约150bp至约200bp、约200bp至约250bp和250bp至约300bp。在一个实施方案中，例如通过对悬浮在Tri-EDTA缓冲液中的磁珠进行洗脱来纯化和收集dsDNA(>150bp且<400bp)。
一方面，纯化是基于磁珠的。在另一方面，纯化基于尺寸选择，例如，纯化步骤选择性地纯化长度大于约150个核苷酸的多核苷酸。在另一方面，纯化不包括使用特异性结合对(例如生物素/链霉亲和素)，所述特异性结合对其中一个连接到线性双链连接产物上，而另一个结合到固体支持物(例如磁珠)上。一方面，纯化是基于柱的，例如通过使用dsDNA或ssDNA纯化柱，例如来自Zymo或Qiagen的那些。
F.序列文库的构建和测序读数的分析。
一方面，该方法进一步包括对线性双链连接产物的纯化的扩增文库进行测序。一方面，测序步骤包括将测序接头和/或样品特异性条形码连接到各线性双链连接产物。在一个特定方面，使用聚合酶链反应(PCR)进行连接步骤。
图2显示了包含用于测序的靶分子的构建体的示例性构造。对于Illumina测序，这些构建体在每一端均具有流通池(flow cell)结合位点P5和P7，这些位点可使文库片段附着至流通池表面。单链文库片段的P5和P7区退火至在流通池表面的它们的互补寡核苷酸。流通池寡核苷酸充当引物，并合成与文库片段互补的链。然后，原始链被洗掉，留下以混合方向共价结合到流通池表面的片段拷贝。然后通过桥式扩增产生每个片段的拷贝，产生簇。然后，切割P5区，产生仅包含由P7区连接的片段的簇。这样可以确保所有拷贝都按相同方向排序。测序引物退火至片段的P5末端，并开始边合成边测序过程。当样品带有条形码时，执行索引读取。读段1完成后，除去读段1中的所有内容并添加索引引物，该引物在片段的P7末端退火并对条形码进行测序。然后，所有东西从模板上剥离下来，如读段1一样，通过桥式扩增形成簇。这留下了以混合方向共价结合到流通池表面的片段拷贝。这次，将P7被切割，而不是P5，从而导致仅包含由P5区连接的片段的簇。这样可确保所有拷贝都按相同方向测序(与读段1方向相反)。测序引物退火至P7区并对模板的另一端测序。
下一代测序平台，例如MiSeq(Illumina公司，圣地亚哥，CA)，可用于高度多重测定读取。各种统计工具，例如比例测试、基于错误发现率的多次比较校正(参见Benjamim和Hocbberg,1995,Journal of the Royal Statistical Society Series B(Methodological)57,289-300)和用于多次测试的Bonferroni校正，可用于分析测定结果。此外，为从RNA-Seq数据分析差异表达而开发的方法可用于减少每个靶序列的差异并增加分析的总体能力。参见Smyth,2004,Stat.Appl.Genet.Mol.Biol.3,Article 3。
总体而言，在一些实施方案中，本方法的转化率是至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。一方面，转化率是起始文库中产生测序读数的靶向单链多核苷酸的百分比。
在前述实施方案的任一项中，该方法可用于受试者疾病或病症的诊断和/或预后，预测受试者对治疗的反应性，鉴定该疾病/病症或治疗的药物遗传学标志物，和/或筛选人群的遗传信息。一方面，所述疾病或病症是癌症或肿瘤，并且所述治疗是癌症或肿瘤治疗。
突变的DNA分子具有特异性，因此比癌症相关的生物标志物具有独特的优势。尽管个别正常细胞中的突变发生率较低(约10～9至10～10个突变/bp/世代)，但此类突变仅占全部正常DNA的很小一部分，以致它们比某些现有技术方法的检出限低数个数量级。数项研究表明，可以在CRC患者的粪便、尿液和血液中检测到突变型DNA(Osbom和Ahlquist,《大肠癌的粪便筛查：分子方法(Stool screening for colorectal cancer:molecularapproaches)》,《胃肠病学(Gastroenterology)》2005；128:192-206)。
基于测序结果，可以检测患者中的突变体DNA(包括肿瘤相关的突变)，并且可以诊断如癌症的疾病并预测肿瘤复发。基于这些预测，可以做出治疗和监视决策。例如，指示未来复发的循环肿瘤DNA可以带来附加的或更积极的疗法以及其它或更复杂的成像和监测。循环DNA是指异位于肿瘤的DNA。
可以用于监测ctDNA的样品包括血液和粪便。血液样品可以是例如血液的级分，例如血清或血浆。类似地，粪便可以分级分离以从其它成分中纯化DNA。肿瘤样品用于鉴别肿瘤中的体细胞突变基因，所述基因可用作体内其它位置的肿瘤的标志物。因此，例如，可以通过本领域已知的任何标准方法鉴别肿瘤中的特定体细胞突变。典型的方法包括使用等位基因特异性探针对肿瘤DNA进行直接测序、等位基因特异性扩增、引物延伸等。一旦识别出体细胞突变，就可以将其用于身体其它部位，以区分来源于肿瘤的DNA与来源于身体其它细胞的DNA。通过确定体细胞突变不会在同一患者身体的正常组织中出现，可以对其进行确认。可以以此方式诊断和/或监测的肿瘤类型实际上是没有限制的。可以使用任何使细胞和/或DNA脱落到血液或粪便或其它体液中的肿瘤。除结肠直肠肿瘤外，此类肿瘤还包括乳腺、肺、肾、肝、胰腺、胃、脑、头颈、淋巴、卵巢、子宫、骨、血液等的肿瘤。
一方面，本文公开的方法可用于构建用于测序和/或用于确定靶序列一个或多个区域的表观遗传状态/状况的文库。DNA甲基化是首先发现的表观遗传标志。表观遗传学是对除基本的DNA序列变化以外的机制引起的基因表达或细胞表型变化的研究。甲基化主要涉及在二核苷酸CpG的胞嘧啶残基的碳5位上添加甲基，并与阻遏或抑制转录活性有关。
亚硫酸氢盐转化是使用亚硫酸氢盐试剂处理DNA以确定其甲基化模式。用亚硫酸氢盐处理DNA将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入了特定的变化，这些变化取决于各个胞嘧啶残基的甲基化状态。可以对改变的序列进行各种分析以获得这些信息，例如，用于区分由亚硫酸氢盐转化产生的单核苷酸多态性(SNP)。美国专利第7,620,386号、美国专利第9,365,902号和美国专利申请公开2006/0134643(其全部以引用的方式并入本文中)举例说明了本领域普通技术人员已知的关于检测由于亚硫酸氢盐转化而改变的序列的方法。可以使用任何合适的技术、步骤或试剂进行亚硫酸氢盐转化。在一些实施方案中，可以使用以下试剂盒中的任一种和试剂盒中提供的程序进行亚硫酸氢盐转化：EpiMark亚硫酸氢盐转化试剂盒，New EnglandBiosciences，E3318S；EZ DNA甲基化试剂盒，Zymo Research，D5001；MethylCode亚硫酸氢盐转化试剂盒，Thermo Fisher Scientific，MECOV50；EZ DNA甲基化Gold试剂盒，ZymoResearch，D5005；EZ DNA甲基化Direct试剂盒，Zymo Research，D5020；EZ DNA甲基化Lightning试剂盒，Zymo Research，D5030T；EpiJET亚硫酸氢盐转化试剂盒，Thermo FisherScientific，K1461；或EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒，Qiagen，59104。
如上所述，亚硫酸氢盐转化的一个结果是原始靶的双链构象由于丧失序列互补性而被破坏。尽管这可能会给传统的构建双链文库的方法带来问题，但在一方面，本发明方法独特地适合于从亚硫酸氢盐转化样品构建单链文库用于测序分析。
在另一方面，本发明方法可以与用于确定甲基化状态/状况的方法结合使用，例如，如2017年4月19日提交的题为“Compositions and Methods for Detection ofGenomic Variance and DNA Methylation Status”的美国临时申请号62/487,422(代理人案卷号737993000100)中所述的，将其通过引用并入本文中并适用于所有目的。在一个实施方案中，在脱磷酸化和/或变性步骤之前，使样品与甲基化敏感性限制性酶(MSRE)接触，然后通过如本文所公开的连接构建单链文库来分析甲基化概况。
G.用于文库构建和/或测序的试剂盒。
本文的另一方面公开了一种用于构建连接产物文库的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包含单链DNA(ssDNA)连接酶。在另一方面，该试剂盒包括多个接头。在特定方面，各接头被封闭以防止在3'端连接，而接头的5'端可用于与单链多核苷酸连接以形成线性单链连接产物。各接头都包含对单链多核苷酸进行标记的独特分子标识符(UMI)序列。
在一个方面，用于构建连接产物文库的试剂盒可包含ssDNA连接酶和多个接头，并且各接头均被封闭以防止在3'端连接，而接头的5'端可用于与单链多核苷酸连接以形成线性单链连接产物，并且各接头均包含对该单链多核苷酸进行标记的UMI序列。
在另一方面，所述试剂盒可还以包含用于使来自样品的双链多核苷酸变性以获得单链多核苷酸的变性试剂。
在又一个方面，试剂盒可包括嗜热菌噬菌体RNA连接酶，例如噬菌体TS2126 RNA连接酶(例如，CircLigaseTM和CircLigase IITM)，或古细菌RNA连接酶，例如嗜热甲烷菌RNA连接酶1。在前述实施方案的任一项中，试剂盒可包括RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶，例如T4RNA连接酶2、T4 RNA连接酶2截短型、T4 RNA连接酶2截短型KQ、或T4 RNA连接酶2截短型K227Q。本发明试剂盒可还包括其他合适的ssDNA连接酶，例如T4 RNA连接酶1、热稳定的5'App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶2、截短的T4 RNA连接酶2(例如，T4 RNA连接酶2截短型、T4 RNA连接酶2截短型K227Q、T4 RNA连接酶2截短型KQ)、或T4 DNA连接酶。
在一个方面，试剂盒可还包括用于连接反应的拥挤剂。在一方面，所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG，例如PEG 4000或PEG 6000)、葡聚糖和/或聚蔗糖(Ficoll)。
