一种铁死亡激活剂及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物科学领域，特别涉及一种铁死亡激活剂及其制备和应用。
背景技术
铁死亡是近年来发现的调控细胞死亡的方式，其主要特点是铁代谢异常产生大量的活性氧和脂质过氧化物的积累，在形态特征和生化指标方面与凋亡、自噬、坏死等死亡方式不同。已有研究证明，该死亡方式与缺血再灌注损伤、肾损伤、铁代谢疾病及肿瘤等疾病密切相关，因此制备铁死亡激活剂可为研制有效的治疗药物提供新的参考。
铁死亡的发生涉及多种基因的表达、调控以及不同的信号通路的激活，产生一系列不同的生化反应。目前对铁死亡激活剂研究较少，主要集中在Erastin类似物上，但在体内缺乏足够的效用和代谢能力。因此急需寻找和开发铁死亡激活剂以便于为疾病的治疗提供新策略、新方法。
发明内容
本发明旨在解决铁死亡激活剂效果欠佳的技术问题，旨在提供一种有效的铁死亡激活剂及其制备和应用。
本发明提供一种铁死亡激活剂，其为尺寸小于30nm的四氧化三铁纳米颗粒。
本发明还提供上述铁死亡激活剂的制备方法，其包括如下步骤：
将三价铁盐与二价铁盐倒入盐酸溶液中，得到A溶液；
将透明质酸溶于水中，氮气或惰性气体保护下油浴加热至80℃-110℃，得到B溶液；
将所述A溶液注入所述B溶液中，得混合液，搅拌，滴加碱液，回流，得反应粗产物；
将所述反应粗产物透析纯化，获得所述铁死亡激活剂。
本发明进一步提供上述铁死亡激活剂在药物研究中的应用。
本发明的有益效果表现在：30nm以下的四氧化三铁纳米颗粒具有表面活性高，生物膜穿透能力强，生物亲和活性好及毒副作用小等特点，可激活铁死亡通路，制备过程简单，反应条件温和，成本较低。
附图说明
图1为表示实施例1获得的铁死亡激活剂的透射电镜图。
图2为表示实施例1获得的铁死亡激活剂的水合粒径。
图3为实施例1获得的铁死亡激活剂纳米粒子的表面电位。
图4为CCK-8法测试的MDA-MB-231细胞经过实施例1获得的铁死亡激活剂处理24小时后的细胞活力。
图5为Annexin V-PI双染法测定实施例1获得的铁死亡激活剂可激活MDA-MB-231细胞的铁死亡通路。
图6为生物电镜测定实施例1获得的铁死亡激活剂对MDA-MB-231细胞线粒体形态的影响。
图7为CM-H2DCFDA荧光染料测定实施例1获得的铁死亡激活剂对16HBE细胞内活性氧的影响。
图8为GSH试剂盒测定实施例1获得的铁死亡激活剂对BEAS-2B细胞内GSH含量的影响。
图9为生物电镜测定实施例1获得的铁死亡激活剂对16HBE细胞线粒体形态的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种铁死亡激活剂，其为尺寸小于30nm的四氧化三铁纳米颗粒。
该纳米颗粒被细胞内在化后，可引起胞内铁代谢紊乱，使胞内自由的铁离子增多，通过Fenton反应产生大量的活性氧，攻击细胞内的膜结构，造成脂质过氧化的发生，从而激活铁死亡通路。优选地，所述铁死亡剂尺寸为10～30nm。
本发明实施例还提供上述铁死亡激活剂的制备方法，其包括如下步骤：
将三价铁盐与二价铁盐倒入盐酸溶液中，得到A溶液；
将透明质酸溶于水中，氮气或惰性气体保护下油浴加热至80～110℃，得到B溶液；
将所述A溶液注入所述B溶液中，得混合液，搅拌，滴加碱液，回流，得反应粗产物；
将所述反应粗产物透析纯化，获得所述铁死亡激活剂。
优选地，所述A溶液中三价铁盐与二价铁盐摩尔比为2:1～2。更优选地，三价铁盐和二价铁盐为氯盐，如FeCl3·6H2O(0.78mmol,0.2098g)和FeCl2·4H2O(0.51mmol,0.1010g)。
所述B溶液中透明质酸与水的质量体积比为10～50g/L，所述透明质酸的分子量为6000～8000Da，所述碱溶液为质量分数20％～30％的氨水，加入碱溶液将混合液pH调至10～12，更优选地，所述pH值为11。
具体地，先通入氮气或惰性气体20～50min，再油浴加热。
优选地，所述搅拌速度为100～200r/min。
将所述反应粗产物冷却至室温后，用透析袋透析72h，获得所述铁死亡激活剂。具体地，所述透析袋的截留分子量为1.0～1.4kDa。
本发明还提供上述方法获得的铁死亡激活剂在药物研究中的应用，可为新药研发及疗法创新提供基础。
实施例1：
一种铁死亡激活剂的制备方法
