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小RNA组成的指纹图谱在肺癌的诊断和治疗中的应用

2020-12-05 00:12:45

小RNA组成的指纹图谱在肺癌的诊断和治疗中的应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物医学、生物工程和检测技术领域，具体地，涉及小RNA组成的指纹图谱在人的支气管肺泡灌洗液诊断和治疗肺癌中的应用。

　　背景技术

　　由于从肺部其他疾病中准确地诊断肺癌是非常困难的一件事，肺癌通常在晚期症状出现时才被发现，因此大约有75％的肺癌病人被诊断的时候均已是IIIB期或IV期。这也是导致肺癌病人五年生存率低(15％)的主要原因。而早期诊断肺癌能使病人的五年生存率提高到85％。

　　CT作为初步筛查的主要手段，能区分良恶性肺部结节，但其显著差异的假阳性和假阴性结果(44％假阳性和17％假阴性)作为诊断手段有很大的局限性。

　　肿瘤、间质性肺病、肉芽肿性疾病以及某些感染性疾病都需要通过经支气管镜活检术来确定诊断，这是最常用的一项检查项目。支气管镜结合支气管活检、刷检和冲洗液，其检测灵敏度能从25％达到75％。然而，由于器材的局限性，支气管镜针无法伸入到对于周围型肺部结节的检测灵敏度却很低(刷检灵敏度55％，纤维支气管镜活检灵敏度46％，冲洗液或支气管肺泡灌洗液检测灵敏度43％)通过直接或者间接支气管冲洗肿瘤，利用支气管肺泡灌洗液可收集气道上皮细胞，免疫细胞和细胞分泌物可用于检测。但是用于诊断或者预后的肺癌标记物还鲜有报道。此外，支气管肺泡灌洗液样品的细胞学检验对于肺癌诊断的灵敏度也较差。有文献报道称，这些细胞外基质，包括miRNAs的表达，或许可以作为肺癌的生物标记物。

　　因此，本领域迫切需要提供一种利用支气管肺泡灌洗液诊断和治疗肺癌的试剂和方法。

　　发明内容

　　本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于帮助支气管肺泡灌洗液中的肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价。；

　　具体地，本发明的目的是通过对支气管肺泡灌洗液的miRNAs表达谱进行分析，找到能帮助支气管镜诊断肺癌的miRNAs指纹图谱。本发明利用上海翔琼生物技术有限公司的miRNA实时定量PCR检测平台，检测并验证了大样本量的支气管肺泡灌洗液的肺癌患者和非癌症对照的基因组miRNAs表达情况，并发现了一组8个miRNAs组成的指纹图谱能从非癌症对照中很好的区分肺癌样品。作为气管镜辅助手段，8个miRNAs组成的指纹图谱，对周围型肺癌患者的检测灵敏度也很高。尤其是对于某些周围型肺癌患者，支气管镜无法进行活检检测，或无法进行手术活检的肺癌患者，可以利用支气管肺泡灌洗液指导肺癌的诊疗。这对于利用支气管肺泡灌洗液指导肺癌的诊疗和评估预后具有重要的指导意义。

　　在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA为：

　　(ⅰ)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA，其中n为选自1-17的正整数；

　　(ⅱ)与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA；

　　(ⅲ)序列如SEQ ID NO:1-17所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；或

　　(ⅳ)与SEQ ID NO:1-17所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合。

　　在本发明的第二方面，提供了一种miRNA集合或组合，所述的miRNA集合或组合为：

　　(a)序列如SEQ ID NO:1-17所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；

　　(b)与SEQ ID NO:1-17所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或

　　(c)至少一种来自序列如SEQ ID NO:1-17所示的miRNA与至少一种来自与SEQ IDNO:1-17所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQ IDNO:1-17所示的miRNA的序列与来自与SEQ ID NO:1-17所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。

　　在另一优选例中，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-8所示的序列中的8种miRNA。

　　在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。

　　在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。

　　在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由8个miRNAs组成的小RNA指纹图谱，用于肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或区分肺癌支气管肺泡灌洗液和良性支气管肺泡灌洗液；；

　　且所述8个miRNAs为HSA-MIR-137-3p，HSA-MIR-182，HSA-MIR-210,HSA-MIR-181a，HSA-MIR-125b-2#，HSA-MIR-146b-5p，HSA-MIR-224和HSA-MIR-146a。