在另一个方面，试剂盒可还包括用于将单链多核苷酸转化为双链多核苷酸的引物或一组引物，各引物包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列。
在一个方面，该试剂盒可还以包括用于除去引物二聚体和/或引物-接头双链体的试剂。
在另一个方面，试剂盒可包括引物，其包含对靶序列(例如EGFR基因序列)具有特异性的序列，用于获得包含所述靶序列的序列信息的扩增的线性双链连接产物。在又一个方面，试剂盒可还包含测序接头和/或样品特异性条形码，用于对扩增的线性双链连接产物进行测序。
还提供了基于上述试剂盒组分的诊断试剂盒，且其可以用于诊断个体的疾病或病况，例如癌症。在另一方面，试剂盒可以用于预测个体对药物、疗法、治疗或其组合的反应。这样的测试试剂盒可以包括个体能够用来获得例如ctDNA的样品的装置和说明书，而无需医疗保健提供者的帮助。
为了在上文描述或建议的应用中使用，还提供了试剂盒或制品。这样的试剂盒可以包含至少一种专用于对疾病或病况的标志物进行基因分型的试剂，并且可以进一步包括用于实施本文所述方法的说明书。
在一些实施方式中，本文提供了组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含引物和引物对，所述引物和引物对允许多核苷酸或其任何特定部分的特异性扩增；以及，提供了探针，所述探针出于定性或定量检测目的而选择性或特异性地与核酸分子或其任何部分杂交。探针可以用可检测的标志物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。这样的探针和引物可以用于检测样品中多核苷酸的存在，并且可作为检测由多核苷酸编码的细胞表达蛋白的手段。如本领域技术人员将理解的，可以基于本文提供的序列制备许多不同的引物和探针，并有效地用于扩增、克隆和/或确定多核苷酸，例如基因组DNA、mtDNA和其片段的存在和/或水平。
在一些实施方式中，试剂盒可另外包含用于检测多肽的存在的试剂。这样的试剂可以是特异性结合多肽的抗体或其它结合分子。在一些实施方式中，这样的抗体或结合分子可能能够区分由于多态性而引起的多肽的结构变异，且因此可以用于基因分型。抗体或结合分子可以用可检测的标志物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。试剂盒中可能包括其它用于进行结合分析(如ELISA)的试剂。
在一些实施方式中，试剂盒包含用于对至少两种、至少三种、至少五种、至少十种或更多种标志物进行基因分型的试剂。标志物可以是多核苷酸标志物(例如癌症相关突变或SNP)或多肽标志物(例如蛋白质的过表达或翻译后修饰，包括高磷酸化或低磷酸化)或其任何组合。在一些实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于捕获用于检测经过扩增的核酸的探针的表面或衬底(例如微阵列)。
试剂盒可以进一步包含携带装置，其中进行分隔以紧密地容纳一个或多个容器装置，例如小瓶、试管等，每个容器装置包含在所述方法中使用的不同的元件之一。例如，容器装置之一可以包含被标记的或者可以被可检测地标记的探针。这样的探针可以是对生物标志物具有特异性的多核苷酸。试剂盒还可以具有含有用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或包含与报告分子(例如酶促、荧光或放射性同位素标记)结合的报告装置的容器。
试剂盒通常包含上述容器和一个或多个其它容器，所述的其他容器包含从商业和用户角度考虑需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。容器上可以有标签，以指示所述组合物用于特定疗法或非疗法用途，并且还可以指示体内或体外使用的说明，例如上述那些。
试剂盒可以进一步包含一组说明书和材料，用于制备组织或细胞或体液样品并从所述样品制备核酸(例如ctDNA)。
H.其它示例性实施方式
在任何前述实施方式中，ssDNA连接酶可以是栖热菌(Thermus)噬菌体RNA连接酶，例如噬菌体TS2126 RNA连接酶(例如，CircLigaseTM和CircLigase IITM)；或古细菌RNA连接酶，例如嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)RNA连接酶1。在其它方面，ssDNA连接酶是RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶I，例如NewEngland Biosciences,M0204S。T4 RNA连接酶2，例如，New England Biosciences,M0239S；T4 RNA连接酶2截短型，例如，New England Biosciences,M0242S；T4 RNA连接酶2截短型KQ，例如M0373S；或T4 RNA连接酶2截短型K227Q，例如，New England Biosciences,M0351S。在任何前述实施方式中，ssDNA连接酶也可以是热稳定的5'App DNA RNA连接酶，例如NewEngland Biosciences,M0319S；或T4 DNA连接酶，例如New England Biosciences,M0202S。
在一些实施方式中，本方法包含使用单链DNA(ssDNA)连接酶将一组接头连接到单链多核苷酸文库。可以使用任何合适的ssDNA连接酶，包括本文公开的ssDNA连接酶。接头可以以任何合适的水平或浓度使用，例如约1μM到约100μM，例如约1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM，或其任何子范围。接头可以包含任何合适的序列或碱基或以任何合适的序列或碱基开始。例如，接头序列可以以所有2bp的碱基组合开始。
在一些实施方式中，连接反应可以在拥挤剂的存在下进行。在一个方面，拥挤剂包含聚乙二醇(PEG)，例如PEG 4000、PEG 6000或PEG 8000；葡聚糖；和/或Ficoll。拥挤剂，例如PEG，可以以任何合适的水平或浓度使用。例如，拥挤剂，例如PEG的使用水平或浓度可以是约0％(w/v)到约25％(w/v)，例如约0％(w/v)，1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)、11％(w/v)、12％(w/v)、13％(w/v)、14％(w/v)、15％(w/v)、16％(w/v)、17％(w/v)、18％(w/v)、19％(w/v)、20％(w/v)、21％(w/v)、22％(w/v)、23％(w/v)、24％(w/v)或25％(w/v)，或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应可以进行任何合适的时间长度。例如，连接反应可以进行约2到约16小时的时间，例如进行约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、或16小时或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应中的ssDNA连接酶可以以任何合适的体积使用。例如，连接反应中的ssDNA连接酶可以以约0.5μl到约2μl的体积使用，例如以约0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl、1.1μl、1.2μl、1.3μl、1.4μl、1.5μl、1.6μl、1.7μl、1.8μl、1.9μl或2μl或其任何子范围使用。
在一些实施方式中，连接反应可以在连接增强剂例如甜菜碱的存在下进行。连接增强剂，例如甜菜碱，可以以任何合适的体积使用，例如约0μl到约1μl，例如约0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶I，例如来自New EnglandBiosciences,M0204S的T4 RNA连接酶I，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：1×反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM MgCl2、1mM DTT)、25％(wt/vol)PEG8000、1mM六胺氯化钴(任选的)、1μl(10单位)T4 RNA连接酶和1mM ATP。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过加入40μl 10mM Tris-HCl pH 8.0、2.5mM EDTA来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用热稳定的5'App DNA/RNA连接酶，例如来自New England Biosciences,M0319S的热稳定的5'App DNA RNA连接酶，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：ssDNA/RNA底物20pmol(1pmol/μl)、5'App DNA寡核苷酸40pmol(2pmol/μl)、10×NEBuffer 1(2μl)、50mM MnCl2(仅用于ssDNA连接)(2μl)、热稳定的5'AppDNA/RNA连接酶(2μl(40pmol))和无核酸酶的水(至20μl)。所述反应可以在65℃下培育1小时。所述反应可以通过在90℃下加热3分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2，例如来自New EnglandBiosciences,M0239S的T4 RNA连接酶2，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、接头(2μl)和水(4μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型，例如来自NewEngland Biosciences,M0242S的T4 RNA连接酶2截短型，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、接头(2μl)和水(4μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型K227Q，例如来自NewEngland Biosciences,M0351S的T4 RNA连接酶2截短型K227Q，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型KQ进行，例如来自New England Biosciences,M0373S的T4 RNA连接酶2截短型KQ，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 DNA连接酶进行，例如来自New EnglandBiosciences,M0202S的T4 DNA连接酶，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在16℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热10分钟来停止。
