基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法及系统
技术领域
本发明涉及一种基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法及系统，属于飞秒激光应用技术领域。
背景技术
蛋白质等大分子有机物的结晶在结构分析、生物制药、高分子材料的制造与应用等领域有着重要的作用，对于蛋白质的可控的结晶在科研和实际应用中都有重要的意义。例如在分析蛋白质结构时，一种重要的方法，X射线衍射需要利用大尺度的、高品质的单晶。传统蛋白质结晶方法主要通过对于结晶环境温度、湿度等的控制，获得理想的结晶效果，而这种方法面临的一个关键问题是，在溶液中常常会同时形成大量晶核而难以得到高品质的单晶，因此需要通过一些辅助的成核方式，实现在溶液还没有发生自发结晶时，利用例如超声、激光等外界激励方式，可控地形成少量晶核，从而获得质量较高的单晶。
飞秒激光由于其脉冲作用时间超短，峰值功率极高，与材料作用是一个非线性、非平衡过程，在材料加工领域有广泛的应用。而飞秒激光的电子动态调控机理是一种新兴的微纳米制造技术，它主要的内容是，通过对于飞秒激光脉冲进行时空整形，即改变激光的能量、相位、偏振等在时域、空域上的分布，实现在激光作用过程中对于材料表面局域电子激发、自由电子密度演化等的调控，从而实现传统激光加工无法实现的加工效果。例如专利基于电子动态调控的三维周期结构加工方法(申请号201310706949.9)，是一种飞秒激光的时域整形方法，该方法通过将一个飞秒激光脉冲分为多个延时在30-200fs的子脉冲，调控局部瞬态电子动态，在固体材料表面实现了传统单脉冲激光加工无法实现的三维圆锥状周期结构。但目前电子动态调控方法及其参数仅适用于固体表面加工，还没有被用于溶液中蛋白质结晶相关研究。
飞秒激光加工技术及电子动态调控技术具有高精度、高能量沉积效率、对材料热损伤区域较小等特点，因此飞秒激光对于生物材料，例如蛋白质等作用时，可以避免或减少热损伤，有着独特的优势，因此得到了广泛的研究。现有的一些方法通过飞秒激光作用于蛋白质或者聚合物的过饱和溶液中调控其成核过程，是飞秒激光调控结晶的一种重要尝试，例如专利结晶核的制造方法及结晶条件的筛选方法(申请号03820509.2)中描述了一种利用脉宽为飞秒到皮秒的激光作用于溶液，通过在激光焦点处溶液局部爆炸的现象生成晶核，但目前这方面的方法由于没有应用电子动态调控的机理，没有对飞秒激光进行时空整形，因此可以调节的参数较为有限，通常通过调节激光的能量、个数等，如使用单脉冲能量大于1.95nJ的单脉冲或时间间隔远大于10ps(即远大于电子弛豫时间，多个脉冲的作用过程可视为独立的)的多个脉冲，通过热力学的原理影响成核过程，调控结果完全由能量沉积决定，考虑到蛋白质材料本身容易受到材料的烧蚀或蛋白质变性的温度阈值限制，在能量选择范围上较小，因此通过调控能量实现可控结晶的能力有限。
发明内容
本发明的目的是实现对于蛋白质的形核过程的调控，提出一种基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法，利用时空整形的飞秒激光脉冲，在避免或减少对材料热损伤的情况下，通过包括但不限于热力学效应、激光的电磁场作用等机理，实现对于溶液中结晶形核过程的调控。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提出的一种基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法，其特征在于：通过以下步骤实现：