　　在另一优选例中，所述肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价利用支气管肺泡灌洗液进行。

　　在另一优选例中，所述的肺癌包括中央型肺癌和周围型肺癌。

　　在本发明的第三方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面所述的miRNA。

　　本发明还提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第二方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

　　在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面所述的miRNA；

　　较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

　　Seq正向-X-Seq反向式I，

　　式I中，

　　Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

　　Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

　　X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

　　并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

　　式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

　　表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

　　本发明还提供一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合包括能被人细胞转录成前体miRNA的多核苷酸，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第二方面所述的miRNA集合或组合。

　　在另一优选例中，所述的多核苷酸集合或组合中的一种或多种多核苷酸具有式I所示的结构：

　　Seq正向-X-Seq反向式I，

　　式I中，

　　Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

　　Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

　　X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

　　并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

　　式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

　　表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

　　在本发明的第五方面，提供了一种载体，它含有本发明第一方面所述的分离的miRNA、或本发明第二方面所述的miRNA集合或组合，或本发明第四方面所述的多核苷酸。

　　在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的分离的miRNA、或本发明第二方面所述的miRNA集合或组合的用途，用于制备芯片或试剂盒；所述芯片或试剂盒用于：

　　(1)肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价，较佳地为利用支气管肺泡灌洗液进行的肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价；

　　(2)区分肺癌支气管肺泡灌洗液和良性支气管肺泡灌洗液。

　　在本发明的第七方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

　　固相载体；以及

　　有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-17所示的部分或全部序列。

　　在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

　　互补结合区；和/或

　　与固相载体相连的连接区。

　　在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-8所示的全部序列。

　　在本发明的第八方面，提供了本发明第七方面所述的miRNA芯片的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于：

　　(1)肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价，较佳地为利用支气管肺泡灌洗液进行的肺癌的诊断、肿瘤分级和预后评价；

　　(2)区分肺癌支气管肺泡灌洗液和良性支气管肺泡灌洗液。

　　在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第七方面所述的miRNA芯片和/或用于本发明第二方面所述的miRNA集合或组合的检测试剂。

　　在另一优选例中，所述的试剂盒还含有本发明第二方面所述的miRNA集合或组合用于阳性对照。

　　在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明书，所述的说明书记载了利用所述miRNA芯片对SEQ ID NO.:1-17所示序列进行测试的方法。

　　在本发明的第十方面，提供了一种筛选治疗肺癌的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

　　(a)在实验组中，在待测物质存在下培养肺癌细胞；在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的肺癌细胞；且在空白对照组中，在与所述实验组条件相同的情况下培养良性肺细胞；

　　(b)测定所述实验组肺癌细胞中本发明第一方面所述的分离的miRNA或本发明第二方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，并与对照组中肺癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；

　　其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于空白对照组中的肺良性细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是治疗肺癌的候选药物。

　　在另一优选例中，所述的肺癌细胞为支气管肺泡灌洗液中的肺癌细胞。

　　在另一优选例中，所述方法还包括步骤(c)：将所述候选药物进一步施用于患肺癌的非人哺乳动物，从而测定所述候选药物对所述非人哺乳动物的肺癌的影响。

　　在另一优选例中，所述的miRNA为本发明第一方面所述的分离的miRNA。

　　在另一优选例中，所述的miRNA为本发明第二方面所述的miRNA集合或组合。

　　在另一优选例中，所述的“发生了趋向于空白对照组中的良性肺细胞的表达水平的变化”指对于某一miRNA而言，满足下式：

　　Q≤0.5

　　其中，Q＝abs(A1-A0)/abs(A2-A0)

　　式中，A0为空白对照组的肺良性细胞中所述miRNA表达水平；A1为实验组的所述miRNA表达水平；A2为对照组的所述miRNA表达水平；abs表示绝对值。

　　在另一优选例中，当所述miRNA肺癌支气管肺泡灌洗液上调型(即A2-A0＞0)时，则A1-A0≤0或Q≤0.5。

　　在另一优选例中，当所述miRNA为肺癌支气管肺泡灌洗液下调型(即A2-A0＜0)时，则A1-A0≥0或Q≥0.5。

　　在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(a)中还包括阳性对照组，即在与所述实验组条件相同且不存在所述待测物质但存在已知的治疗肺癌的药物的情况下，培养相同的肺癌细胞；

