噬血细胞综合征的高通量测序检测
技术领域
本发明属于血液病分子诊断学领域，具体涉及噬血细胞综合征的高通量测序检测。
背景技术
噬血细胞综合征(hemophagocytic syndrome，HPS)又称噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(Hemophagocytic Lymphohistiocytosis，HLH)，是一种由原发或继发性免疫异常导致的过度炎症反应综合征。其免疫调节异常主要由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞系统异常激活、增殖，分泌大量细胞因子而引起的一系列炎症反应。该病临床以持续发热、肝脾肿大、全血细胞减少以及骨髓、肝、脾、淋巴结组织发现噬血现象为主要特征。
2018年《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中指出，根据病因不同，噬血细胞综合征分为有特定遗传/基因缺陷的原发性HLH和由感染(如EB病毒感染)、肿瘤、自身免疫性疾病等引起的继发性HLH。
原发性HLH是由于患者体内基因某一位点或多位点突变从而导致免疫调节功能缺陷的一种疾病，多伴有常染色体或性染色体隐性遗传。原发性HLH根据缺陷基因的特点又可分为家族性HLH、免疫缺陷综合征相关HLH和EB病毒(EBV)驱动HLH。其中，家族性HLH共有5个亚型，包括FHL-1、FHL-2、FHL-3、FHL-4和FHL-5。FHL-1相关的缺陷基因及编码蛋白至今仍未被确定，而FHL-2至FHL-5则分别对应了PRF1、Unc13D、STX11及STXBP2基因及其相关编码的蛋白。目前，已确定多种基因缺陷与原发性HLH有关，如HPLH1基因、穿孔素基因(PRF1)、UNC13D基因、STX11基因、STXBP2基因等。而免疫缺陷综合征相关HLH则包括了Chediak-Higashi综合征(CHS，LYST基因突变)、Hermansky-Pudlak综合征HLH II型(AP3B1基因突变)、Griscelli综合征(GS)2型(RAB27A基因突变)、X连锁淋巴增殖性疾病(XLP)1型(SH2D1A基因突变)和2型(BIRC4基因突变)等疾病种类。在EBV驱动的HLH中，则包含了SH2D1A、BIRC4、ITK、MAGT1等基因的突变。
继发性HLH可出现于任何年龄阶段，其主要病因包括：(1)感染因素：如病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体及寄生虫等；(2)肿瘤性疾病：如淋巴瘤、白血病等；(3)风湿性疾病：如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化并、干燥综合征等。
HLH是一种潜在致死性综合征，源自淋巴细胞和巨噬细胞的异常活化，以淋巴细胞异常活化，持续免疫活性及高水平细胞因子为特征。其临床治疗需要精准的诊断进行辅助。在分子生物学发展日新月异的今天，临床分子诊断在疾病的治疗中越发扮演重要角色。在2018年《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中：1)所有确诊HLH的患者都应进行功能学检查，包括NK细胞活性和脱颗粒功能检测(NK细胞和CTL细胞膜ΔCD107a)，穿孔素、颗粒酶B、SAP、XIAP等与HLH缺陷基因相对应的蛋白表达量的检测。对于检测结果存在明确异常的患者应及时送检基因测序。2)发病年龄≤2岁的患者，应送检基因测序。3)未找到明确病因的患者，应送检基因测序。4)反复发作的患者，应送检基因测序。并且共识中列出了12个检测基因清单：PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、Rab27a、LYST、SH2D1A、BIRC4、ITK、AP3B1、MAGT1、CD27，但由于目前学科发展迅速，共识中的基因清单已经不能完全满足目前临床对于HLH基因诊断的需求。
二代测序技术是一种基于基因芯片的大批量检测基因序列或者基因表达量等信息的技术，目前该技术已广泛渗透到临床及科研领域当中，并占据重要位置。与传统的一代测序及荧光定量PCR检测相比，二代测序通量大，单位点检测成本低，可以在一次实验中同时检测大批量基因。目前，虽然已经有少数基于二代测序技术对HLH疾病进行诊断的基因PANEL试剂盒，但基本上都存在着检测不全面的问题，甚至部分基因panel中检测基因数量少于《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中推荐的12个基因，这极大的影响了相关疾病的诊断和治疗。此外，目前市场上的基因Panel均未全面涉及到穿孔素颗粒酶通路相关的基因，而该通路与噬血细胞综合征有着重要相关性，如果不能全面检测穿孔素颗粒酶相关基因，则影响对噬血细胞综合征的精确诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因组合及其检测引物库在构建检测噬血细胞综合征的高通测序文库中的应用，通过对构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，可为噬血细胞综合征等疾病的诊断及治疗提供依据。
本发明的一方面提供基因组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG。
在一些实施方案中，所述基因组合用于制备能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合，所述能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合用于构建检测嗜血细胞综合征的高通量测序文库。