取0.2098g的FeCl3·6H2O与0.1010g的FeCl2·4H2O溶于2mL 1M的盐酸溶液中，得到A溶液。
取0.5g的透明质酸(6980Da)溶于50mL超纯水中，倒入三颈烧瓶中，通入氮气30min，油浴升温102℃，得到B溶液。
将A溶液注入B溶液中，缓慢滴加28％氨水15mL，在高温下回流1h，得反应粗产物。
将反应粗产物冷却至室温后，转移至透析袋(1.0～1.4kDa)中，用超纯水在15℃～37℃透析72h后，获得所述铁死亡激活剂。
图1为实施例1中所述铁死亡激活剂的透射电镜图，图2表示实施例1中铁死亡激活剂的水合粒径分布图。图3表示实施例1中的铁死亡激活剂的表面电位，粒子表面电位是负值，表明透明质酸修饰在Fe3O4外部。
实施例2：
将实施例1的方法获得的铁死亡激活剂，通过CCK8法测定其生物相容性。
以MDA-MB-231细胞为模型，通过CCK8法测定MDA-MB-231细胞凋亡率以检测所合成材料的细胞毒性。MDA-MB-231细胞分别与不同[Fe]质量浓度的铁死亡激活剂(25、50、100、200、400μg/mL)纳米材料，培养24小时后，然后使用CCK8试剂盒，在450nm下检测吸光度。与对照组相比，USPIO从0到400μg/mL浓度范围内对MDA-MB-231细胞活力没有显著影响，这表明此材料在该浓度范围内没有明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性，如图4所示。
实施例3：
将实施例1的方法获得的铁死亡激活剂，通过Annexin V-PI双染法测定其可激活癌症细胞的铁死亡通路。
以MDA-MB-231细胞为模型，用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1、Liproxstatin-1、Deferoxamine)预处理细胞6h，然后除去培养上清，向各组加入100μg/mL铁死亡激活剂处理细胞24h，然后使用Annexin V-PI双染法，通过流式检测细胞凋亡率。铁死亡抑制剂可明显抑制铁死亡激活剂所导致的细胞凋亡率，这表明铁死亡激活剂可激活癌细胞的铁死亡通路，如图5所示。
实施例4：
将实施例1的方法获得的铁死亡激活剂，通过生物电镜测定材料对癌症细胞线粒体形态的影响。
以MDA-MB-231细胞为模型，用100μg/mL铁死亡激活剂处理48h，然后对照组与实验组细胞用胰酶消化后，收于离心管中，用2.5％戊二醛处理，4℃过夜，然后通过漂洗染色脱水等处理，得到细胞在电镜下的图片，如图6所示。通过与对照组相比，铁死亡激活剂处理组的线粒体明显皱缩、膜密度浓缩以及嵴减少，表明铁死亡激活剂可使细胞线粒体形态发生改变，这也是铁死亡区别于其他细胞凋亡方式的特征。
实施例5：
将实施例1的方法获得的铁死亡激活剂，通过高内涵荧光定量测定材料对正常细胞脂质过氧化物的影响。
以16HBE细胞为模型，用100μg/mL铁死亡激活剂处理24h，然后使用CM-H2DCFDA探针37℃孵育20min，然后更换磷酸盐缓冲溶液，通过高内涵拍片并分析细胞的荧光强度。荧光强度随铁死亡激活剂处理时间的延长呈现逐渐增强的趋势，表明铁死亡激活剂可造成细胞内活性氧的累积，如图7所示。
实施例6：
按照实施例1的方法合成的材料，通过GSH试剂盒测定材料对正常细胞GSH含量的影响
以BEAS-2B细胞为模型，用100μg/mL铁死亡激活剂处理不同的时间(4h、8h、12h)，收集细胞样品，快速反复冻融两次后，离心取上清，通过GSH试剂盒测定412nm下吸光值。与对照组相比，GSH含量随铁死亡激活剂处理时间的延长呈现逐渐降低，表明铁死亡激活剂可造成细胞内GSH的消耗，如图8所示。
实施例7：
将实施例1的方法获得的铁死亡激活剂，通过生物电镜测定材料对癌症细胞线粒体形态的影响。
以16HBE细胞为模型，用100μg/mL铁死亡激活剂处理24h后，细胞用胰酶消化，收于离心管中，加入2mL 2.5％戊二醛处理，4℃过夜，然后通过漂洗染色脱水等处理，得到细胞在电镜下的图片，如图9所示。通过与对照组相比，铁死亡激活剂处理组的线粒体明显皱缩、膜密度浓缩以及嵴减少，表明铁死亡激活剂可使细胞线粒体形态发生改变。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