　　并且，在步骤(b)中还包括将所述实验组中肺癌细胞的一种或多种miRNA的表达水平，并与所述阳性对照组中肺癌细胞的miRNA的表达水平进行比较。

　　在另一优选例中，所述miR选自：HSA-MIR-137-3p、HSA-MIR-182、HSA-MIR-210、HSA-MIR-181a、HSA-MIR-125b-2#、HSA-MIR-146b-5p、HSA-MIR-224和HSA-MIR-146a。

　　在本发明的第十一方面，提供了一种体外非诊断性的判断细胞或组织是否为肺癌细胞或组织的方法，包括步骤：测定所述细胞或组织中本发明第一方面所述的分离的miRNA或本发明第二方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常组织相比，具有显著的差异，则说明该细胞或组织是肺癌细胞或组织。

　　在本发明的第十二方面，提供了一种诊断肺癌支气管肺泡灌洗液样本的方法，包括步骤：测定样本中本发明第一方面所述的分离的miRNA或本发明第二方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常样本相比，具有显著的差异，则说明该样本为肺癌支气管肺泡灌洗液样本。

　　应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

　　附图说明

　　图1显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对12个选定的miRNA(表2)对训练集中的肺癌支气管肺泡灌洗液区分。

　　图1A为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，横坐标表示每个样本，所有样本(N＝106)被分为两部分(肺癌样品53例和良性样品53例)，纵坐标表示每个样本预测为癌症的概率值(>＝0.5为癌症，<0.5为良性)，黑色点表示判断正确的样品，红色点表示判断错误的样品；

　　图1B为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出结果的ROC曲线图。

　　图2显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对8个选定的miRNA(表3)对测试集中的肺癌支气管肺泡灌洗液判断结果。具体为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，横坐标表示每个样本，所有样本(N＝133)被分为两部分(肺癌样品104例和良性样品29例)，纵坐标表示每个样本预测为癌症的概率值(>＝0.5为癌症，<0.5为良性)，黑色点表示判断正确的样品，红色点表示判断错误的样品。

　　具体实施方式

　　本发明人通过广泛而深入的研究，通过对近两千个miRNA进行筛选，首次筛出数个特异性的miRNA，经检验证明，将这些特异性的miRNA标志物进行一定的组合可非常有效地区分肺癌和良性。本发明人还首次筛选出数个特异性的miRNA能够在支气管肺泡灌洗液中非常有效诊断肺癌。本发明提出了miRNA组成的指纹图谱在支气管肺泡灌洗液诊断中的应用，可以作为支气管镜辅助诊断手段，帮助诊断肺癌。在此基础上，完成了本发明。

　　术语

　　为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

　　miRNA及其前体

　　本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

　　人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

　　miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

　　前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、6、7、8个不匹配的核苷酸。

　　如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

　　本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:n所示的序列，其中n为选自1-17的正整数。

　　为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

　　在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含义。

　　对于本发明所揭示的肺癌支气管肺泡灌洗液特异性的miRNA，可以通过常规的miRNA芯片技术进行验证，例如包括用常规方法或常规试剂盒抽提miRNA，然后进行检测。代表性的试剂盒包括(但并不限于)：Qiagen or Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提。

　　此外，还可通过特异性扩增并检测扩增产物(或相应的荧光信号等可检测信号)来检测或验证本发明的肺癌支气管肺泡灌洗液特异性的miRNA。优选的高灵敏度和高特异性的的技术包括(但并不限于)：CN10267663A中所公开的技术。通常，所用引物的特异性结合区可根据所需检测的已知miRNA的序列进行设计，优选地扩增时所用引物的特异性结合区通常是与miRNA完全互补的互补序列。

　　反义寡核苷酸

　　根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

　　在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

　　作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。

　　将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。

　　多核苷酸构建物

　　根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

　　作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

　　Seq正向-X-Seq反向式I，

　　式I中，

　　Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq反向基本上互补的核苷酸序列；

　　X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；

　　式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

　　式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；

　　表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

　　通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

　　芯片

　　miRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种miRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种miRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的miRNA的转录水平进行检测。

　　利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。

　　在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分肺癌支气管肺泡灌洗液和良性。

　　本发明的所述的miRNA芯片包括：

　　固相载体；以及

　　有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-17所示的序列中的至少1种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种)。