因此，本发明的另一方面提供能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合在构建检测嗜血细胞综合征的高通量测序文库中的应用。
在一些实施方案中，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQ ID NO:1-SEQID NO:678)。
表1 339对引物序列
本发明的另一方面提供引物组合，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQID NO:1-SEQ ID NO:678)。
本发明的另一方面提供构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以待测DNA为模板，使用能够特异性检测上述基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物；
(2)向步骤(1)获得的混合物添加NGS测序标签，然后在两端连接测序所需的接头，利用磁珠进行纯化，获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即获得高通量测序文库。
在一些实施方案中，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQ ID NO:1-SEQID NO:678)。
在一些实施方案中，多重PCR反应的程序是：99℃保持2分钟；19个循环，每个循环99℃15秒，60℃2分钟；10℃保持。
在一些实施方案中，所述待测DNA是从骨髓或外周血中提取的基因组DNA。
本发明的另一方面提供检测噬血细胞综合征的高通量测序文库，所述文库是通过上述方法获得的文库。
本发明的另一方面提供能够特异性检测上述基因组合的引物组合或探针组合在制备噬血细胞综合征诊断试剂或噬血细胞综合征诊断试剂盒中的应用。
本发明的另一方面提供上述基因组合、上述引物组合或上述高通量测序文库在制备噬血细胞综合征诊断试剂或噬血细胞综合征诊断试剂盒中的应用。
本发明的另一方面提供噬血细胞综合征诊断试剂盒，其包含上述引物组合。
本发明的有益效果在于：
(1)利用本发明的基因组合可以对HLH进行全面检测，包括穿孔素颗粒酶及免疫缺陷相关基因检测。其保证了疾病相关突变位点的检测率，降低了假阴性率的发生。同时，基于26个基因的组合开发的试剂盒是对于目前市场上同类产品的一种完善，具有更高的阳性检出率，并且能更全面地检测噬血细胞综合征中的穿孔素颗粒酶及免疫缺陷相关基因突变情况。使用本发明的引物组合对本发明的基因组合扩增的效率均一性能达到95％左右，保证了测序数据的高利用率。
(2)低起始量的同时能检测广泛位点：本发明采用多重PCR法构建文库，其优点在于，相比于传统的Taqman-qPCR法检测突变，多重PCR法能一次性检测几百、上千个片段及相关位点，具有传统PCR及ddPCR无法达到的通量。此外，多重PCR法构建DNA文库，仅需要最低1ng的DNA起始量，与杂交捕获法构建NGS DNA文库相比，该方法大大降低了DNA的量的需求。在进行现有的SNV、indel检测中该方法尤其适用。
(3)灵敏度高：采用中等深度测序(2000×)，结合FalseFilter生信算法，可以精确地检测到1％以上的真实突变，有效地过滤掉测序本身产生的错误突变。
(4)实用性强：本发明涉及的26个基因，是在噬血细胞综合征专家共识中给定的12个基因基础上，结合现有文献报道及基于自主积累的数据库数据挖掘后，扩充的26个基因。
(5)本发明的339对引物混合在一个体系中，引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。
附图说明
图1是两步法多重PCR原理示意图：gDNA经过由多对PCR引物组合的扩增后，得到含有大量目标DNA碱基片段的初始文库，通过将测序仪测序所需识别的起始接头序列1、2连接到个片段两端后，进一步通过PCR进行目标DNA文库的富集，最终形成最后的文库后，即可进行测序。
图2是测序质控图，其中测序芯片磁珠入孔效率达到80％。
图3是测序质控图，其中芯片小孔中的多克隆文库比例为24％。
具体实施方式
本发明人通过对国人噬血细胞综合征样本的全外显子基因检测得到的数据进行深度挖掘分析后，得到与噬血细胞综合征及穿孔素颗粒酶缺陷相关的GZMB、GNLY、ARF6、SRGN 4个基因相关位点突变；以及与免疫相关的CARD11、MCM4、CTPS11、PRKCD 4个基因相关位点突变，这8个基因未被目前的国内诊疗共识所收录。发明人将这个8个基因加入到本发明的基因组合中，融合成包括26个基因在内的基因组合，建立了一种HLH相关基因的二代测序检测技术，可以一次性、全面地检测HLH相关致病突变位点及HLH相关穿孔素颗粒酶基因、免疫相关基因缺陷相关位点，辅助临床诊断及治疗。本发明的基因组合中所包括的基因均具备明确的临床意义，旨在降低无效数据及模糊测序结果对疾病诊疗造成的干扰，同时节约整体实验成本。
本发明中，噬血细胞综合征(hemophagocytic syndrome，HPS)又称噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(Hemophagocytic Lymphohistiocytosis，HLH)，是一种由原发或继发性免疫异常导致的过度炎症反应综合征。其免疫调节异常主要由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞系统异常激活、增殖，分泌大量细胞因子而引起的一系列炎症反应。该病临床以持续发热、肝脾肿大、全血细胞减少以及骨髓、肝、脾、淋巴结组织发现噬血现象为主要特征。
