黑色素-纳米硒及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米硒及其制备方法，具体涉及黑色素-纳米硒及其制备方法，属于化学技术领域。
背景技术
硒是生物体内多种酶的活性中心，能够参与机体抗氧化和能量代谢，是维持机体正常生命活力的必需物质。大量研究表明：纳米硒相比无机硒和传统有机补硒剂具有较好的生物利用率、较低的毒性，这使得纳米硒成为研究领域的新焦点，在补硒产品的开发上具有很好的应用前景。
对于纳米硒的制备方法，目前大多采用化学还原法，然而该方法存在反应条件苛刻、成本高、还原剂和模板剂有毒等缺点。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种反应条件温和、成本低、无毒的制备纳米硒的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，以黑色素作为纳米硒结构合成的还原剂和模板剂，用黑色素还原二氧化硒溶液，具体包括以下步骤：
步骤1：将二氧化硒用蒸馏水溶解，得到二氧化硒储备液；
步骤2：将黑色素用pH＝8.0的缓冲液溶解，得到黑色素储备液；
步骤3：将二氧化硒储备液与黑色素储备液先稀释后混合，然后将溶液的pH值调至8.5；
步骤4：于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、恒速水浴搅拌条件下反应5h，得到样品；
步骤5：将样品用水系纳米膜于砂芯漏斗中过滤，收集滤液，得到黑色素-纳米硒溶液，将得到的黑色素-纳米硒溶液真空冷冻干燥，得到黑色素-纳米硒颗粒。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤1中，前述二氧化硒储备液的浓度为0.555mg/mL。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤2中，前述黑色素储备液的浓度为0.3mg/mL。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤2中，前述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤3中，二氧化硒与黑色素的质量比为1：1。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤4中，搅拌速度为400r/min。
前述的制备黑色素-纳米硒的方法，其特征在于，在步骤5中，前述水系纳米膜的孔径为0.22μm。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明利用黑色素还原二氧化硒溶液，反应在黑暗、常压、40℃、搅拌的条件下进行，反应条件温和，容易实施；
(2)黑色素作为一种生物提取物质，不但来源广泛，而且具有生物可降解性、氧化还原性和金属螯合性等优良的理化性能，本发明以黑色素作为纳米硒结构合成的还原剂(还原制备纳米硒)和模板剂(诱导和调控纳米硒的生长，并影响其形貌)，不仅成本低，而且无毒，是理想的还原剂和模板剂。
附图说明
图1是黑色素-纳米硒、黑芝麻黑色素的傅立叶红外光谱图；
图2是利用动态光散射测定mSeNPs颗粒的粒径图；
图3是mSeNPs颗粒的扫描电镜照片；
图4是mSeNPs颗粒的元素组成分析结果图；
图5是mSeNPs颗粒的XPS分析结果图；
图6是黑色素、二氧化硒以及制备得到的黑色素-纳米硒三种物质的紫外-可见全波长扫描图谱；
图7是黑色素与二氧化硒的质量比对光吸收的影响图；
图8(A)是黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为7mL:5mL时，反应制备得到的黑色素-纳米硒(mSeNPs)颗粒的扫描电镜照片；
图8(B)是黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为8mL:5mL时，反应制备得到的mSeNPs颗粒的扫描电镜照片；
图8(C)是黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为9mL:5mL时，反应制备得到的mSeNPs颗粒的扫描电镜照片；
图8(D)是黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为10mL:5mL时，反应制备得到的mSeNPs颗粒的扫描电镜照片；
