多重pH缓冲配方与尿素酶活性抑制剂的组合物及其用途
技术领域
本发明有关一种在人类或动物或土壤中抑制尿素酶活性的组合物。更详细而言，本发明关于一种于跨酸碱范围内抑制尿素酶活性的组合物及其用途。
背景技术
尿素酶具高度同源性且能将尿素迅速水解为二氧化碳和氨。它常见于人和动物胃肠道的细菌感染，是人类和动物中某些致病菌的致病因子之一。
尿素酶可分成细胞质的尿素酶(cytoplasmic urease)以及细胞表面尿素酶(surface urease)两大类，同时具两种尿素酶的病原菌具较强的抗酸性，而仅具细胞质的尿素酶的病原菌则抗酸性较弱(Helicobacter pylori:Physiology and Genetics(2001))。
幽门螺旋杆菌寄生在人体消化道内，通常存在于胃黏膜上皮，亦可在口腔内繁殖。幽门螺旋杆菌所产生的尿素酶可迅速酶解尿素产生碱性的氨，所以幽门螺旋杆菌在胃内较不易受胃酸侵袭。
尿素是主要的氮肥，氮素含量约46％。当尿肥施用于土壤时，尿素酶促使尿素快速酶解，生成易于挥发流失的氨气，氨气也是环境污染源之一。
鉴于尿素酶所造成的上述问题，本案申请人发展出一种在人类或动物或土壤中抑制尿素酶活性的非药物抑制剂且对环境友善，能弥补现行产品的不足，以下为本案的简要说明。
发明内容
发明的主要目的在于提供一种在人类或动物的肠胃道或土壤中抑制尿素酶活性的组合物。为了不影响肠胃道的正常生理机能，本发明提供一种多重pH缓冲配方组合，其在消化道的不同pH环境下皆能以最适化表现运作来抑制尿素酶活性。
本发明的多重pH缓冲配方组合配合肠胃道的不同pH值环境，在跨酸碱环境(pH 5～8)下均可抑制尿素酶活性且在pH 6.8～7.3具显著尿素酶活性抑制效果。为了达到上述效果，本发明的多重pH缓冲配方组合包括至少一酸成分、至少一碱成分以及尿素酶活性抑制剂，其中所述至少一酸成分为有机酸、磷酸或其组合，所述至少一碱成分为有机碱、磷酸碱或其组合，所述尿素酶活性抑制剂为抗坏血酸、其盐类或其组合。所述酸成分与所述碱成分形成一缓冲配方，使所述尿素酶活性抑制剂在所述缓冲配方中呈现稳定的高活性。
本发明提出一种抑制尿素酶的活性的组合物，包括：至少一酸成分、至少一碱成分以及尿素酶活性抑制剂，其中所述至少一酸成分为一有机酸、一磷酸及其组合其中之一，所述至少一碱成分为一有机碱、一磷酸碱及其组合其中之一、所述至少一酸成分与所述至少一碱成分具一共轭关系、且所述至少一酸成分及所述至少一碱成分形成一缓冲配方，所述尿素酶活性抑制剂为一抗坏血酸、其盐类及其组合其中之一，其中所述缓冲配方用以稳定所述尿素酶抑制剂的活性。
附图说明
本发明的上述目的及优点在参阅以下详细说明及附图之后对那些所属技术领域中具有通常知识的人将变得更立即地显而易见。
图1为一柱状图，其中显示在磷酸盐缓冲溶液中对照组(含有尿素酶)及含有不同浓度抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)的实验组在pH 5、6、6.8、7.0、7.3及8环境下测得的尿素水解抑制率。
图2为一柱状图，其中显示在柠檬酸盐缓冲溶液中对照组(含有尿素酶)及含有不同浓度抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)的实验组在pH 6.8、7.0、及7.3环境下测得的的尿素水解抑制率。
具体实施方式