本发明中，本发明的基因组合包括但不限于所述的26个基因(即GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG)。包含该26个基因以及其他与噬血细胞综合征相关基因的基因组合也在本发明的保护范围之内。在一些实施方案中，本发明的基因组合由该26个基因组成。所述26个基因名称、其转录本的GenBank编号以及涉及的功能/通路信息如表2所示。
表2 26个基因的信息
本发明中所述的基因组合所包括的基因的名称及其NCBI GenBank编号在表2中列出。
本发明的基因组合用于构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库时，可以设计能够特异性扩增基因组合中所包括的基因的外显子区域或热点区域的引物或探针，利用这些引物或探针构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库。
利用本发明的基因组合，可以设计针对所述基因组合所包括的基因的特异性引物，对从样本中提取的DNA进行多重PCR，在PCR产物上添加NGS测序标签和接头，扩增后获得高通量测序文库。所述特异性引物可以是能够特异性扩增所述基因组合所包括的基因的外显子区域或热点区域的引物。
还可以利用本发明的基因组合设计针对所述基因组合的特异性探针，将从样本中提取的DNA片段化，进行末端修复，并在每个DNA片段上添加NGS测序标签和接头，扩增DNA片段，富集与所述探针杂交的DNA片段，获得高通量测序文库。所述特异性探针可以是能够特异性杂交所述基因组合所包括的基因的外显子区域或热点区域的探针。
本发明还涉及构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以待测DNA为模板，使用能够特异性检测所述基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物；
(2)向步骤(1)获得的混合物添加NGS测序标签，然后在两端连接测序所需的接头，利用磁珠进行纯化，获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即获得高通量测序文库。
在一些实施方案中，多重PCR反应的程序是：99℃保持2分钟；19个循环，每个循环99℃15秒，60℃2分钟；10℃保持。
待测DNA可以是基因组DNA(gDNA)，优选是从骨髓或外周血等样本中提取的基因组DNA。基因组DNA的提取方法是本领域技术人员熟知的，可以采用商购的试剂盒，优选Qiagen相应的DNA提取试剂盒。并可以结合Nanodrop、Qubit等仪器进行提取后DNA浓度及质量监控。
待测DNA可以是来自多个样本的DNA，例如来自多个样本的基因组DNA，如来自不同受试者的基因组DNA。当目标DNA为来自多个样本的DNA时，为每个样本的DNA片段添加不同的NGS测序标签，以区分不同的样本。
本发明中所述的“多重PCR”是指在一个反应体系中将模板DNA与多对引物混合，使用相同的反应条件进行PCR扩增反应。多重PCR是本领域技术人员熟知技术，主要的反应组分包括模板DNA、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。多重PCR反应所使用的设备以及反应参数是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重PCR方法。多重PCR所使用的试剂，优选采用商业试剂，如Life tech公司的《Ampliseq Librarykit》。
本发明中的“NGS测序标签”即index，可以采用Illumina通用index序列。本发明中“接头”，可以采用Illumina对应接头序列。上述文库构建方法获得的最终文库结构可以是TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-XXXXXXX-AAAAAAAAAA-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC，其中，第一部分以及最后一部分碱基序列为Illumina测序所需的两端接头碱基序列，“XXXXXXXX”为不同序列的index，用以区分不同样本的DNA数据，“AAAAAAA”为PCR产物，其长度在150bp左右。接头序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它Illumina对应接头序列。接头序列可以是Illumina的测序通用接头，也可以是Life tech的测序接头，如采用Life tech的接头，后续测序及分析流程与Life tech相应的流程一致。
本发明提供特别优选的引物组合以及该引物组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用。优选地，所述引物组合包括但不限于339对引物(见表1，即SEQID NO:1-SEQ ID NO:678)，这些引物能够扩增上述26个基因的外显子区域或热点区域，每对引物对应的产物长度均在100～200bp之间。在一些实施方案中，本发明的引物组合由表1所示的339对引物(即SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:678)组成。因此，该26个基因的339对引物经过了引物及引物之间的错配评估及实验验证，将导致错配发生的引物去除并引入新的不会导致引物间错配的引物序列，保证了基因组合的高检测质量。表1所述的339对引物(即SEQID NO:1-SEQ ID NO:678)混合在一个体系中，引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。除了表1所述的339对引物之外，本发明的引物组合还可以包含其他引物，所述其他引物可以是针对其他噬血细胞综合征相关基因的引物，也可以是针对本发明所述的26个基因中的任一个或任几个的引物。当所述其他引物与表1所述的339对引物混合在一个体系中时，应当满足以下条件：引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证每个特异性目的片段均能正常扩增。
