一种还原氧化石墨烯膜在冷冻电镜中的应用
技术领域
本发明涉及一种还原氧化石墨烯膜在冷冻电镜中的应用，属于生物冷冻电镜技术领域。
背景技术
冷冻电镜技术长期的发展，尤其是近几年在数据处理和相机硬件方面接连取得的突破性的进展，使得该方法突破了以往分辨率的局限性，近原子分辨率的结构解析变得较为普遍。该技术将处于生理条件下的溶于水中的样品快速冷冻，使得样品保存于非晶玻璃态的冰中。再用透射电子显微镜进行观察并收集照片。最后结合相关算法以及图像处理技术对分子进行三维重构。之前，由于不能达到很高的分辨率，该方法应用不广。近二十年来，直接电子探测相机的发明以及相关算法的优化基本上解决了这个问题，使得冷冻电镜能够达到近原子分辨率。冷冻电镜革命性的突破使其获得了蓬勃的发展。我国也抓住了这次机遇，应用该技术取得了一系列成绩，并在冷冻电镜领域占据一席之地。
经过近几年的应用和发展，冷冻电镜技术后期图像收集和处理已经较为成熟。然而，冷冻样品制作的技术发展，相对来说收效甚微。直至今天，样品的可重复性仍然不高，制作样品的条件仍需要根据不同样品不断去摸索。良好的冷冻样品需要非晶玻璃态冰的厚度适宜、生物大分子分布均匀并且处于非变性状态。由于后期图像处理技术的成熟，前期样品制作的问题逐渐凸显。一个良好的样品，往往成为得到高分辨率结构的关键。
应用于冷冻电镜样品制备的样品支撑载网上一般覆盖一层多孔碳膜，如果没有另外覆盖支持膜，孔中的大部分样品会存在于气液界面，而存在于气液界面的生物大分子往往会产生变性进而影响结构。多孔碳膜表面性质不均匀、导电性不佳并且机械刚性不强。导电性不佳会造成生物大分子在拍照时产生漂移进而影响最终结构的分辨率。通常情况下，为了解决这些问题，研究人员会在多孔碳膜上铺制一层无定形超薄碳膜。然而，这层无定型碳膜会带来较大的背景噪音，对后期图像处理带来极大困扰。近年来，也有课题组在尝试采用氮化硅或者金等材料作为支持膜。然而由于存在导电性差、在液氮温度下刚性差、制备工艺不成熟等问题，这些载网并没有得到广泛的应用。后来人们考虑一种背景很小的二维材料—石墨烯作为支持膜。石墨烯很薄，电子能够轻易穿过。此外，石墨烯超高的导电性和机械强度使得它成为一种理想的载网材料。然而，由于石墨烯的疏水性，生物大分子不易附着。有一种方法是将石墨烯氧化，氧化后的石墨烯具有亲水性，可以与生物大分子结合。然而，这降低了石墨烯的导电性，导电性降低会带来一系列困扰。此外，氧化石墨烯表面具有很多官能团，使得石墨烯膜厚度增加，背景噪音较强。因此，需要提供一种理想的新型冷冻电镜载网支持膜材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种还原氧化石墨烯膜(负载于电镜载网上)在生物冷冻电镜中的应用。
由于石墨烯超强的导电性和机械性能、均匀性以及超薄的特性，可以部分甚至完全消除目前电镜载网存在的背景噪音强、导电性差、大分子分布于气液界面等问题。由于氧化石墨烯虽然解决了石墨烯疏水的特性，但是降低了导电性，而还原之后可以补偿降低的导电性。此外，氧化石墨烯层与层之间存在较多官能团，层间距较大，而还原之后层间距减小，因此噪音相对更小。因此还原氧化石墨烯可作为生物冷冻电镜载网支持膜。
本发明采用的还原氧化石墨烯按照包括如下步骤的方法制备：
将氧化石墨烯转移至电镜载网上，经还原即得。
其中，所述氧化石墨烯可采用改进的Hummers法制备，具体可包括如下步骤：
在石墨烯(如3g)中加入体积比为9：1(如分别为360ml和40ml)的H2SO4/H3PO4混合溶液和高锰酸钾(如18g)，加热至50℃并不断搅拌(如12h)。反应结束后降至室温并在冰水浴中加入30％的H2O2溶液(如3ml)，再用滤器(300um)过滤去除较大片段。在室温下用4000rpm离心4h后去除上清，沉淀依次用200ml H2O、30％HCl、无水乙醇重悬，无水乙醇去重悬。
上述重悬步骤之后均采用4000rpm离心4h并去除上清。
第二次用无水乙醇重悬离心后在真空干燥箱中干燥备用。
按照下述方法转移所述氧化石墨烯：
用甲醇-水的混合溶液将氧化石墨烯稀释，并超声分散后，转移到(金质)电镜载网上，具体可包括如下步骤：
