一种利用金针菇生物合成纳米硒的方法
技术领域
本发明涉及一种利用金针菇生物合成纳米硒的方法，属于生物纳米技术领域。
背景技术
硒作为一种人体必需的微量营养素，因毒性较大，安全范围(即有效量和毒性量之间) 比较窄，容易因过量而造成中毒。而利用纳米技术制备的纳米硒，尽管还是零价硒，却不仅能被人体吸收和利用，还能发挥硒的生物学和保健功能，如抗氧化、免疫调节等，更值得重视的是它的毒性低于无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒蛋白)等其他硒化合物。纳米硒得到批准作为保健品的主要依据也是其安全性。
食用菌因具有良好的生物富集和转化作用，在生物合成金属或非金属纳米材料以应用于绿色制造、环境保护、功能食品和医药材料等领域已经展现出巨大的潜力。香菇、灵芝等食药用菌物种也曾被用来进行硒的富集和转化，但报道中多以硒蛋白等有机硒形式出现。当前由于生物合成纳米材料的代谢机制尚不明确，纳米材料的生物合成过程中经常出现颗粒均匀性差、稳定性不佳等问题，导致食用菌源的纳米材料无法实现大规模的工业化生产，因而并未得到实际的工业应用。金针菇作为一种常规栽培和日常食用真菌，在生物转化合成纳米材料方面展现出非凡的研究潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物合成纳米硒的方法，通过金针菇(Flammulinavelutipes) 菌丝体液态发酵和子实体浸没培养的方式，获得富含纳米硒的金针菇菌丝体及子实体，该方法制备条件温和、操作简便，在生物合成硒纳米材料及富硒功能食品领域具有潜在的应用价值。
本发明的第一个目的是提供一种生产纳米硒的方法，所述方法是在含四价无机硒盐的环境中利用金针菇(Flammulina velutipes)发酵和/或子实体浸没培养，生产纳米硒。
在一种实施方式中，所述方法收集发酵产物中的纳米硒；所述发酵产物包括但不限于金针菇菌丝体、子实体(含菌柄)、发酵液、发酵液离心后的沉淀物、金针菇菌体裂解液。
在一种实施方式中，所述方法在接种后发酵至6-9d时分别加入浓度为0.1-20mM的四价无机硒盐溶液，继续发酵至总时间9-12d。
在一种实施方式中，所述四价无机硒盐溶液为Na2SeO3溶液。
在一种实施方式中，所述Na2SeO3溶液浓度为0.1-10mM。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)采用PDA培养基对金针菇菌种进行活化；
(2)将步骤(1)活化获得的金针菇菌丝转接至种子培养基中，于20～28℃培养5～8d；
(3)将步骤(2)培养的种子液按105个孢子/mL发酵液转接至发酵培养基中，22～30℃， 130～200rpm发酵6～9d。
(4)向步骤(3)的发酵液中加入四价无机硒盐Se(IV)溶液，继续发酵，使总发酵时间达9～12d，按照a、b、c任一方法收集发酵获得的纳米硒或含纳米硒的产品：
a：直接收集发酵产物；
b：将步骤(3)发酵后的金针菇发酵液无菌过滤，收集菌丝，用无菌水洗涤菌丝3～5次，转移至含四价无机硒盐的溶液中继续摇床培养2-4d，获得富硒金针菇菌丝体；
c：将步骤(4)获得的金针菇菌丝体于22～30℃静置培养15～25d，获得金针菇子实体，将其浸没于四价无机硒盐溶液静置培养1-4d，得到富硒金针菇子实体。
在一种实施方式中，还对发酵和/或培养结束后的发酵产物中的纳米硒进行分离，所述分离是：将步骤(4)发酵/培养产物过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，采用组织匀浆机破坏菌体细胞结构，得到菌体裂解液；菌体裂解液于5000-8000rpm离心10-20min，所得沉淀以无菌生理盐水分散清洗，于5000-8000rpm离心20-30min，清洗过程重复3遍；将沉淀重悬于20mL去离子水中，经截留分子量3000Da透析袋透析后，冷冻干燥，得纳米硒干粉。
在一种实施方式中，还对发酵和/或培养结束后的发酵产物中的纳米硒进行分离，所述分离是：将步骤(4)发酵产物过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，菌体冷冻干燥，磨粉过80目筛，获得含纳米硒的菌体粉末。