本发明还涉及通过上述方法构建获得的高通量测序文库。通过对所构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，可以寻找到致病突变，明确疾病分型、用药或预后情况，为临床诊断和精准用药提供依据。对文库进行测序时，测序仪可以采用Life tech平台配套仪器(Ion PGM)。测序过程中对各个DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成fastq/BAM等数据文件。测序深度平均在2000×左右，保证低比例突变能被有效地检测到。本发明可以兼容多种Illumina测序仪，包括从Miseq、Hiseq到Novaseq等等。同时，针对life公司的测序仪，本发明可适用于PGM、Proton、S5三个不同平台的life公司测序仪。对得到的数据进行分析的示例性具体过程为：
a)原始数据经过index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用BWA软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据；
b)利用Samtools及GATK等软件，对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的SNP及indel信息；
c)利用FalseFilter生信软件进行假阳性位点筛除，得到一份含有真实突变信息的文件(VCF文件)。
d)利用上述获得目标片段中的基因突变(SNV)及微小插入/缺失突变(indel)数据，通过ANNOVAR、Clinvar、dbSNP、COSMIC、HGMD等软件及数据库进行突变的解读。
对数据进行分析，包括但不限于不同样本的数据拆分、数据质量控制(Q30)、SNPcall、Coverage analysis等等部分，可以使用商业化的软件或自主开发的相关软件进行分析。
本发明的基因组合、引物组合或高通量测序文库可用于制备噬血细胞综合征诊断试剂。所述噬血细胞综合征诊断试剂优选是噬血细胞综合征高通量测序诊断试剂，即通过高通量测序诊断噬血细胞综合征的试剂，例如所述试剂可以是用于通过高通量测序和数据分析获得上述基因组合的外显子区域和/或热点区域的突变情况，从而诊断噬血细胞综合征的试剂。
本发明的基因组合、引物组合或高通量测序文库可用于制备噬血细胞综合征诊断试剂盒。所述噬血细胞综合征诊断试剂盒优选是噬血细胞综合征高通量测序诊断试剂盒，其中包含通过高通量测序诊断噬血细胞综合征的试剂，例如所述试剂可以包括用于通过高通量测序和数据分析获得上述基因组合的外显子区域和/或热点区域的突变情况，从而诊断噬血细胞综合征。
例如，所述试剂盒中可以包含能够特异性检测本发明的基因组合的引物组合。在一些实施方案中，所述引物组合包含表1所示的引物(即SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:678)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含进行多重PCR反应所需的一种多种其它试剂。多重PCR是本领域中已知的技术，主要的反应组分包括模板DNA、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。多重PCR反应所使用的设备以及反应参数是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重PCR方法。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包含用于处理多重PCR扩增产物以使得该扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。多重PCR扩增产物通常需要进行处理，例如，末端修复，连接接头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
本发明中，术语“诊断”包括鉴定、确认和/或表征噬血细胞综合征的存在或不存在，及其发展阶段。
本发明利用多重PCR方法进行高通量测序文库的构建，但不仅限于该方法，例如杂交捕获等其它方法进行的文库构建同样归属于本发明范围内。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
实施例1
通过检索国内外各大权威数据库(包括COSMIC、NCBI等等数据库)，并结合权威期刊杂志进行基因组合信息的第一步收集。同时，对自主检测得到的数据进行深度分析，通过精准临床分型以及基因通路分型进行基因归类，通过检出率以及Q30等质控数据进行突变位点的数据过滤，得到一批过滤剩下后的基因组合，并与第一步的基因组合进行并集处理，最终整理得到26个基因的基因组合。该基因组合除涵盖目前权威杂志上几乎所有噬血细胞综合征相关基因以外，还包括了国人的热点突变基因以及现有技术未报道的与穿孔素颗粒酶缺陷及免疫缺陷相关的基因，涵盖了噬血细胞综合征从分型到预后所有层面的相关基因位点，具有非常强的临床指导意义。所涉及的26个基因的信息见表3。