图8(E)是黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为11mL:5mL时，反应制备得到的mSeNPs颗粒的扫描电镜照片；
图9是反应温度对光吸收的影响图；
图10是反应时间对光吸收的影响图；
图11是溶液pH值对光吸收的影响图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
1、制备黑色素-纳米硒
称取5.55mg二氧化硒，用蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为0.555mg/mL的二氧化硒储备液。
称取3.0mg黑芝麻黑色素，用pH＝8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解并定容至10mL，得到浓度为0.3mg/mL的黑色素储备液。
量取5mL二氧化硒储备液和9mL黑色素储备液(二氧化硒与黑色素的质量比为1:1)，分别用少量蒸馏水稀释，然后混合并调节体积至45mL，搅拌使溶液充分混合，之后用稀盐酸和氢氧化钠调整溶液的酸碱度，使溶液的pH为8.5。
于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、400r/min恒速水浴搅拌条件下反应5h，得到样品。
将样品用0.22μm的水系纳米膜于玻璃砂芯漏斗中过滤，收集滤液，即得到黑色素-纳米硒(mSeNPs)溶液。
将得到的mSeNPs溶液置于-80℃冰箱预冷24h，之后取出在冷冻仓温度低于-40℃、系统压力低于100millitorr的真空冷冻干燥机中干燥48h，得mSeNPs颗粒。
(1)傅立叶红外光谱(IR)表征
将黑芝麻黑色素和冷冻干燥得到的mSeNPs颗粒分别在57％相对湿度下用溴化钾(KBr)在玛瑙钵体中研磨，然后制备黑色素-KBr混合物和mSeNPs-KBr混合物的沉淀圆片，之后通过傅立叶红外光谱仪(FT-IR)测定获得它们的红外光谱，通过比较红外光谱来确定黑色素和纳米硒之间作用的主要官能团。
mSeNPs和黑芝麻黑色素的傅立叶红外光谱图如图1所示。由于黑色素是一类结构复杂的生物类大分子，其红外谱图是一系列宽而强的吸收峰，是由多种官能图伸缩、振动引起的。
黑芝麻黑色素的特征吸收峰主要位于3400～3000cm-1、2950～2850cm-1、1630～1400cm-1几组吸收峰上，在1593、1490cm-1处有芳环振动引起的吸收峰，为芳环C＝C的振动伸缩吸收峰；在830～625cm-1范围内吸收峰较弱，表明芳环被取代，形成了共轭体系，芳氢含量较少；在3400～3200cm-1处存在较强的缔合-OH伸缩振动吸收峰，1631cm-1处较强吸收峰说明分子中存在羰基，两者一起证实了-COOH结构的存在，由于羰基的伸缩振动频率在较低的频率区间，且与芳环共轭，表明了黑色素结构中存在醌类化合物结构；2926和2848cm-1处的较弱的吸收峰是烷烃结构中C-H的伸缩振动引起的，另外在1402和1267cm-1处有较强的C-C伸缩振动吸收峰。因此，黑色素结构中可能含有羟基、羧基、烷基、苯环及醌类等官能团，且苯环上多数氢被取代。
制备得到的mSeNPs在3400～3000cm-1、1500cm-1左右以及指纹区的红外吸收峰证实了黑色素的存在。黑色素-纳米硒在3400～3200cm-1处较强的缔合-OH伸缩振动吸收峰发生变化，羰基吸收峰也减弱；于1475～1000cm-1处C-H弯曲振动吸收峰变化较大。这表明：黑色素分子中的羟基、醌类结构参与了黑色素-纳米硒中黑色素与纳米硒间的相互作用。
(2)粒度分析仪表征和稳定性分析
利用动态光散射测定mSeNPs颗粒的粒径，测定结果见图2。
从图2可以看出：黑色素能够较好的还原和调控纳米硒的合成，当黑色素与二氧化硒的质量比为1:1时，合成mSeNPs颗粒的粒径约为200nm。
将制备得到的mSeNPs颗粒储存在4℃条件下，两周测一次mSeNPs颗粒的粒径大小，共测六次，进行稳定性研究。
稳定性研究的结果表明：在黑色素的存在下，mSeNPs可在体系中稳定60d左右。
Zeta电位分析结果表明：mSeNPs颗粒表面电荷的Zeta potential的绝对值大于30mV，粒子间的排斥作用大于吸引作用，因此，制备得到的mSeNPs颗粒能稳定的存在于水分散体系中。
(3)扫描电镜(SEM)表征
将少量制备得到的mSeNPs颗粒利用双面导电胶置于样品台上，吹去多余的粉末杂质。喷金后于扫描电镜下观察mSeNPs颗粒的形貌，工作电压10.0kV，工作距离11.4mm放大50k、200k，观察结果见图3。