　　具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

　　所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

　　所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

　　另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

　　(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

　　(2)将步骤(1)得到的RNA与所述的miRNA芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

　　(3)检测步骤(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。

　　从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

　　更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

　　对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

　　将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

　　本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

　　然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。

　　检测试剂盒

　　本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于区分肺癌和良性支气管肺泡灌洗液(较佳地，区分周围型肺癌，更佳地，区分中央型肺癌)。

　　更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

　　此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。扩增液中还可含有荧光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的试剂盒中还可包括引物。其他检测手段还包括生物芯片，或者还可以通过探针法(Taqman)等进行测定。

　　另外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

　　本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

　　本发明的主要优点包括：

　　(1)本发明提供了一类可用于在支气管肺泡灌洗液中很好的检测肺癌的miRNA指纹图谱；

　　(2)本发明提供了一类miRNA指纹图谱可用于在支气管肺泡灌洗液中较好的辅助支气管镜检测周围型肺癌；

　　(3)本发明的miRNA指纹图谱，可非常有效地区分肺癌及良性支气管肺泡灌洗液，灵敏度高、特异性强；

　　(4)本发明的miRNA指纹图谱，可较有效地辅助支气管镜检测周围型肺癌及良性支气管肺泡灌洗液，灵敏度较高、特异性强；

　　(5)本发明的miRNA指纹图谱，可有效用于支气管肺泡灌洗液对于肺癌的诊断、分型和预后评价。

　　下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

　　除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

　　除非特别说明，否则本发明说明书中所用的材料和试剂均为市售产品。

　　实施例1

　　样本的收集和信息分析

　　非癌症对照组和肺癌患者支气管肺泡灌洗液的收集由复旦附属中山医院完成，训练集共计106例样品，包含53例炎症病人的支气管肺泡灌洗液作为良性对照，53例肺癌病人的支气管肺泡灌洗液，其中27例肺腺癌病人，17例肺鳞癌病人，3例肺小细胞肺癌病人，1例复合型神经内分泌癌病人(肺小细胞肺癌和大细胞癌混合)，以及4例肺癌(亚型未知)病人。另收集测试集共计133例支气管肺泡灌洗液样本。如按癌症发生部位分，106例训练集样品包括68例中央型(30例肺癌和38例良性对照)，38例周围型(23例肺癌和15例良性对照)；133例双盲验证样品包括84例中央型(64例肺癌和20例良性对照)，49例周围型(40例肺癌和9例良性对照)。共239例支气管肺泡灌洗液样品收集均在治疗前进行，且1小时内进行处理保存至-80度。本发明所获样品均经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。所有样品临床特征性指标和病理按照WHO标准分类，详见下表1。

　　表1：样品信息和分类

　　实施例2

　　支气管肺泡灌洗液样品制备：

　　支气管肺泡灌洗液样品室温下收集于无菌的15ml BD管中，并在1小时内进行预处理。

　　支气管肺泡灌洗液在2000g，20度下离心15分钟，所得上清液保存于-80度或进行试验。

　　实施例3

　　支气管肺泡灌洗液样品上清的总RNA提取：

　　200ul支气管肺泡灌洗液上清样品中加入1000ul QIAzol Lysis Reagent试剂(Qiagen miRNeasy mini kit；Qiagen,217004)，并遵循相关操作进行总RNA抽提。

　　5纳摩尔的外源性cel-miR-39加入到支气管肺泡灌洗液上清的总RNA抽提过程中，作为内源性对照来质控样品的抽提。

　　实施例4

　　miRNA的分离和cDNA的合成：

　　抽提所得总RNA可通过琼脂糖凝胶电泳来检测，分离所得的总RNA质量可通过紫外分光光度法Biomate3(Thermo Scientific)进行分析。

　　采用SharpvueTM miRNA反转录试剂盒SharpvueTMmiRNA First Strand Kit(Biovue,9000004)在miRNA的3’端添加Poly A尾，而后通过反转录引物转化成cDNA，操作步骤根据试剂盒说明书进行操作。RT反应在Gene Amp PCR 9700Thermocycler(AppliedBiosystems)中完成，反应条件为37℃，60min；95℃，10min灭活。