第二链合成步骤可以使用任何合适的酶来进行。例如，第二链合成步骤可以使用Bst聚合酶，例如New England Biosciences,M0275S或Klenow片段(有3'->5'外切酶活性)，例如New England Biosciences,M0212S进行。
在一些实施方式中，第二链合成步骤可以使用的Bst聚合酶，例如New EnglandBiosciences,M0275S，在以下示例性反应混合物(10μl)进行：水(1.5μl)、引物(0.5μl)、dNTP(1μl)、ThermoPol反应缓冲液(5μl)和Bst(2μl)。所述反应可以在62℃下培育2分钟，并在65℃下培育30分钟。反应后，双链DNA分子可以被进一步纯化。
在一些实施方式中，第二链合成步骤可以使用Klenow片段(有3'->5'外切酶活性)，例如New England Biosciences,M0212S，在以下示例性反应混合物(10μl)进行：水(0.5μl)、引物(0.5μl)、dNTP(1μl)、NEB缓冲液(2μl)和exo-(3μl)。所述反应可以在37℃下培育5分钟并在75℃下培育20分钟。反应后，双链DNA分子可以被进一步纯化。
在第二条链合成后，但在第一或半靶向PCR之前，可以纯化双链DNA。可以使用任何合适的技术或程序纯化双链DNA。例如，可以使用以下试剂盒中的任一种来纯化双链DNA：Zymo clean and concentrator,Zymo research,D4103；Qiaquick,Qiagen,28104；ZymossDNA纯化试剂盒,Zymo Research,D7010；Zymo Oligo纯化试剂盒,Zymo Research,D4060；和AmpureXP beads,Beckman Coulter,A63882:1.2x-4x珠粒比率。
第一或半靶向PCR可以使用任何合适的酶或反应条件进行。例如，多核苷酸或DNA链可在介于约52℃到约72℃范围内的温度下退火，例如在约52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃或72℃或其任何子范围下退火。第一或半靶向PCR可以进行任何合适的循环轮数。例如，第一或半靶向PCR可以进行10-40个循环，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个循环。引物池可以任何合适的浓度使用。例如，引物池可以按介于约5nM到约200nM范围内的浓度使用，例如约5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM或200nM或其任何子范围。
第一或半靶向PCR可以使用任何合适的温度循环条件进行。例如，第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃3分钟，(95℃15秒，62℃30秒，72℃90秒)×3或×5；或(95℃15秒，72℃90秒)×23或×21，72℃1分钟，4℃保持。
在一些实施方式中，第一或半靶向PCR可以使用KAPA SYBR FAST，例如KAPAbiosciences,KK4600在以下示例性反应混合物(50μl)中进行：DNA(2μl)、KAPASYBR(25μl)、引物池(各自26nM)(10μl)、Aprimer(100μM)(0.4μl)和水(12.6μl)。第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃30秒，(95℃10秒，50-56℃45秒，72℃35秒)×40。
在一些实施方式中，第一或半靶向PCR可以使用KAPA HiFi，例如KAPABiosciences,KK2601在以下示例性反应混合物(50μl)中进行：DNA(15μl)、KAPAHiFi(25μl)、引物池(各自26nM)(10μl)和Aprimer(100μM)(0.4μl)。第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃3分钟，(98℃20秒，53-54℃15秒，72℃35秒)×15，72℃2分钟，4℃保持。
亚硫酸氢盐转化可以使用任何合适的技术、程序或试剂进行。在一些实施方式中，亚硫酸氢盐转化可以使用以下试剂盒中的任一种与试剂盒中提供的程序进行：EpiMark亚硫酸氢盐转化试剂盒，New England Biosciences，E3318S；EZ DNA甲基化试剂盒，ZymoResearch，D5001；MethylCode亚硫酸氢盐转化试剂盒，赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，MECOV50；EZ DNA甲基化金试剂盒，Zymo Research,D5005；EZ DNA甲基化直接试剂盒，Zymo Research，D5020；EZ DNA甲基化闪电试剂盒，Zymo Research，D5030T；EpiJET亚硫酸氢盐转化试剂盒，赛默飞世尔科技，K1461；或EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒，Qiagen，59104。
在一些实施方式中，DNA分子可以使用实施例4中所示的程序来制备，包括以下步骤：构建单链多核苷酸，将单链多核苷酸文库转化为双链多核苷酸文库，半靶向扩增双链多核苷酸文库，以及构建序列文库。可以使用任何合适的方法或程序进一步分析此类DNA分子的甲基化状态。
I.实施例
实施例1
在该实施例中，模板(例如，待测序的多核苷酸)是小于约200bp长的短DNA片段。这些DNA片段可以包括从血浆中提取的DNA、酶处理的(例如通过碎片酶)基因组DNA或物理剪切的DNA。物理剪切的DNA可以进行末端修复。在特定方面，模板具有用于连接的3'羟基。
通常，例如使用1U FastAP热敏碱性磷酸酶(Thermo Scientific)，在100mM MOPS(pH 7.5)，20mM KCl，10mM MgCl2，2mM DTT和5mM MnCl2中将10-30ng正确制备的模板DNA在37℃下磷酸化10分钟。然后将DNA在95℃变性2分钟，然后置于冰上1分钟。
由IDT合成具有5'磷酸基团和3'碳间隔的单链接头。5'末端包含GA，后接12聚体的独特分子标识符(UMI)序列。典型的单链接头具有以下序列：/5Phos/GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG/3SpC3/(“5Phos”代表5'磷酸基团，“NNNNNNNNNNNN”代表12聚体UMI序列，“3SpC3'”代表3'碳间隔。
然后以去磷酸的单链DNA为模板进行连接反应。在连接反应中使用以下最终浓度：50mM MOPS(pH 7.5),10mM KCl,5mM MgCl2,1mM DTT,和2.5mM MnCl2,50％PEG4000,0.5M接头,125μΜATP，和200U Epicentre CircligaseTM。将反应在60℃下温育2小时，在80℃下温育10分钟，在85℃下温育2分钟，并保持在4℃。
然后通过将之前的反应体积添加到以下中来对DNA进行双链化处理：10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，1.25U Taq DNA聚合酶(NEB)，1μM反向互补引物(与接头反向互补的引物)和200μM dNTP混合物。将反应在95℃下温育30秒，在62℃下温育2分钟，在68℃下温育10分钟，并在4℃下保持。典型的反向互补引物包含SEQ ID NO：3所示的序列：CACTCTTTCCCTACACGACGC(5'至3')。以下是接头和反向互补引物之间的比对：
接头/5Phos/GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG/3SpC3/
:::::::::::::::::::::
引物CGCAGCACATCCCTTTCTCAC
然后使用1.6(磁珠比例)×
以最大程度地减少引物与引物的相互作用以及脱靶退火的方式设计了一组PCR引物。进一步优化这些引物，使其着落于特定变体附近。设计完成后，通过IDT合成引物。将引物以相等的体积比混合到引物池中。使用以下试剂进行半靶向PCR反应：来自先前反应的所有纯化的DNA，1×KAPA 2G多重预混料，来自引物池中的每个引物66nM，和反向互补的引物800nM。反应进行以下热循环程序：95℃3分钟，(95℃15秒，72℃90秒)×20、72℃1分钟，并在4℃下保持。
然后使用1.6(磁珠比例)×
然后完成另一个PCR反应，以添加全长测序接头和样品特异性条形码。该PCR反应包含以下：2μl来自先前反应的纯化DNA，1×NEB ultra Q5 II预混料，400nM通用引物和400nM条形码特异性引物。反应进行以下热循环程序：95℃3分钟，(98℃10秒，65℃75秒)×10，65℃2分钟，并在4℃下保持。
然后使用0.8(磁珠比例)×
实施例2