在一种实施方式中，还对发酵和/或培养结束后的发酵产物中的纳米硒进行分离，所述分离是：将步骤(4)收集的发酵产物过30目筛去除菌体后，将发酵液和/或培养液由定量滤纸过滤除去固形物，经1万分子量的超滤膜超滤后收集回流液，冷冻干燥，即得纳米硒干粉。
在一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：
(1)菌种活化
用PDA培养基对菌株进行活化培养，PDA培养基配方为：200g去皮土豆切丁后加1L去离子水100℃煮30-40min，滤出汁加20g葡萄糖，20g琼脂，加热溶解，补水至总体积1L，121℃高压灭菌20min，冷却倒平板，凝固后将金针菇菌株接种于PDA平板上，25℃培养7d。
(2)种子液的制备
制备金针菇种子液，培养基为：萄糖20g/L，酵母20g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L，VB1 0.5g/L。每个500mL摇瓶加培养基200mL，121℃高压灭菌20min后，每瓶接入5-15片1×1cm2金针菇PDA平板切片,于25℃，160rpm摇床中培养7d。
(3)摇瓶发酵
配制金针菇发酵液(配方与种子液一致)，500mL摇瓶中含190mL金针菇发酵液，灭菌冷却后，每瓶接入10mL种子液，于160rpm的摇床中培养，发酵温度25℃。在发酵过程的对数生长后期，第6-9d，加入四价无机硒盐Se(IV)溶液，使总发酵时间为9-12d，即添加 Se(IV)后继续发酵3d。
本发明的第二个目是提供应用上述任一所述方法制备的纳米硒粉。
本发明还要求保护应用所述方法发酵获得的金针菇子实体、菌柄或菌丝体。
有益效果：本发明利用金针菇(F.velutipes)生物合成纳米硒，并对生物纳米硒进行分离纯化，产率达5.06％(即5.06g/100g菌体干重)，转化率最高可达99.58％。该方法采用食用菌发酵工艺，具有条件温和，环境友好，操作简便，安全高效等特点，所制备纳米硒在富硒功能食品、富硒材料、及医药产品领域均具有潜在的工业化应用前景。
附图说明
图1不同硒浓度条件下金针菇菌丝体合成纳米硒效果。
图2金针菇菌丝体在不同Na2SeO3浓度下的纳米硒产量及转化率。
图3金针菇子实体对纳米硒的生物合成效果：a，富硒前；b，富硒后。
具体实施方式
产率、纳米硒转化率的计算方法：
产率＝菌体中纳米硒总质量(g)/发酵后得到菌体干重(g)×100％；
纳米硒转化率＝菌体中纳米硒总摩尔数(mol)/4价硒摩尔数(mol,以Na2SeO3摩尔数计)×100％。
实施例1：
用PDA培养基对金针菇菌株进行活化培养，PDA培养基配方为：200g去皮土豆切丁后加1L去离子水100℃煮30min，滤出汁加20g葡萄糖，20g琼脂，加热溶解，补水至总体积1L，121℃高压灭菌20min，冷却倒平板，凝固后将金针菇菌株接种于PDA平板上，25℃培养7d。
将长满菌丝的PDA切成1×1cm2，接5片到种子培养基中，种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母20g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L，VB1 0.5g/L，每个500mL摇瓶加培养基200mL，121℃高压灭菌20min。接种后于25℃，160rpm摇床中培养7d。
将种子培养液按105个孢子/mL发酵培养基的接种量接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，发酵液配方与种子液一致，500mL摇瓶中含190mL金针菇无菌发酵液，接种后于160rpm的摇床中培养，发酵温度25℃。接种后发酵至7d时加入Na2SeO3使发酵液中Na2SeO3浓度为3.0mM(即发酵液中无机硒浓度为3.0mM)，继续发酵至总时间10d，获得呈砖红色的的球状金针菇菌丝体和橘黄色发酵液，菌丝体产量为4.52g/L。
发酵结束后，将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗5遍，采用组织匀浆机破坏菌体细胞结构，得到菌体裂解液；菌体裂解液于8000rpm离心15min，所得沉淀以无菌生理盐水分散清洗，于8000rpm离心20min，清洗过程重复3遍；将沉淀重悬于20mL去离子水中，经截留分子量3000Da透析袋透析后，冷冻干燥，得26.3mg含金针菇胞内水溶性大分子成分的砖红色纳米硒干粉，其中纳米硒含量为21.69％。