　　实施例5

　　miRNAs阵列在训练集中的筛选：

　　通过前期的预实验，对癌症样品的1920个miRNAs进行了初筛，通过实时定量PCR反应与无监督聚类和生物信息分析，并比对文献报道，筛选出一个适合液体活检的miRNAs阵列。被筛选出的miRNAs阵列再通过25例支气管肺泡灌洗液样品(11例肺癌病人和14例阴性对照)检测，样品均通过实时定量PCR仪检测，Quantile-Mean method被用于生物信息统计分析。只有那些表达变化量≥2和p值<0.05的miRNAs被选中。之后，再同文献报道的miRNAs进行比较，最后筛选出和支气管肺泡灌洗液肺癌诊断相关的miRNAs阵列。到目前为止，这也是第一次在支气管肺泡灌洗液中如此大批量的利用实时荧光定量PCR检测miRNAs，且是第一个有关于肺癌诊断相关的如此大量的检测1920个miRNAs的研究工作。缩小至96个miRNAs支气管肺泡灌洗液候选标记物阵列。利用筛选出的96个miRNAs支气管肺泡灌洗液候选标记物阵列，对53例肺癌病人和53例阴性对照样品进行实时荧光定量PCR检测并建立支气管肺泡灌洗液肺癌诊断模型。

　　实施例6

　　双盲验证集生物标记物的测试：

　　为了验证研究发现的这些支气管肺泡灌洗液的循环miRNAs作为肺癌诊断的指纹图谱，随后在133例样品中进行了双盲验证测试。这些支气管肺泡灌洗液样品包括来自48例肺腺癌病人，32例肺鳞癌病人，18例肺小细胞肺癌病人，1例肺腺鳞癌病人，2例大细胞神经内分泌癌病人，3例肺癌(亚型未知)病人以及29例阴性对照的样品。

　　实施例7

　　荧光定量PCR检测

　　参考CN10267663A公开的方法检测小RNA。

　　在15毫升的离心管中加入24微升实施例3得到的反转录产物，600微升的荧光定量PCR酶反应液(翔琼公司产品编号：9000008，2xUniversal qPCR Master MixHigh Rox)，216微升去核酸酶超纯水(翔琼公司产品编号：9000015)，轻柔混匀。

　　将翔琼公司生产的支气管肺泡灌洗液诊断用小RNA反应模板，SharpvueTMHumanmiRNA Array-胸水(翔琼公司产品编号：1100001)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(Thermo、ST16R，转头型号：M-20)。共93个小RNA反应液，反应模板上有2个阳性对照和1个空白对照。小心解开封膜。

　　将前述步骤得到的混合液倒入加样槽中，使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入到上述小RNA反应模板中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。

　　使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心5min。

　　放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃10min，后运行95℃5s，58℃1min，3个循环；之后95℃5s，60℃5s，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为SYBR，参比荧光设为Rox。

　　收集数据，进行生物信息学分析。

　　实施例8

　　miRNA生物统计数据的计算分析

　　通过支持向量机(support vector machine，简称SVM)来预测患者患癌的概率，支持向量机是一种分类算法，通过寻求结构化风险最小来提高学习机泛化能力，实现经验风险和置信范围的最小化，从而达到在统计样本量较少的情况下，亦能获得良好统计规律的目的，它是一种二类分类模型。

　　首先,利用实时荧光定量PCR对癌症和正常样品中的1888个miRNA和两个内参阳性对照(HSA-RNU6B和HSA-RNU48),以及一个阴性对照(水)进行检测，对1888个miRNA进行进一步的分析和筛选。确定了检测支气管肺泡灌洗液的miRNA panel(1块96孔板包含93个miRNA和3个内参)。每个miRNA的ct值和平均值被差减背景、归一化，统一数据ct值小于或等于32。

　　之后从96个miRNA中筛选出可以较好地区分癌症患者和非癌症患者的miRNA标记物。考虑到每个样本的miRNA加入量可能不一样，需要先对每个样本的miRNA测量值进行标准化，用每个样本两两miRNA检测值的差作为新的变量，这样当从96个miRNA中选出一个子集后，这个子集中数据的标准化将只与这个子集中的变量相关。标准化后共有C(96,2)+96＝4560个新变量。用T检验计算这些变量在癌症患者样本和非癌症患者样本之间的显著性，然后选取差异最显著的20个新变量。发明人最终希望找到数量12个以内的miRNA作为模型的变量，所以从这20个新变量包含的miRNA集合中选12个以内miRNA的所有组合，这些组合中用SVM模型计算出每种组合预测训练集的准确性。最终选出准确性最高的miRNA组合做为最终的变量集合M。