在该实施例中，使用10ng和20ng输入量测试了具有已知变体的基因组DNA(gDNA)样品和血浆样品。gDNA样本包含单核苷酸变异(SNV，可与“单核苷酸改变”SNC交互使用)，插入缺失(indel)，CNV和融合。每个变体在不同的等位基因分数调用：5％，1％，0.5％和0.1％。测量每种突变类型在每个等位基因分数的敏感性和特异性。此处使用的引物池显示在表1中。每种靶标特异性引物可以在整个池中以相同的体积比使用，也可以以不同的体积比使用。例如，对于体积比为2的引物，应以比例为1的引物的2倍体积添加引物。
表1：
一方面，本发明的方法可以在某些基因座处实现更高的灵敏度。在下面的表2中，将本发明方法与常规的杂交捕获方法进行比较。本发明方法调用了杂交捕获所错过的几个基因座，这与本发明方法的增加的转化率直接相关。
表2：
实现了～80％的极高连接效率，转换率达到～60％，相比之下在标准文库中分别是～25％和10％。表3示出了本发明方法的示例性转化率。
表3：
如图6所示，该分布显示，与杂交捕获相比，本发明方法的转化率明显提高。尽管在该实施例中，常规的杂交捕获方法可以实现约47％的转化率，但是本发明方法实现了高得多的约88％的转化率。这种显著更高的转化率，以及在单个反应中跨数百个基因座进行多重复用(multiplex)的能力，使得本发明方法非常适合多核苷酸的高通量和高精度测序和分析，特别是对于等位基因分数非常低的样品，如携带与癌症相关SNP和/或突变的ctDNA。
此外，针对极小的目标区域(～30,000个碱基)的靶向率高达70％，而使得富集因子>40,000×，相比之下，标准文库的富集因子为～2000×。效率的提高导致更高的灵敏度，使得在许多变体中精确调用低至0.1％。SNV、插入缺失、CNV和融合被准确地调用。此外，该过程非常稳健，失败率为0％。
实施例3
在该实施例中，描述了一种用于从提取的血浆DNA构建文库的方法，例如以从循环肿瘤DNA中探询单核苷酸变化(SNC)，插入缺失(indel)，拷贝数变异(CNV)和融合。作为该实施例的原理，提取的血浆DNA(例如来自人)被去磷酸化并变性。单链DNA连接可为每个分子的3′端添加通用接头。然后，使用针对接头的位点特异性引物和反向互补引物对DNA进行半靶向PCR。使用二级PCR制备文库，以向每个分子添加全长接头和条形码。
本实施例中使用的设备、材料和耗材包括：Veriti热循环仪，96孔磁体，96孔冷冻块，涡漩器，孔板微型离心机，半裙式96孔PCR板，板密封件，移液器和移液器吸头。
本实施例中使用的试剂和介质包括：无核酸酶的水(Ambi on/Thermo：AM9939)，低TE缓冲液(Thermo fisher：12090015)，Circligase试剂盒(Epicenter：CL4115K)，FastAP(Thermo Fisher：EF0651)，50％PEG 4000(Sigma：95904-250 g-F。稀释5g于10mL不含核酸酶的水(Ambion/Thermo：AM9939)中)，10μM N12接头(IDT)，Taq聚合酶(NEB：M0273 S)，dNTP混合物(NEB：N0447L)，标准Taq缓冲液(NEB：M0273 S)，Ampure XP磁珠(Agincourt/BeckmanCoulter：A63881)，100uM反向互补引物(IDT)，引物混合物(IDT)，KAPA2G multiplex(KAPA：KK5802)，NEBNext Ultra Q5II(NEB：M0544L)和10μM NEBNext Multiplex寡核苷酸(IDT)。
程序
去磷酸化：
1.创建下面的预混料：
2.将预混料和DNA添加至96孔板。
3.将板密封以使其短暂涡旋并离心下沉。
4.运行以下程序：37℃10分钟，95℃2分钟。
5.之后，立即将板置于96孔冷冻块上1分钟，然后取下板以继续进行下面的连接。
连接：
1.创建下面的预混料：
2.将18μl的预混料直接添加至去磷酸化的产物中。
3.将板密封以使其短暂涡旋并离心下沉。
4.运行以下程序：60℃2小时，80℃10分钟，85℃2分钟，4℃保持。
5.立即进行下面的第二链合成。
第二链合成：
1.创建下面的预混料：
2.将10μl的预混料直接添加到连接产物中。
3.将板密封以短暂涡旋并离心下沉。
4.运行以下程序：95℃30s，62℃2分钟，68℃10分钟，4℃保持。
5.立即继续下面的
1.涡旋
2.将80μl的磁珠添加到第二链合成的产物中，并上下吹吸以使磁珠均匀。
3.在室温下温育10分钟。
4.将板转移到磁体上，在磁体上温育5分钟或直到所有磁珠都移向磁体。
5.除去所有上清液。
6.添加150μl的80％EtOH并温育30秒。
7.除去上清液。
8.重复步骤6-7。
9.确保除去所有残留的乙醇，然后从磁体上取下板，并在室温下温育3分钟。
10.添加16μl的低TE缓冲液并上下吹吸以使磁珠均匀。
11.在室温下温育2分钟。
12.将板转移到磁体上，并在磁体上温育1分钟或直到所有磁珠都移到磁体上。
13.除去15μl上清液并将其放在干净的板上。
14.进行下面的第一次PCR或在-20℃储存。
第一次PCR:
1.创建下面的预混料：
2.将35μl的预混料添加到15μl的纯化的DNA中。
3.将板密封以短暂涡旋并离心下沉。
4.运行以下程序：95℃3分钟，(95℃15秒，72℃90秒)×20，72℃l分钟，4℃保持。
5.立即继续下面的
1.涡旋
2.将80μl的磁珠添加到第二链合成的产物中，并上下吹吸以使磁珠均匀。
3.在室温下温育10分钟。
4.将板转移到磁体上，在磁体上温育5分钟或直到所有磁珠都移向磁体。
5.除去所有上清液。
6.添加150μl的80％EtOH并温育30秒。
7.除去上清液。
8.重复步骤6-7。
9.确保除去所有残留的乙醇，然后从磁体上取下板，并在室温下温育3分钟。
10.添加20μl的低TE缓冲液并上下吹吸以使磁珠均匀。
11.在室温下温育2分钟。
12.将板转移到磁体上，并在磁体上温育1分钟或直到所有磁珠都移到磁体上。
13.除去19μl上清液并将其放在干净的板上。
14.进行下面的第二次PCR或在-20℃保存。
第二次PCR
1.创建下面的预混料，并注意分别添加索引引物和DNA，其余DNA储存在-20℃：
2.在一个新板上，加入46μL预混料，2μL引物和2μL DNA。
3.将板密封以短暂涡旋并离心下沉。
4.运行以下程序：95℃3分钟，(98℃10秒，65℃75秒)×10，65℃2分钟，4℃保持。
5.立即进行下面的磁珠清洁。
1.涡旋
2.将40μl的磁珠添加到第二链合成的产物中，并上下吹吸以使磁珠均匀。
3.在室温下温育10分钟。
4.将板转移到磁体上，在磁体上温育5分钟或直到所有磁珠都移向磁体。
5.除去所有上清液。
6.添加150μl的80％EtOH并温育30秒。
7.除去上清液。
8.重复步骤6-7。
9.确保除去所有残留的乙醇，然后从磁体上取下板，并在室温下温育3分钟。
10.添加25μl的低TE缓冲液并上下吹吸以使磁珠均匀。
11.在室温下温育2分钟。
12.将板转移到磁体上，并在磁体上温育1分钟或直到所有磁珠都移到磁体上。
13.除去24μl上清液并将其放在干净的板上以在-20℃保存。
LabChip HS试剂盒的LabChip QC
1.从4℃移取LabChip和试剂以平衡至室温(10分钟)。
2.必要时准备新的凝胶染料溶液
3.用分子级H2O分别抽吸和冲洗每个活性芯片孔两次。
4.通过将12μL的梯溶液与108μL的H2O在梯管中混合来制备LabChip梯。
5.在缓冲管中准备750μl H2O。
6.使用反向移液技术来制备LabChip。
7.在BioRad硬壳板或Thermo Fisher Armadillo 96孔板中，在19μL水中稀释1μL文库。
8.运行LabChip。
qPCR定量
1.如果需要，通过向Kapa SYBR Fast qPCR MM-5mL新瓶(KK4601)中添加30μlIllumina正向和反向引物来制备qPCR预混料。
2.准备所有文库的1:10,000稀释液。
3.在BioRad硬壳板或Thermo Fisher Armadillo板中，准备以下反应，并留空至少12个孔。
4.在同一96孔板中，准备6个qPCR标准品的副本。
5.编辑板文件以反映板布局和标准浓度。
6.在BioRad C1000热循环仪上运行以下程序：95℃5分钟>(95℃30秒>60℃45秒>成像步骤)×35。
7.将qPCR数据导出为excel表。
8.将起始浓度乘以(452/300)，以调整Kapa标准品与文库之间的大小差异。
9.将步骤8中的浓度乘以10，以调整稀释倍数并将pM转换为nM。
测序(NextSeq)
1.通过置于冷水中将300循环NextSeq试剂盒解冻并从4℃移取流通池以平衡至室温。
2.以1:1摩尔比合并要测序的文库。
3.使用变性和稀释方案将文库池稀释至2.2pM的合成最终浓度和>1300μL的最终体积。
4.将1300μL加载到NextSeq试剂盒的孔10中。
5.清空NextSeq废液容器并装入新的流通池和缓冲液盒。
6.在孔10中装载含有库的NextSeq试剂盒，NextSeq读取长度的设置如下所示：
7.测序。
序列表
<110> 鹍远基因公司
<120> 用于文库构建和序列分析的组合物和方法
<130> 4552-2000240
<150> 62/487,423
<151> 2017-04-19
<150> 62/657,544
<151> 2018-04-13
<160> 1529
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tg 32
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
gannnnnnnn nnnnagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtg 46
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 3
cactctttcc ctacacgacg c 21
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaaacatc ccacgcctag tccctgg 57