取1ml溶于水中的高浓度氧化石墨烯，加入7ml分散缓冲液(分散缓冲液为水与甲醇(CH3OH)的混合溶液，体积比为1：5)中混匀，超声处理10min。将超声后的溶液均分于6个1.5ml EP管中，4000g常温离心10min(去除碎片化的氧化石墨烯)。去除上清并在每管加入500ul分散缓冲液重悬，然后超声处理2min。500g常温低速离心1min(去除未分散的氧化石墨烯)，将上清转移至新的EP管，用锡纸包被置于4℃保存。
转移的具体步骤如下：
将(金质)电镜载网进行稀薄空气辉光放电亲水化处理：将载网放置于密闭容器中，抽真空至10-3～10-4托后，low档电压处理10s。容器洗净后装蒸馏水至刚好没过四根短棒，将容器底部金属片置于短棒上。剪一张和金属片大小相仿的滤纸铺在金属片上，然后将处理后的载网正面朝上置于滤纸上(多个载网注意不要重叠)。向液面缓慢轻柔且均匀地滴加200ul处理过的氧化石墨烯溶液，之后打开出水管的阀门，让容器中的水缓慢(1～2滴每秒)流出。取出滤纸并置于培养皿中使载网自然干燥(可置于65℃烘箱加快干燥)。
上述的制备方法中，所述还原的步骤如下：
在氩氢气的环境下，逐渐加热至300～600℃并恒温，实现对所述氧化石墨烯的还原。
上述的制备方法中，所述氩氢气的流速可为80～120sccm/min，具体可为100sccm/min；
所述氩氢气中氩气的体积含量可为90～98％，如95％。
所述加热步骤中的升温速率可为2～5℃/min，具体可以2℃/min的速率升温。
上述的制备方法中，所述恒温的时间可为60～100min，如在300℃条件下恒温60min；
所述还原结束后自然降温至室温。
上述还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的方法简单，所需原料的获取也比较方便，可以规模化制备，可一次性制备上百个还原氧化石墨烯载网支持膜。本发明采用透射电子显微镜检测还原氧化石墨烯的完整性和覆盖率，能够达到80％～90％的覆盖度，并且层数可以达到薄层甚至单层，极大地降低了样品在电镜成像中的背景噪音。经过三种生物样品(20S蛋白酶体，去铁铁蛋白，核糖体)的测试，该载网应用于冷冻电镜三维重构都取得了比氧化石墨烯更好的分辨率。
与超薄碳膜和氧化石墨烯作为支持膜相比，本发明采用的还原氧化石墨烯膜的导电性更强，因而能够减少拍照曝光时电子造成的漂移。超薄碳膜尽管很薄，它仍然是无定型的碳，其表面性质并不均匀，而性质更均匀并且更薄的还原氧化石墨烯可以大大地降低背景噪音。与没有附加支持膜的多孔碳膜相比，生物大分子会更多地附着于还原氧化石墨烯表面而非气液界面，进而减少生物大分子的变性以及优势取向的形成。多孔碳膜表面的不均匀也会造成生物大分子分布的不均匀，时常造成分子进孔困难，还原氧化石墨烯却不存在这个问题。与氧化石墨烯相比，还原氧化石墨烯的导电性更高，减少光束照射带来的样品漂移问题。此外，还原氧化石墨烯的厚度更薄，因此透射电子显微镜照片的背景噪音也更低。
由于目前支持膜的缺陷，冷冻样品的制作一直是一个大的挑战。寻找一种更稳定、导电性更高、背景噪音更低的支持膜是当前样品制作方面的工作重点。而还原氧化石墨烯是目前最符合实际应用的支持膜，解决了以往支持膜缺陷的同时，又存在自身其他一些诸如超高的机械强度等特性。可以预见，单层还原氧化石墨烯载网能够大规模生产，能够给冷冻电镜的制样以及后期三维重构带来极大便利。
附图说明
图1(a)为还原氧化石墨烯电镜载网制备的示意图，图1(b)和图1(c)分别为覆盖单层还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的透射电子显微镜图像以及衍射图像。
图2为氧化石墨烯和还原氧化石墨烯的层间距示意图以及制样效果，其中，图2(a)和图2(b)分别为氧化石墨烯和还原氧化石墨烯的层间距以及电子束照射冷冻样品的示意图。
图3为氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的性状表征，其中，图3(a)为氧化石墨烯电镜载网支持膜的透射电子显微镜图像，图3(b)为氧化石墨烯电镜载网支持膜在高倍下(50000×)的图像，其中下图为上图经过四次80e/A2辐照后的结果，图3(c)和图3(d)为还原氧化石墨烯电镜载网支持膜分别对应图2(a)和图2(b)的结果。