S1配制蛋白质过饱和溶液和结晶所需池液；确定待结晶蛋白质的烧蚀阈值和变性阈值；
S2参数设计，具体包括：
S21飞秒激光脉冲序列参数设计：根据待结晶蛋白质的烧蚀阈值和变性阈值选择飞秒激光脉冲序列的单脉冲能量和脉冲个数；其中，所述单脉冲能量小于待结晶蛋白质的烧蚀阈值；所述脉冲个数满足：多个脉冲能量沉积导致的局部温度升高小于待结晶蛋白质的变性阈值；
S22电子动态调控参数设计：根据所需结晶结果选择电子动态调控方式，若用于调控蛋白质晶体的数量和大小时，选择时域整形方式，将单脉冲整形调制为由2～5个子脉冲组成的子脉冲序列，相邻子脉冲之间的时间间隔为100fs-10ps，执行步骤S3；若用于调控蛋白质晶体位置时，选择空域整形方式，根据所需结晶位置设置单脉冲的聚焦区域在待结晶蛋白质上的空间分布，执行步骤S3；
S3利用步骤S2设计的参数产生基于电子动态调控的飞秒激光脉冲序列，将该飞秒激光脉冲序列聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中；
S4将飞秒激光脉冲序列处理后的蛋白质过饱和溶液置于步骤S1配置的池液环境中，在室温条件下密封静置，得到蛋白质晶体。
本发明还提出一种如上述基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法的系统，其特征在于，该系统包括共光轴依次设置的飞秒激光光源、中性密度衰减片和机械快门，通过该机械快门控制的飞秒激光通过第一反射镜射入时域整形单元，用于产生设定延时的多个子脉冲飞秒激光，该多个子脉冲飞秒激光经第二反射镜后通过位于该反射镜一侧的显微物镜聚焦于平移台上放置的蛋白质过饱和溶液形成空气击穿，并由位于该平移台一侧的侧面成像单元进行成像，第二反射镜另一侧设有与所述显微物镜共光轴的正面成像单元；其中，所述时域整形单元采用迈克尔逊干涉仪或脉冲整形器；所述正面成像单元由共光轴设置的第一电荷耦合元件和成像透镜构成；所述侧面成像单元采用带镜头和照明光源的第二电荷耦合元件，通过所述正面成像单元和侧面成像单元分别找到空气击穿点。
本发明还提出另一种如上述基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质形核方法的系统，其特征在于，该系统包括共光轴依次设置的飞秒激光光源、中性密度衰减片和机械快门，通过该机械快门控制的飞秒激光依次通过第一反射镜和第二反射镜射入空域整形单元，用于改变激光聚焦区域在待结晶蛋白质上的空间的分布，经第三反射镜后通过位于该反射镜一侧的显微物镜聚焦于平移台上放置的蛋白质过饱和溶液，并由位于该平移台一侧的侧面成像单元进行成像，第三反射镜另一侧设有与所述显微物镜共光轴的正面成像单元；其中，所述空域整形单元由锥透镜和位于激光经过该锥透镜后形成的无衍射区域内的平凸透镜构成；所述正面成像单元由共光轴设置的第一电荷耦合元件和成像透镜构成；所述侧面成像单元采用带镜头和照明光源的第二电荷耦合元件，通过所述正面成像单元和侧面成像单元分别找到空气击穿点。
本发明的特点及有益效果：
1、相对于传统结晶形核方式，能够有效控制蛋白质晶核产生的位置、数量、以及晶核生长后的大小等参数；
2、利用时域整形的飞秒脉冲激光，相对于现有激光诱导形核方法，能够调控溶液中沉积能量与光强的关系，得到更高的诱导形核效率，实现更低脉冲能量下的诱导成核，从而能够进一步避免或减少对目标结晶物质的热损伤；