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaacaggt ttccagtgcc agct 54
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaacccat agaaggggta tttgttggat 60
tattt 65
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaagccac ctccttactt tgcctcct 58
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaacagatt gtgaacagcc ttggaagcc 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaacatgca gaagtccagg ctgaaaagg 59
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<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaccatca tgatgtgtta cccagaatgt 60
ttt 63
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaccgtag ttcacatgca ctcctgt 57
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaactaaca ggttaagtgc tcccagggg 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaactttgt gtcgctacct cagtttgcc 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaagagtaa ttcacacaag ctcacctga 59
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaagcagga tctcaggtct ctcaaaggg 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaggcaaa cacatccacc caaagactc 59
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaagtgaat tgcagtcctt cccctctg 58
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaatctatt gtgggctctg ggaatcctg 59
<210> 19
<211> 67
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaattctta agtaatacta accttgaacc 60
gactggt 67
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacaagagc agaaagtcag tcccatgga 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacaagttg gaaatttctg ggccatgaa 59
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacacagaa agggcccaaa ttcaccaat 59
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacagaaga cctcacatgc cacaaagaa 59
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacatgtgg agtgaacgtt gttggactc 59
<210> 25
<211> 62
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccaactc cataaactaa acagaaagcg 60
gt 62
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccgggat tatgtctctt gtttgggga 59
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<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacggaata taagctggtg gtggtggg 58
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacgggaga aaatagcacc tcacttcca 59
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactaggtc agctgaagat cctgtgagc 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactccaca cgcaaatttc cttccactc 59
<210> 31
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactgctgg ctgatctatg tccctgaag 59
<210> 32
<211> 61
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactggttt ccaacaggtt cttgctggtg 60
t 61
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacttactg cagctgtttt cacctctgt 59
<210> 34
<211> 56
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagaaaaag tttgctgagc tgggta 56
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagaaggtg tgtctttaat tgaagcatga 60
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagacaata aaaggcagct tggacacgg 59
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagaccata acccaccaca gctagaact 59
<210> 38
<211> 62
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagacccaa cacaacttcc ttatgatcac 60
aa 62
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagagtgcc agctgatgaa gacggag 57
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 40
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagataatg actcacctgg ggccacatt 59
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagattgtc gtcgattctt gtgtgctgt 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagcaagtt cttcatcagc tgtactcct 59
<210> 43
<211> 62
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagcactta cctgtgactc catagaaaat 60
ct 62
<210> 44
<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagccacaa aacttacaga tgcagcag 58
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagccagcc cgaagtctgt aattttgac 59
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagccctca tgtctgaact caaagtcct 59
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagctgatt tgatggagtt ggacatggc 59
<210> 48
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 48
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggaaatc aaagaacctg tggccaaac 59
<210> 49
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggatctt ttcttcacgg ttgcctact 59
<210> 50
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggatgaa caggaagaag cccaccc 57
<210> 51
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagggaggt caaataagca gcaggagaa 59