针对这26个基因的外显子区域或热点区域，进行多重PCR引物设计，通过进行引物与引物、引物与模板之间的非特异性结合概率计算来选取非特异性最低的引物组合，着重避免引物末端出现的非特异性结合情况的出现。同时，设计引物时需要考虑每对引物对应扩增产物的长度在100～200bp之间，保证了设计的引物所扩增得到的最终产物能有效的进行后续的测序反应。所设计的339对引物的信息见表1。将所设计的引物合成后，混合成引物库。
实施例2
一、样本DNA的提取
采用商业化的血液样本DNA提取试剂盒(天根生物，血液基因组DNA提取系统(0.1-20ml)，DP319)，将样本的外周血提取成DNA溶液，按说明书进行操作。采用Nonodrop测定DNA260/230质量，利用Qubit仪器检测DNA浓度。
二、DNA多重PCR文库制备
利用步骤一中得到的DNA样本和实施例1中获得的引物库进行建库，使用Lifetech公司的《Ampliseq Library kit》，按说明书进行操作，具体步骤如下：
1)将DNA按照如下体系配制：
备注：Y为15ng DNA所需加入的液体体积。
2)将上述加入DNA的反应液放入到热循环仪中按照如下程序进行反应：
3)将2μL fuPa溶液加入到上述得到的PCR反应液，混匀后放置于热循环仪中进行如下反应：
4)上述反应结束后，按照如下配方进行下一步反应液配制，其中稀释特异性标签混合液中含有接头：
5)将上述反应液放置于热循环仪中进行如下反应：
6)上述反应结束后，按如下步骤进行纯化：
a.打开PCR管或96孔板薄膜，每孔加60μL(2X样本体积)AMPure XP磁珠，移液器上下吹打5次，将DNA和磁珠充分混匀。
b.混合液室温孵育5分钟。
c.将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心去除上清，不要扰动磁珠。
d.每管加150μL新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。
e.重复步骤d一次。
f.确保所有乙醇被除尽，PCR管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。
7)待酒精完全干燥后，打开PCR管或96孔板薄膜，每孔加25μL高保真PlatinumPCR超级混合液，1μL文库扩增引物。高保真Platinum PCR超级混合液和文库扩增引物可以提前混匀。
8)将混合液放置于热循环仪上，进行如下反应：
9)每管加12.5μL(0.5X样本体积)AMPure XP磁珠，每管大约25μL样本。盖上PCR管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。
10)室温孵育5分钟。
11)将PCR管或96孔板放到磁力架上，至少5分钟，直到溶液澄清。
12)紧接着上面步骤，每管加30μL(1.2X样本体积)AMPure XP磁珠，每管大约25μL样本。盖上PCR管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。
13)混合液室温孵育5分钟。
14)将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心去除上清，不要扰动磁珠。
15)每管加150μL新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。
16)重复步骤15)一次。
17)确保所有乙醇被除尽，PCR管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。
18)各PCR管或96孔板每孔加25μL去核酸水溶解AMPure XP磁珠，盖上PCR管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。
19)将PCR管或96孔板放到磁力架上，至少2分钟，直到溶液澄清。小心吸取上清20μL，上清即文库，做好标记。
20)将上述文库进行Qubit仪器质控检测，并记录浓度。浓度低于0.2ng/μL的文库视为不合格文库。
三、文库测序
将上述文库按life tech公司的PGM测序准备流程操作并进行测序。
四、数据分析
a)原始总数据经过机器拆分后，得到样本的原始测序数据。
b)利用BWA软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据。
c)利用Samtools对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的SNP及indel信息。
d)利用FalseFliter进行假阳性突变的过滤，生成最终的VCF文件。
e)通过ANNOVAR软件进行上述SNP及indel进行注释，并结合Clinvar、Cosmic、PubMed等数据库整理突变意义信息。
测序结果如图2、3以及表3、4所示。图2显示测序芯片磁珠入孔效率达到80％，远大于life tech公司给的最低质控阈值60％。图3显示芯片小孔中的多克隆文库比例为24％(低于35％，符合质控要求)，低质量测序数据(Low Quality)仅4％。表3显示了各个样本均一性、深度数据。表4显示了下机的各样本Q20质控数据以及文库的平均长度。
表3样本均一性和测序深度数据
表4样本Q20质控数据以及文库的平均长度
上述结果中，各质控数据均远高于质控阈值，表明利用实施例1获得的引物库能进行良好的建库及测序实验。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