　　本发明的SVM模型来自R的e1071软件包，训练数据来自于医生确认的53个癌症患者和53癌症患者。模型训练过程中对照组和实验组样本数量差异一致，核函数选用径向基核函数(kernel＝"radial")，因为要预测概率，设置probability＝TRUE。用predict函数对样本是癌症和非癌症的概率进行预测，准确度的计算用留一交叉验证法(LLO-CV)。

　　由于液体活检样本miRNA数据的归一化问题一直有所争论，因此对所有支气管肺泡灌洗液中稳定表达的miRNAs做两两比的方法进行分析。每个miRNA的值与其他95个miRNAs做比，4560个比值被用于后续的生物信息分析以及和临床样本的生物学意义进行比较分析。而结果也表明，miRNAs比的使用视乎是一种易于应用的方法，具有一般临床应用的潜力，且避免了大规模、高通量筛选的需求，因此该方法也可用于开发指纹图谱作为临床液体活检的生物标志物。

　　miRNA的命名是根据miRBase Version 20的miRNA数据库，在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。

　　17个miRNA被选为特异性的在支气管肺泡灌洗液中诊断肺癌的生物标志物的结果如表2所示。

　　表2

　　实施例9

　　应用风险评估验证肺癌支气管肺泡灌洗液和阴性对照：

　　对实施例8中所选定的miRNA进行排列组合，筛选和测试出特异性、灵敏度和准确度均能达到临床检测水平最好miRNA组合。通过数据统计分析，找出10组最好的miRNA组合，结果发现将部分特异性miRNA进行组合后，能够有效地诊断出肺癌支气管肺泡灌洗液，其中灵敏度和特异性更优。其10组miRNA组合如表3所示。

　　表3

　　当选取SEQ ID NO.:1-8所示的序列组成的指纹图谱，可以很好的区分实验样本中的肺癌病人。这些变化最明显的miRNAs详见表格2，ROC曲线下面积(AUC)为0.919，其中准确度86.8％，特异性为88.7％。此外，对于68例中央型病人的支气管肺泡灌洗液样本(包括9例肺腺癌，14例肺鳞癌，3例肺小细胞癌，1例复合神经内分泌癌，3例未分型肺癌和38例阴性对照)进行预测分析，准确度可达85.3％，特异性为86.7％；38例周围型支气管肺泡灌洗液样本(18例肺腺癌，3例肺鳞癌，1例非小细胞肺癌，1例未分型肺癌和15例阴性对照)进行预测分析，准确度可达89.5％，特异性为82.6％(图-1)。

　　实施例10

　　对选取的miRNA变量进行双盲验证：

　　当选取SEQ ID NO.:1-8所示的序列时，对133例支气管肺泡灌洗液样本(48例肺腺癌，32例非鳞癌，18例肺小细胞癌，1例肺腺鳞癌，2例大细胞神经内分泌癌，3例未分型肺癌和29例阴性对照)进行双盲验证，从而判断所得miRNAs指纹图谱对于肺癌支气管肺泡灌洗液诊断的正确性。

　　为了验证这8个miRNAs组成的指纹图谱对于肺癌判断准确度和特异性，在133例样本中进行了双盲验证。测试结果显示，准确度可达85％，特异性为83.7％。84例中央型支气管肺泡灌洗液样本(包括17例肺腺癌，28例肺鳞癌，10例肺小细胞癌，1例神经内分泌癌，2例未分型肺癌和20例阴性对照)预测，准确度可达89.3％，特异性为85.9％；而49例周围型支气管肺泡灌洗液样品(31例肺腺癌，4例肺鳞癌，2例肺小细胞癌，1例肺腺鳞癌，1例大细胞神经内分泌癌，1例未分型肺癌和9例阴性对照)预测发现，准确度为77.6％，特异性为80％(图-2)。

　　结论

　　当选择SEQ ID NO.:1-8作为miRNA指纹图谱的组合时，能较好的诊断肺癌支气管肺泡灌洗液；而该miRNA指纹图谱的组合，可以很好的达到临床要求诊断肺癌；也可有效的诊断出周围型肺癌，且灵敏度和特异性较优。在此基础上，可见本发明miRNA指纹图谱能够非常高效地从支气管肺泡灌洗液中区分肺癌与良性。

　　在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

　　序列表

　　<110> 上海翔琼生物技术有限公司

　　<120> 小RNA组成的指纹图谱在肺癌的诊断和治疗中的应用

　　<130> P2018-0809

　　<160> 17

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 23

　　<212> RNA