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<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtcact gatggaggag gtcttgc 57
<210> 53
<211> 62
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagtactta cccactgaaa agcacttcct 60
ga 62
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagtccctg atagttgcta agaaccggt 59
<210> 56
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagtcctca tgtactggtc cctcattgc 59
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagtctctc tgcctcaata agccaacca 59
<210> 58
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagttgtct cactgcctca tctctcacc 59
<210> 59
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatcagtct gtccagcact tccattggg 59
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatccatga actccacatt tgccttggg 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatctcctt ggtgaccgct ctgcatcta 59
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctattccaga cgcatttcca cagctacac 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaaacag cacagtgaaa gccagccac 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaaagcc tccagtcgcc tcagtaaag 59
<210> 65
<211> 64
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaacttt ataagatcct ggctatcctg 60
tgga 64
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<211> 64
<212> DNA
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<400> 66
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ccct 64
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<213> 智人
<400> 67
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tg 62
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
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<212> DNA
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gca 63
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<400> 70
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<213> 智人
<400> 71
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagaaggt tgcacttgtc cacgca 56
<210> 72
<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagacagc agcaccgaga cgatgaag 58
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
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<210> 75
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcgaca tgtctttccc cacaatcat 59
<210> 76
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
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<210> 77
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaggccct ggtagctcat catctgg 57
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
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<210> 79
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcataccct ctcagcgtac ccttgtcc 58
<210> 82
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcatatagt tatcaccata aaattgtcat 60
agctagacat g 71
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccacacct gtcatgtagc agctttcag 59
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<212> DNA
<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccacacga cgggaagaca agttcatg 58
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccacttct ccaggaccac ggactg 56
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccaggaga gttgcgggga ttgac 55
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccagggaa tgtggggcca gac 53
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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ttga 64
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<213> 智人
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gca 63
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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c 61
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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aa 62
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 138
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<213> 智人
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<213> 智人
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aggta 65
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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acc 63
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 151
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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ttt 63
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 166
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<213> 智人
<400> 167
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gaaaca 66