3、利用空域整形的飞秒脉冲激光，相对于现有激光诱导形核方法，能够实现过去不能实现的对于晶核产生的位置等参数的调控。
附图说明
图1为本发明实施例1、实施例2和实施例3所采用的双脉冲飞秒激光序列示意图。
图2为本发明实施例1、实施例2和实施例3所采用的双脉冲时间整形光路示意图。
图3为本发明实施例1和实施例2和实施例3所获得的结晶结果与现有结晶方法结果对比图。
图4为本发明实施例4所采用的贝塞尔飞秒激光序列示意图。
图5为本发明实施例4所采用的贝塞尔空域整形光路示意图。
图6为本发明实施例4所获得的形核结果与传统结晶形核方法结果对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案进一步详细说明。
本发明提出的一种基于电子动态调控的飞秒激光辅助结晶形核方法，包括以下步骤：
S1配制蛋白质过饱和溶液和结晶所需池液；确定待结晶蛋白质的烧蚀阈值和变性阈值，其中，烧蚀阈值通过改变激光能量观察是否烧蚀蛋白质晶体来确定，或直接通过查阅已有文献获得；变性阈值选取蛋白质的变性温度(一般为70℃)，或查阅已有文献获得；
S2参数设计，具体包括：
S21飞秒激光脉冲序列参数设计：根据待结晶蛋白质的烧蚀阈值和变性阈值选择飞秒激光脉冲序列的单脉冲能量和脉冲个数；其中，单脉冲能量小于待结晶蛋白质的烧蚀阈值，即飞秒激光脉冲序列单脉冲的最大功率为单脉冲的待结晶蛋白质烧蚀阈值乘以脉冲重复频率；脉冲个数满足：多个脉冲能量沉积导致的局部温度升高小于待结晶蛋白质的变性阈值，利用热力学关系和传热学模型，根据激光聚焦后的焦斑大小、扫描方式等参数计算激光功率与局部温度变化的关系，从而确定保持待结晶蛋白质局部升温小于变性温度的激光最大功率；
S22电子动态调控参数设计：根据所需结晶结果选择电子动态调控方式，若用于调控蛋白质晶体的数量和大小时，选择时域整形方式，将单脉冲整形调制为由2～5个子脉冲组成的子脉冲序列，相邻子脉冲之间的时间间隔为100fs-10ps(与材料中电子弛豫时间可比，远小于传统的重复激光脉冲间隔)，执行步骤S3；若用于调控蛋白质晶体位置时，选择空域整形方式，根据所需结晶位置选择激光聚焦区域在空间的分布，执行步骤S3；
S3利用步骤S2设计的参数产生基于电子动态调控的飞秒激光脉冲序列，将该飞秒激光脉冲序列聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中；
S4将飞秒激光脉冲序列处理后的蛋白质过饱和溶液置于步骤S1配置的池液环境中，在室温条件下密封静置，得到蛋白质晶体。
下面结合附图以及实例对本发明作进一步的介绍，以时空整形的飞秒激光辅助鸡蛋白溶菌酶结晶成核为例，实施例中涉及的器件和原料如下：
飞秒激光器采用中心波长为800nm的钛蓝宝石飞秒激光器，其他飞秒激光器，包括波长为1035nm的光纤激光器等飞秒激光器，应也有类似的辅助结晶形核效果。
所采用的时空整形，包括使用迈克尔逊干涉仪系统产生双脉冲、使用锥透镜产生贝塞尔光束。其他时空整形的方式，包括使用脉冲整形器、空间光调制器等仪器产生的光强、相位、偏振在时间、空间上的不同分布，应也有类似的辅助结晶形核的效果。
结晶的原料为购买自Sigma-Ardrich的鸡蛋白溶菌酶粉末。其它蛋白质类物质，应也有类似的结晶形核效果。
实施例1：本实施例基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质结晶形核方法，采用时域整形方式调控蛋白质晶体的数量和大小，包括以下步骤：