实施例2：
在实施例1的基础上，将接种后发酵7d的金针菇发酵液无菌过滤，用无菌水洗涤菌丝3 次，转移到200mL Na2SeO3溶液中(浓度为3.0mM含所述四价无机硒盐溶液)中继续摇床培养3d。
发酵结束后，将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，菌体冷冻干燥，磨粉过80目筛，得903mg富含纳米硒的砖红色金针菇菌体粉末，经测定，其中纳米硒含量为4.37％，纳米硒转化率为93.28％，。
实施例3：
将金针菇子实体浸没于浓度为3.0mM的Na2SeO3溶液静置培养2d，得到砖红色富硒金针菇子实体(图3)。
培养结束后，去离子水洗涤金针菇子实体3次，冷冻干燥，磨粉过80目筛，得富含纳米硒的砖红色金针菇子实体粉末，其中纳米硒含量为1.04％，纳米硒转化率为89.37％。
实施例4：
在实施例1的基础上，调整添加Na2SeO3溶液后Na2SeO3的最终浓度分别为0.3,0.6,3.0, 6.0,9.0mM。发酵结束后，将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗5遍，菌体冷冻干燥，磨粉过80目筛，金针菇菌丝体在不同浓度Na2SeO3的溶液中的纳米硒转化效果如图1，随Na2SeO3的添加，金针菇菌丝体逐步由米黄色变为砖红色，且随Na2SeO3浓度的升高而逐渐加深，在Na2SeO3浓度为3.0～9.0mM时，颜色保持稳定。具体结果如图2所示，随Na2SeO3浓度的升高，金针菇菌丝体的生长受到一定程度的抑制，在Na2SeO3浓度达到0.6mM后影响不显著，且在0.6mM的Na2SeO3浓度时，纳米硒转化率最高，达到99.58％，此时菌丝体中纳米硒含量较低，为0.996％。当Na2SeO3浓度达到3.0mM时，纳米硒的转化率和含量均处于较高水平，其中转化率为94.70％，菌丝体中纳米硒含量为4.79％。图2还显示，进一步提高Na2SeO3浓度对菌丝体中纳米硒含量影响不大(最高可达5.06％)，而纳米硒转化率逐渐降低。
实施例5：
在实施例4的基础上，使添加Na2SeO3溶液后Na2SeO3的最终浓度为3.0mM，调整Na2SeO3溶液的添加时间分别为第6、8、9d，分别继续摇床发酵3d。结果显示，自接种后第6～9d添加相同浓度的Na2SeO3，对金针菇菌丝体中纳米硒含量没有显著影响，且纳米硒转化率没有显著变化。
实施例6：
在实施例1的基础上，发酵结束后，将发酵液过30目筛，去除菌体后，发酵液进一步由定量滤纸过滤除去固形物，经1万分子量的超滤膜超滤后收集回流液，冷冻干燥，即得富含金针菇菌丝体胞外大分子成分的橘红色纳米硒干粉，其中含纳米硒4.42％。
实施例7：
在实施例3的基础上，调整浸泡培养液中Na2SeO3的浓度分别为0.3,0.6,6.0,9.0mM。结果显示，随培养液中Na2SeO3浓度的升高，金针菇子实体中纳米硒含量逐渐升高，在Na2SeO3浓度为6.0mM时达到最高，为2.31％，此时纳米硒转化率为95.47％；继续提高培养液中 Na2SeO3浓度对子实体中纳米硒含量的提高不显著。
对比例1：
具体实施方式同实施例4，区别在于，向发酵体系中加入6价硒，结果显示，金针菇菌丝体中均不检出纳米硒，菌丝体呈现正常的米白色，而非实施例中所呈现的砖红色(纳米硒特有颜色)。
对比例2：
具体实施方式同实施例3，区别在于，向发酵体系中加入2价硒，结果显示，金针菇子实体中均不检出纳米硒，子实体呈现正常的米白色，而非实施例中所呈现的砖红色(纳米硒特有颜色)。
对比例3：
具体实施方式同实施例1，区别在于，在接种后的第0-5d向发酵体系中加入4价硒，结果显示，菌丝体中纳米硒含量最高为5.03％，与第6～9天接种时的最高值一致。但金针菇菌丝体生长受到明显抑制，生长缓慢，菌丝体产量最高仅为2.31g/L，因而纳米硒转化率较低，为50.87％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