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<213> 智人
<400> 168
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<213> 智人
<400> 169
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<213> 智人
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tc 62
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<213> 智人
<400> 171
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcaacacc cagccctcgg taag 54
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 172
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcagcaac ggacatgagt ttgttttcc 59
<210> 173
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<212> DNA
<213> 智人
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<210> 174
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<213> 智人
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcccatcc ctgactgtga gatcaagaa 59
<210> 176
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgccccaat tgcaggtaaa acagtcaag 59
<210> 177
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcccgtat ttactgccgt tcttttcca 59
<210> 178
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcctccca gcaatttcct cccttgtt 58
<210> 179
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<213> 智人
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<210> 180
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcggaaga atgtgtcagc ctcaaagaa 59
<210> 181
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<212> DNA
<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcgtgcct gccaatggtg atg 53
<210> 182
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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ttactgaacc tttaggt 77
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<213> 智人
<400> 184
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tagacagaaa t 71
<210> 185
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgctcgggt tggctctaaa gtagtcct 58
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgctgccac ttctacgact tcttcaacc 59
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<213> 智人
<400> 187
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgctggaaa gggacgaact ggtgtaatg 59
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<213> 智人
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ctgc 64
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcttggat catattggcc tgtctgctc 59
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<213> 智人
<400> 190
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggaaatag gtttcatgga ctcagttact 60
acctg 65
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggaagcca agcccagttc tggaag 56
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggacagtt gatacaaaac aagcccacg 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggagcaga tcaaacgggt gaaggactc 59
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggagtcca ggaaatgata tcacataagt 60
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 195
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggatactt acgcgccaca gagaagttg 59
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<212> DNA
<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggatatat tccagtggtt tgttgctctc 60
tg 62
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 197
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggatgcct tattgcgaca gatccgga 58
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 198
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggatgttc tggaaggcaa actccatgg 59
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggcctctg attcctcact gattgctct 59
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<213> 智人
<400> 200
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggcctgct gaaaatgact gaatataaac 60
ttgtgg 66
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<213> 智人
<400> 201
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggctggat cctgaactgg gcaaaatta 59
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<213> 智人
<400> 202
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggcttcac agacatcctt gcacatctc 59
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<213> 智人
<400> 203
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgggcttga acatactaaa tgctccagt 59
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<213> 智人
<400> 204
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgggttcag caaatcttct aatccatgag 60
g 61
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<213> 智人
<400> 205