S1配制蛋白质过饱和溶液和结晶所需池液，其中过饱和溶液采用鸡蛋白溶菌酶粉末24mg/ml，氯化钠晶体2.5％wt，醋酸钠晶体0.1M(摩尔浓度)；结晶所用池液采用10％wt氯化钠溶液。通过查阅相关文献得到，鸡蛋白溶菌酶的烧蚀阈值约为每个脉冲0.2μJ，变性温度Tmax约为70℃。
S2参数设计，具体包括：
S21飞秒激光脉冲序列参数设计：本实施例中考虑蛋白质为鸡蛋白溶菌酶，变性温度在70℃左右。本实施例考虑激光作用于一点的情况，在溶液中达到热平衡状态下的传热方程积分后得到激光聚焦位置处温度T1和激光功率P1的关系，计算公式为：
T1＝P1/(4π×k×r)+Tatm
其中，r0为激光聚焦光斑直径，本实施例通过5倍物镜后的激光聚焦区域近似为一个直径为7μm的球形区域；Tatm为室温，取20℃(293K)；k为水的热导率系数，取0.6Wm-1K-1；因此得到最大的功率为：
Pmax＝(Tmax-Tatm)×4π×k×r＝0.25mW
根据选定的鸡蛋白溶菌酶烧蚀阈值为0.2μJ每个脉冲，则在1kHz重复频率下功率为0.2mW。
本实施例的飞秒激光光源采用相干公司(Coherent)的钛蓝宝石激光器，中心波长800nm，脉冲宽度35fs，重复频率最高1kHz，光强分布为高斯型，根据上述选定的烧蚀阈值和变性温度的计算结果，选取功率0.1mW，脉冲重频1kHz，单脉冲能量0.1μJ，作用1s，即1000个脉冲。
S22电子动态调控参数设计：本实施例采用时域整形方式，将单脉冲整形调制为由2个子脉冲组成的子脉冲序列，相邻子脉冲之间的时间间隔为200fs，如图1所示，其中横轴表示时间，纵轴表示瞬时功率，t1为脉宽，t2为通过时间整形将一个脉冲分成的两个子脉冲之间的时间间隔，t3为激光器发射的飞秒激光脉冲序列中相邻两个脉冲的时间间隔。t1，t3只与激光器参数有关，t1为35fs，t3为1ms，t2为时间整形的参数，本实施例中采用的子脉冲之间的时间间隔t2取为200fs；然后执行步骤S3。
S3利用步骤S2设计的参数产生基于电子动态调控的时域整形飞秒激光脉冲序列，将该飞秒激光脉冲序列聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中。具体实现过程如下：
S31、搭建飞秒激光系统并进行光路校准，本实施例采用如图2所示的飞秒激光系统，该飞秒激光系统包括共光轴依次设置的飞秒激光光源1、中性密度衰减片2和机械快门3，通过该机械快门3控制的飞秒激光通过反射镜4射入时域整形单元21，用于产生设定延时的多个子脉冲飞秒激光，该多个子脉冲飞秒激光经反射镜8后通过位于该反射镜8一侧的10倍物镜9聚焦于平移台11上放置的蛋白质过饱和溶液10，并由位于平移台11一侧的侧面成像单元17进行成像，反射镜8另一侧设有与10倍物镜9共光轴的正面成像单元16；其中，飞秒激光光源1，用于产生飞秒激光；中性密度衰减片2，用于调节激光能量；机械快门3，用于控制脉冲个数；反射镜4和反射镜8，均用于引导光路和调节光路准直；10倍物镜9，用于聚焦激光光束；时域整形单元21，采用迈克尔逊干涉仪(可替换为脉冲整形器或其它仪器达到类似效果，采用脉冲整形器时至多可产生确定延时的5个子脉冲)，用于产生确定延时的双子脉冲，由分束镜18、反射镜19和可以延光线方向运动的在一维平移台上的反射镜20构成，具体产生确定延时的双子脉冲的方法为：先在时域整形单元21之后加白屏(只校准用，光路图中未示意出)，打开机械快门3，调节一维平移台上的反射镜20，当白屏上出现清晰稳定的干涉条纹时，为双子脉冲时间间隔t2为0的时间零点，再通过调节一维平移台上的反射镜20，改变反射光的光程，从而改变双脉冲延时，一维平移台移动距离取c×t2/2，其中c为空气中光速，取3×108m/s，本实施例中t2＝200fs，取一维平移台的移动距离为30μm；正面成像单元16，由共光轴设置的电荷耦合元件(CCD)13和成像透镜14构成；侧面成像单元17，采用带镜头和照明光源的电荷耦合元件(CCD)12；图2中所示实线为飞秒激光光线，点划线为成像单元光线。