由图3可知：制备得到的黑色素-纳米硒颗粒形貌为球形，颗粒大小均一、分散均匀。
之后选择一定区域，使用SEM在放大倍率下进一步分析mSeNPs颗粒的元素组成和晶体学，分析结果见图4和表1。
表1 SEM-EDX结果分析
由图4和表1可知：制备得到的mSeNPs颗粒主要含C、N、O、S和Se元素，另外还存在缓冲液溶液中的P元素，除此之外没有其他元素的吸收峰。
这表明：mSeNPs结构中含有黑色素，且没有其他元素吸收峰的存在，这也证明了所合成的mSeNPs的纯度。
(4)X射线光电子能谱(XPS)表征
利用X射线光电子能谱分析来确定合成mSeNPs颗粒中硒元素的化学态和电子态，利用XPS分析，结合能用C1s＝284.8eV为基准校正，分析结果见图5。
由图5可知：55eV对应的Se 3d轨道响应峰，表明纳米颗粒中Se0的存在。代表高价硒的Se 2p，2s和1s轨道均没有检测到光强度值，进一步说明Se4+已被完全还原。
综上，天然活性物质黑色素能够被用作修饰剂和稳定剂，制备得到均一、稳定的mSeNPs纳米颗粒，且mSeNPs纳米颗粒的粒径大小可通过反应条件的改变来进行调控。当黑色素与二氧化硒质量比为1:1，通过调节反应体系pH值为8.5左右时，于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、恒速水浴搅拌条件下反应5h，即得到粒径约为200nm左右的黑色素-纳米硒溶液。Zetapotential测定的绝对值大于30mV，表明mSeNPs的分散性和稳定性较好；SEM结果直观的反映了mSeNPs的形态与大小，证明均一单分散的球形纳米硒颗粒的形成；XPS结果表明黑色素可将SeO2中的的Se元素全部还原为纳米零价态；UV-vis和FTIR均表明mSeNPs的形成。
2、确定测定mSeNPs溶液的吸光度的波长
将步骤5制备得到的mSeNPs溶液和稀释浓度为0.024mg/mL黑色素溶液、稀释浓度为0.555mg/mL的二氧化硒储备液，利用紫外-可见分光光度计在200nm～800nm范围内进行全波长扫描，根据胶体溶液的双波长比色法选取两个合适的波长λ1、λ2作为测定mSeNPs溶液吸光度的波长。
不同溶液的紫外-可见全波长扫描图谱如图6所示。
由图6可知，黑芝麻黑色素的最大吸收峰位于218nm处，在全波长范围内几乎均有吸收，而制备得到的mSeNPs在218nm处的吸收发生红移。根据胶体溶液测定双波长法，胶体粒径参数B＝lg(A2/A1)/(lgλ1/lgλ2)，其中A1、A2分别为在λ1和λ2处测得的吸光度值，当在固定波长λ1、λ2处A2/A1的值保持不变时，表示胶体溶液粒径不变，处于稳定状态，故选取黑芝麻黑色素在可见区的两等吸收波长λ1＝539nm、λ2＝579nm作为测定mSeNPs溶液的吸光度的波长，并以A539/A579作为检测mSeNPs粒径随反应条件变化的依据。
3、研究黑色素与二氧化硒质量比对mSeNPs稳定性的影响设置黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为7mL:5mL、8mL:5mL、9mL:5mL、10mL:5mL、11mL:5mL、，对应的，黑色素与二氧化硒的质量比为7:9、8:9、9:9、10:9、11:9，将黑色素储备液和二氧化硒储备液分别用少量蒸馏水稀释，然后混合并调节体积至45mL，搅拌使溶液充分混合，之后用稀盐酸和氢氧化钠调整溶液的酸碱度，使溶液的pH＝8.5。其它反应条件为：于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、400r/min恒速水浴搅拌条件下反应5h，将反应得到的样品用0.22μm水系纳米膜于玻璃砂芯漏斗中过滤，每组做三个平行，用紫外-可见分光光度计于539nm和579nm处测定吸光度值。实验结果如图7所示。
由图7可知，黑色素与二氧化硒的质量比对mSeNPS的双波长比值影响不大，且随着加入的黑色素量的增加，A539/A579的值不断增大且趋于平缓，表明生成纳米硒颗粒较稳定，黑色素能够有效防止粒子之间相互聚集，且能很好的控制粒径大小，使还原产生的单质硒一直以纳米形式存在。为了更好的确定黑色素与二氧化硒的质量比，将制备得到的mSeNPs颗粒冷冻干燥，并利用扫描电镜(SEM)观察其形貌。