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggtactct gtctcgtcaa tgtccagca 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggtagatt ccagttcttg tgtgcgtgc 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggtccctc ccacagttgc ttcaagt 57
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggtgggaa gaacagccta gacttggg 58
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggttccag gcttgctgta attacccag 59
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<212> DNA
<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtaatccc caacccaata gacccaccc 59
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<212> DNA
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtcagagt tcaagtactg ggggcca 57
<210> 212
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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tc 62
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtcctggg attgcagatt gggccttg 58
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgaagga ccaaggagca gaggagg 57
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgaccga ggacaacgtg atgaagatc 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgagcag gtggaagtag gaggtcttg 59
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgatagg aagctgtgga gtgatgagc 59
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<213> 智人
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttcagag tagtagctgc aaataatcta 60
gggtttgg 68
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<212> DNA
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttgggac cacactgagt tctctgt 57
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<213> 智人
<400> 224
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtttactt gaaggcctcc ggaatgcg 58
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcacattt ctttgaccat ttgttttgct 60
gt 62
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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gatttg 66
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taaaatgact tagg 74
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctttctacct gcagtaaaac gatgtttgc 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctttctccag gcgtttcttc catccttcc 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctttcttcat accaggacca gaggaaacc 59
<210> 274
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttttaaaca tgcattgata acacccctac 60
tgct 64
<210> 276
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttttctaat cacataggca ggaaatctca 60
gtg 63
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<213> 智人
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<210> 278
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttttgtttc tcccacacag acactattgt 60
g 61
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<213> 智人
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<211> 59
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<213> 智人
<400> 280
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaagctct tcctgtttca gtccccatt 59
<210> 281
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 281
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccttttc ttatgtgctt ttagggccca 60
<210> 282
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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t 61
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gt 62
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a 61
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<213> 智人
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acct 64
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tg 62
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aga 63
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<213> 智人
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tt 62
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tct 63
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 1187
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtaaagct ggaaagggac gaactggtg 59
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<213> 智人
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtaacgtc ctgtcctgcc cctgtc 56
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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gt 62
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a 61
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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gga 63
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<213> 智人
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