飞秒激光系统搭建完成后进行光路校准，单脉冲能量20μJ，重复频率1kHz，通过10倍物镜9聚焦出现空气击穿现象，在侧面成像单元17和正面成像单元16观察到的视野中，分别找到空气击穿点，标记为激光焦点位置，用于后续步骤中通过成像光路中将激光焦点聚焦于溶液中。
S32将产生的飞秒激光脉冲序列聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中：取步骤S1中所配蛋白质过饱和溶液，用移液枪每次取20μL，滴在96孔板的盖板上不同位置，将盖板置于平移台11上样品10的位置。通过正面成像单元16和侧面成像单元17的成像光路，调节平移台11位置，使成像系统中的液滴位置与步骤S31中在成像系统中标记的激光焦点重合，从而使激光聚焦于液滴内部，通过调节中性密度衰减片2改变到达10倍物镜9的激光能量如步骤S21中所列，利用机械快门3控制脉冲个数(快门打开时间等于设定的脉冲数除以重复频率)如步骤S21中所列；
S4将飞秒激光脉冲序列处理后的蛋白质过饱和溶液置于步骤S1配置的池液环境中，在室温条件下密封静置，得到蛋白质晶体。本实施例采用移液枪各取100μL池液，滴在96孔板对应的孔中，盖上滴有经步骤S32作用的待结晶蛋白质过饱和溶液的盖板，密封后在20℃环境中静置12小时，形成蛋白质晶体。
实施例2：
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤S22中，相邻子脉冲之间的时间间隔t2为1ps，由此，步骤S31中用于移动反射镜20的一维平移台的移动距离为150μm。其余步骤均与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例3：
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤S22中，相邻子脉冲之间的时间间隔t2为10ps，由此，步骤S31中用于移动反射镜20的一维平移台的移动距离为1500μm。其余步骤均与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例1～实施例3的有效性验证：
参见图3，其中图(a)为传统结晶方法得到的显微镜下结晶效果；图(b)为现有激光诱导蛋白质结晶方法，使用与实施例1和2中相同能量、相同个数的飞秒激光脉冲作用后的结晶效果；图(c)为实施例1的结晶结果，图(d)为实施例2的结晶结果，图(e)为实施例3的结晶结果。可以看出，相对自然结晶，激光诱导的蛋白质结晶成核过程能够得到形状规则的蛋白质晶体。而相对于现有的激光诱导蛋白质结晶方法，实施例1、2和3的结晶结果说明在不改变脉冲能量的条件下，可以通过不同的时间整型方式，实现不同的结晶成核效果，在对材料的热损伤尽量小的情况下，得到所需数量、大小等参数的蛋白质晶体，并应用于蛋白质结构分析等后续工作。