随后，我们对各组mSeNPs溶液冷冻干燥，制得了mSeNPs颗粒，并利用双面导电胶将少量制备得到的mSeNPs颗粒置于样品台上，吹去多余的粉末杂质，喷金后于扫描电镜(SEM)下观察了mSeNPs颗粒的形貌，工作电压10.0kV，放大200k。其中，黑色素储备液与二氧化硒储备液的体积比为7mL:5mL、8mL:5mL、9mL:5mL、10mL:5mL、11mL:5mL时，反应制备得到的mSeNPs的扫描电镜照片分别如图8(A)至图8(E)所示。
由图8(A)至图8(E)可知，当加入黑色素储备液7mL或者8mL时，反应制备得到的mSeNPs有一定的团聚现象发生，黑色素主要担当还原剂角色，不足以修饰mSeNPs颗粒；而当加入黑色素储备液9mL时，制备得到的mSeNPs分布均匀，分散性较好；当黑色素储备液的体积增至10mL和11mL时，过量的黑色素被吸附到了mSeNPs的表面，导致了制备得到的mSeNPs颗粒发生团聚。因此，以黑色素为模板剂和还原剂制备mSeNPs颗粒时，黑色素储备液和二氧化硒储备液的最适体积比为V(黑色素)：V(二氧化硒)＝9mL:5mL，此时，黑色素和二氧化硒的质量比为1:1。
结论：以黑色素为模板剂和还原剂制备mSeNPs颗粒时，二氧化硒与黑色素的最佳质量比为1：1。
4、研究反应温度对mSeNPs稳定性的影响
量取5mL二氧化硒储备液和9mL黑色素储备液，分别用少量蒸馏水稀释，然后混合并调节体积至45mL，搅拌使溶液充分混合，之后用稀盐酸和氢氧化钠调整溶液的酸碱度，使溶液的pH＝8.5，于黑暗、常压环境下，分别在不同的温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)、400r/min水浴搅拌条件下反应5h，得到样品，将样品用0.22μm的水系纳米膜于玻璃砂芯漏斗中过滤，收集滤液，每组做三个平行，用紫外-可见分光光度计于539nm和579nm处测定吸光度值。实验结果如图9所示。
由图9可知，与其他温度相比，体系反应温度为40℃时，A539/A579值最大，表明在此温度下反应较为迅速且充分，能够制备得到粒径较小、分布均匀、稳定的mSeNPs溶液；当体系反应温度高于40℃时，A539/A579值迅速下降，可能是由于温度的升高加速了mSeNPs颗粒的运动，使mSeNPs颗粒发生了团聚，粒径逐渐变大。
结论：以黑色素为模板剂和还原剂制备mSeNPs颗粒的最佳反应温度为40℃。
5、研究反应时间对mSeNPs稳定性的影响
量取5mL二氧化硒储备液和9mL黑色素储备液，分别用少量蒸馏水稀释，然后混合并调节体积至45mL，搅拌使溶液充分混合，之后用稀盐酸和氢氧化钠调整溶液的酸碱度，使溶液的pH＝8.5，于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、400r/min恒速的水浴搅拌条件下分别反应2h、3h、4h、5h、6h、7h，得到样品，将样品用0.22μm的水系纳米膜于玻璃砂芯漏斗中过滤，收集滤液，每组做三个平行。用紫外-可见分光光度计于539nm和579nm处测定吸光度值。实验结果如图10所示。
由图10可知，反应时间对mSeNPs粒径的影响相对较小，在反应时间为5h时，A539/A579值最大，表明制备得到的mSeNPs粒径最小；随着反应时间的延长，mSeNPs的粒径趋于平缓，表明在反应时间为5h时，反应完成，制备得到了mSeNPs，mSeNPs的粒径趋于稳定且较均匀。
结论：以黑色素为模板剂和还原剂制备mSeNPs颗粒的最佳反应时间为5h。
6、研究反应pH值对mSeNPs稳定性的影响
量取5mL二氧化硒储备液和9mL黑色素储备液，分别用少量蒸馏水稀释，然后混合并调节体积至45mL，搅拌使溶液充分混合，之后用稀盐酸和氢氧化钠调整溶液的酸碱度，使溶液的pH值分别为4.5、6.5、8.5、10.5和12.5，于黑暗、常压环境下，在40℃恒温、400r/min恒速的水浴搅拌条件下反应5h，得到样品，将样品用0.22μm的水系纳米膜于玻璃砂芯漏斗中过滤，收集滤液，每组做三个平行。用紫外-可见分光光度计于539nm和579nm处测定吸光度值。实验结果如图11所示。
由图11可知，溶液pH值会影响mSeNPs颗粒的稳定性，当溶液pH＝8.5时，制备得到的mSeNPs颗粒粒径最小；随着pH值的增大，mSeNPs颗粒的粒径逐渐变大，表明mSeNPs颗粒间发生了相互作用；当溶液为强碱性时，可能由于黑色素具有能溶于碱性溶液而在酸性溶液中沉淀的性质，使黑色素表面官能团发生变化，mSeNPs颗粒粒径突然发生变化。
结论：为了后续mSeNPs用于膳食补硒剂的潜能研究，因此选取反应溶液体系pH值在8.5。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