图4为氧化石墨烯和还原氧化石墨烯应用于冷冻电镜的对比，其中，图3(a)、图4(b)和图4(c)分别为20S蛋白酶体、去铁铁蛋白和核糖体在氧化石墨烯电镜载网支持膜上的透射电子显微镜图像，图4(d)、图4(e)和图4(f)还原氧化石墨烯电镜载网支持膜分别对应氧化石墨烯电镜载网支持膜中图4(a)、图4(b)和图4(c)的结果。
图5为还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上颗粒的分布以及使用氧化石墨烯电镜载网支持膜和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜对三种样品的三维重构结果。图5(a)由tomography重构结果中颗粒坐标绘制而成；图5(b)为20S蛋白酶体在氧化石墨烯载网和还原氧化石墨烯载网上利用几乎相等数目的颗粒三维重构结果的FSC曲线(横坐标中R为分辨率)；图5(c)为三种样品在氧化石墨烯电镜载网支持膜(灰色)和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜(黄色)上的三维重构结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的制备
图1(a)为还原氧化石墨烯电镜载网制备的示意图，其原理为将含有氧化石墨烯的溶液滴加到盛有水的容器中。溶液液面高于置于其中的载网，而氧化石墨烯浮在液面上方。打开出水阀使得液面缓慢下降，氧化石墨烯随之附着在载网上。将氧化石墨烯电镜载网自然干燥后在300℃下进行高温还原，即可制得还原氧化石墨烯电镜载网，具体过程如下：
1、氧化石墨烯的制备
在3g石墨烯中加入体积比为9：1的H2SO4/H3PO4混合溶液(400ml)和18g高锰酸钾，加热至50℃并不断搅拌12h。反应结束后降至室温并在冰水浴中加入3ml 30％的H2O2溶液，再用滤器(300um)过滤去除较大片段。在室温下用4000rpm离心4h后去除上清，沉淀依次用200ml H2O、30％HCl、无水乙醇重悬，每次重悬后采用4000rpm离心4h并去除上清，然后无水乙醇去重悬，离心后在真空干燥箱中干燥备用。
2、氧化石墨烯的转移
取1ml溶于水中的高浓度氧化石墨烯，加入7ml分散缓冲液(分散缓冲液为水与甲醇(CH3OH)的混合溶液，体积比为1：5)中混匀，超声处理10min。将超声后的溶液均分于6个1.5ml EP管中，4000g常温离心10min(去除碎片化的氧化石墨烯)。去除上清并在每管加入500ul分散缓冲液重悬，然后超声处理2min。500g常温低速离心1min(去除未分散的氧化石墨烯)，将上清转移至新的EP管，用锡纸包被置于4℃保存。然后转移至金属载网上：将金质电镜载网进行稀薄空气辉光放电亲水化处理：将载网放置于密闭容器中，抽真空至10-3～10-4托后，低档电压处理10s。图中容器洗净后装蒸馏水至刚好没过四根短棒，将容器底部金属片置于短棒上。剪一张和金属片大小相仿的滤纸铺在金属片上，然后将处理后的载网正面朝上置于滤纸上(多个载网注意不要重叠)。向液面缓慢轻柔且均匀地滴加200ul处理过的氧化石墨烯溶液，之后打开出水管的阀门，让容器中的水缓慢(1～2滴每秒)流出。取出滤纸并置于培养皿中使载网自然干燥(可置于65℃烘箱加快干燥)。
3、高温还原氧化石墨烯
在氩氢气的环境下(流速为100sccm/min)，以2℃/min的升温速率逐渐加热至300℃并维持该温度对氧化石墨烯进行高温还原60min，还原后自然降温至室温，得到还原氧化石墨烯支持膜。
本实施例制备得到的覆盖单层还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的透射电子显微镜图像以及衍射图像分别如图1(b)和图1(c)所示，可以看出，石墨烯均匀地覆盖在电镜载网上，支持膜背景噪音很小，衍射图像也呈现出明显的单层石墨烯衍射模式(正六边形，右侧一个点被遮挡)。