实施例1、2和3的基本原理是：飞秒激光对蛋白质结晶形核的调控作用主要是通过激光在溶液内能量沉积形成的冲击波或其他热力学效应，以及激光的交变电磁场对被极化的溶质分子或团簇的梯度力作用造成的局部溶质浓度变化，促进在激光焦点附近的形核，从而实现了可控的蛋白质形核，其促进形核的效率与激光能量、材料对于激光能量的吸收相关。而由于飞秒激光与材料作用的非线性效应，利用时间整形的飞秒激光实现电子动态调控，可以在有限的激光能量选择下，使用不同的时间整型方式调控得到不同的结晶成核效果。
实施例4：本实施例基于电子动态调控的飞秒激光辅助蛋白质结晶形核方法，采用空域整形方式调控蛋白质晶体的结晶位置分布，具体包括以下步骤：
S1配制蛋白质过饱和溶液和结晶所需池液，其中过饱和溶液采用鸡蛋白溶菌酶粉末24mg/ml，氯化钠晶体2.5％wt，醋酸钠晶体0.1M(摩尔浓度)；结晶所用池液采用10％wt氯化钠溶液。通过查阅相关文献得到，鸡蛋白溶菌酶的烧蚀阈值约为每个脉冲0.2μJ，变性温度Tmax约为70℃。
S2参数设计，具体包括：
S21飞秒激光脉冲序列参数设计：本实施例中考虑蛋白质为鸡蛋白溶菌酶，变性温度在70℃左右。本实施例考虑激光扫描辐照一个区域的情况，每个脉冲独立作用于不同位置，因此可以通过单个激光脉冲在一定区域沉积的能量大小和水溶液温度上升的关系，得到激光辐照位置处温度T2和激光功率P2、辐照区域的关系，计算公式为：
T2＝W/(V×C×ρ)+Tatm
其中，W单脉冲能量；V为激光聚焦区域大小，本实施例中考虑一细长区域(空域整形要求，具体见步骤S22)取6×10-14m3；C为溶液比热容，取为水的比热容4.2×103J/(kg℃)；ρ为溶液密度，取为水的密度4.2×103kg/m3；Tatm为室温，取20℃(293K)。因此得到最大的功率为：
Wmax＝(Tmax-Tatm)×V×C×ρ＝12μJ
则在1kHz重复频率下即为功率12mW。
本实施的飞秒激光光源采用相干公司(Coherent)的钛蓝宝石激光器，中心波长800nm，脉冲宽度35fs，重复频率最高1kHz，光强分布为高斯型，根据上述选定的烧蚀阈值和变性温度的计算结果，选取激光功率10mW，脉冲重复频率1kHz。
S22电子动态调控参数设计：本实施例用于调控蛋白质晶体的结晶位置分布，具体需求为在溶液中的一个竖直平面上实现结晶形核的集中分布，为实现更好的结晶效果调控，采用空域整形方式，将一束能量通量呈高斯分布的飞秒激光通过图4所示空域整形单元整形为细长聚焦区域的贝塞尔飞秒激光序列，该单元由楔角2°的锥透镜6和焦距100mm的平凸透镜7构成，且两者共光轴设置；图中实线均为光线，一束平行光线从上方进入系统，阴影区域为贝塞尔光束的聚焦区域，其中A1为经过锥透镜6后的贝塞尔区域，A2为经平凸透镜7成像后的贝塞尔区域，该单元可以使激光聚焦区域为一细长形状的贝塞尔区域，最终经物镜聚焦在溶液内的贝塞尔区域的长度约2mm、直径约6μm；然后，设定待结晶溶液通过沿水平方向以30μm/s的速度移动溶液样品，激光作用过的区域为贝塞尔的细长区域扫过的一个竖直平面，则在该竖直平面内实现结晶形核的集中；然后执行步骤S3。
S3、利用步骤S2设计的参数产生基于电子动态调控的空域整形飞秒激光脉冲，将该飞秒激光脉冲聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中。具体实现过程如下：
S31、搭建飞秒激光系统并进行光路校准，本实施例采用如图5所示的飞秒激光系统，该飞秒激光系统包括共光轴依次设置的飞秒激光光源1、中性密度衰减片2和机械快门3，通过该机械快门3控制的飞秒激光依次通过反射镜4和反射镜5射入空域整形单元15，用于改变激光聚焦位置在空间的分布，经反射镜8后通过位于该反射镜8一侧的10倍物镜9聚焦于平移台11上放置的蛋白质过饱和溶液10，并由位于平移台11一侧的侧面成像单元17进行成像，反射镜8另一侧设有与10倍物镜9共光轴的正面成像单元16；其中飞秒激光光源1，用于产生飞秒激光；中性密度衰减片2，用于调节激光能量；机械快门3，用于控制脉冲个数；反射镜4、反射镜5和反射镜8，均用于引导光路和调节光路准直；10倍物镜9，用于聚焦激光光束；空域整形单元15，用于实现单脉冲在待结晶蛋白质上的聚焦区域呈贝塞尔分布，由楔角2°的锥透镜6、焦距100mm平凸透镜7构成，其中，平凸透镜7放置的位置在激光经过锥透镜6后形成的无衍射区域内(约距离锥透镜18cm)，激光经此单元后聚焦的直径最小位置与10倍物镜9的像方焦点重合，此外，也可通过空间光调制器或其他仪器实现不同的聚焦位置分布；正面成像单元16，由共光轴设置的电荷耦合元件(CCD)13和成像透镜14构成；侧面成像单元17，采用带镜头和照明光源的电荷耦合元件(CCD)12；图5中所示实线为飞秒激光光线，点划线为成像单元光线。飞秒激光系统搭建完成后进行光路校准，单脉冲能量20μJ，重复频率1kHz，通过10倍物镜9聚焦在平移台11上的感光片(只校准用，光路图中未画出)，上下移动平移台11时，保证激光聚焦的贝塞尔区域在平移台11上形成的光斑始终在平移台上同一位置，此时贝塞尔区域垂直于平移台表面，如不垂直，调节锥透镜6和平凸透镜7的角度使其垂直；在正面成像单元16观察到的视野中，找到平移台上光斑位置，标记为激光焦点位置，用于后续步骤中通过成像光路中将激光焦点聚焦于溶液中。
S32、将产生的飞秒激光脉冲序列聚焦于步骤S1配置的蛋白质过饱和溶液中：取步骤S1中所配蛋白质过饱和溶液，用移液枪每次取150μL，滴在96孔板的不同孔中，将盖板置于平移台11上样品10的位置。通过正面成像单元16观察，调节平移台11位置，使成像系统中的液滴位置与步骤S31中在成像系统中标记的激光焦点重合，从而使激光聚焦于液滴内部，设置激光光源重复频率1kHz，通过调节中性密度衰减片2改变到达10倍物镜9的激光能量如步骤S21中所列，打开机械快门3，同时使放置溶液样品的平移台11以30μm/s的速度水平移动，则激光作用过的区域为贝塞尔的细长区域扫过的一个竖直平面，可以在该所需区域内实现结晶形核的集中。
S4、将飞秒激光脉冲序列处理后的蛋白质过饱和溶液置于步骤S1配置的池液环境中，在室温条件下密封静置，得到蛋白质晶体。本实施例中将装有S32激光作用后的待结晶蛋白质过饱和溶液的96孔板直接放置在装有池液的保鲜盒中，密封后在20℃环境中静置24小时，形成蛋白质晶体。
得到的结晶结果在显微镜下观察如图6所示，其中(a)为本实施例激光作用后的结晶下效果图，(b)对照组没有激光作用的结晶效果图。不同于没有激光作用的结晶方法中会在溶液中多处同时均匀地形成结晶，不同高度上激光扫过的直线附近有明显的晶体聚集，即实现了在所需位置的结晶形核聚集。
飞秒激光对蛋白质结晶形核的调控作用机理主要是激光在溶液内能量沉积形成的冲击波或其他热力学效应，以及激光的交变电磁场对被极化的溶质分子或团簇的梯度力作用造成的局部溶质浓度变化，促进在激光焦点附近的形核；本例中，通过控制激光的能量分布为一个细长贝塞尔区域，并使该区域在溶液中沿一条直线运动扫描得到一个激光作用的竖直平面，最终可以得到有一定空间分布的结晶成核结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