图2为本实施例制备的氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的层间距示意图以及制样效果；其中，图2(a)为氧化石墨烯层间距以及电子束照射冷冻样品的示意图，图2(b)为还原氧化石墨烯层间距以及光束照射冷冻样品的示意图，可以看出，还原氧化石墨烯的层间距更小，样品的背景噪音更少。
图3为本实施例制备的氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的性状表征；其中，图3(a)为氧化石墨烯的透射电子显微镜图像，图3(b)为氧化石墨烯载网在高倍下(50000×)的图像，其中下图为上图经过四次80e/A2辐照后的结果；图3(c)和图3(d)为还原氧化石墨烯分别对应图3(a)和图3(b)的结果，可以看出，氧化石墨烯上存在一些气泡，并且这些气泡在辐照过后会越来越明显；而还原氧化石墨烯未发现该现象。这些气泡的存在暗示了氧化石墨烯层间距较大。
实施例2、还原氧化石墨烯电镜载网支持膜的应用
分别以20S蛋白酶体、去铁铁蛋白和核糖体为例，制作冷冻样品。
先对覆盖实施例1制备的还原氧化石墨烯的载网进行放电亲水化处理：处理过程中抽真空时间为15s，低档放电时间为15s。随后将～4ul 20S蛋白酶体溶液滴加到还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上，然后转移到FEI Vitrobot(冷冻制样仪器)。Vitrobot腔体湿度调至100％，温度调至12℃。滤纸夹吸时间设为2s，force设为-2。滤纸夹吸去多余液体后，将载网迅速插入液态乙烷中使得载网上的水迅速冷冻形成玻璃态的冰，然后转移到电镜中进行数据采集。
按照上述方法分别得到去铁铁蛋白冷冻样品和核糖体冷冻样品。
冷冻电镜数据采用配备了Falcon II相机的Tecnai Arctica冷冻电镜进行收集，收集时加速电压为200kV。收集照片的欠焦值范围为-2.0～-3.2um，像素大小为
本实施例还采用了电子断层扫描技术。收集电子断层扫描照片时，使用TitanKrios冷冻电镜，配备Gatan K2相机，300kV加速电压。每张照片的电子辐照剂量约为
结果分析：
图4为氧化石墨烯和还原氧化石墨烯应用于冷冻电镜的对比，图4(a)和图4(d)分别为20S蛋白酶体分别在氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上的透射电子显微镜图像，图4(b)和图4(e)分别为去铁铁蛋白在氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上的透射电子显微镜图像，图4(e)和图4(f)分别为核糖体在氧化石墨烯和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上的透射电子显微镜图像，经对比可以看出，还原氧化石墨烯具有更少的褶皱以及更干净的背景。
图5为还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上颗粒的分布以及使用氧化石墨烯电镜载网支持膜和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜对三种样品的三维重构结果。图5(a)显示颗粒大部分附着在还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上。选取一个具有代表性的tomography三维重构结果，以垂直于还原氧化石墨烯电镜载网支持膜方向为Z轴建立直角坐标系。忽略颗粒的Y轴方向坐标，以X轴和Z轴方向坐标作图即得图5(a)；图5(b)为20S蛋白酶体在氧化石墨烯电镜载网支持膜和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜上利用几乎相等数目的颗粒三维重构结果的FSC曲线，曲线表明还原氧化石墨烯电镜载网支持膜能够得到更高分辨率的结构(横坐标中R为分辨率)；图5(c)为三种样品在氧化石墨烯电镜载网支持膜(GO，左侧)和还原氧化石墨烯电镜载网支持膜(RGO，右侧)上的三维重构结果，还原氧化石墨烯电镜载网支持膜得到的结构能够显示更多的细节。