本发明中提供的缓冲配方组合包括至少一酸成分、至少一碱成分及一尿素酶活性抑制剂。由于本发明的缓冲配方组合可添加于人类或动物的营养补充品或动物饲料，亦可添加于土壤或尿肥中来减少氨气排放，亦有助减少尿肥被尿素酶迅速酶解而造成的尿肥损耗。因此所使用成分必须对生物体无毒且对环境友善。本发明所指的酸成分为有机酸，碱成分为有机碱，尿素酶活性抑制剂为抗坏血酸、其盐类或其组合。此外，磷酸及磷酸盐是被广泛应用的食物添加剂，因此也在本发明酸成分及碱成分的涵盖范围内。
酸成分与碱成分具有一共轭关系，例如一有机酸与其共轭碱、或者一有机碱与其共轭酸，两者配制成一缓冲配方。缓冲配方的pH值是由酸成分的解离常数(pKa)和酸成分与碱成分的比例来决定。一般来说，pH值约在pKa值±1的范围内。常用有机酸、磷酸及抗坏血酸的pKa值如表一所示(参见Lab Manual for Zumdahl/Zumdahl’s Chemistry第6版)。在这些酸成分中，磷酸较高的pKa值有利在碱性环境的效能发挥，因此是本发明缓冲配方中酸成分的最佳选择。
选择合适的酸成分与碱成分搭配所形成的缓冲配方可具有多重pH值，因此可适应肠胃道环境的改变，确保其中的尿素酶活性抑制剂能在肠胃道中发挥作用。
本发明中使用的酸成分包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苹果酸、延胡索酸、乳酸、柠檬酸及磷酸。在优选实施例中，酸成分为磷酸或柠檬酸。本发明中使用的碱成分为有机碱或磷酸碱，优选地，有机碱或磷酸碱是指碱金属盐或碱土金属盐。在优选实施例中，磷酸碱为磷酸氢二钾及磷酸氢二钠其中之一，有机碱为为柠檬酸钠及柠檬酸钾其中之一。
本发明的缓冲配方亦可包括多种有机酸与其共轭碱、或者多种有机碱与其共轭酸。有机酸亦可与磷酸搭配作为本发明缓冲配方中的酸成分，有机碱亦可与磷酸碱搭配作为本发明缓冲配方中的碱成分。只要能调配出适合肠胃道pH值环境的缓冲配方，皆在本发明涵盖的范围内。
本发明中使用的尿素酶活性抑制剂为抗坏血酸、其盐类或其组合，优选地，抗坏血酸的盐类为其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐及其组合其中之一。
抗坏血酸(左旋抗坏血酸)也可称为维他命C，是一种溶于水且易被吸收的化合物。由于抗坏血酸单独存在水溶液中时，在pH大于4的环境下容易降解，本发明的缓冲配方可使抗坏血酸、其盐类或其组合在pH大于4的环境下仍能维持活性，因而能达到在人类或动物的肠胃道的跨酸碱环境或土壤中抑制尿素酶活性的目的。
另一方面，本发明的组合物可作为一种抑制尿素酶活性的组合物，例如添加于配方奶粉、动物饲料或肥料等营养补充品的添加物，或可直接制成饮品，在pH 5～8的环境下抑制尿素酶活性，更优选地是在pH6.8～7.3的环境下抑制尿素酶活性。
根据本发明的构想，在上述组合物中包含至少一酸成分、至少一碱成分及尿素酶活性抑制剂，其中至少一酸成分与至少一碱成分形成一缓冲配方，所述缓冲配方使尿素酶活性抑制剂在跨酸碱环境下维持高活性。在一实施例中，所述尿素酶活性抑制剂分布于所述缓冲配方中。在另一实施例中，所述缓冲配方与所述尿素酶活性抑制剂均匀混合。
在本发明中，所述尿素酶活性抑制剂为抗坏血酸、其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或其组合。在一优选实施例中，所述尿素酶活性抑制剂为抗坏血酸，尤其是左旋抗坏血酸，优选地，抗坏血酸的浓度介于120ppm至480ppm之间，更优选地为480ppm。当然，只要符合人体每日摄取量的规范(每日最高约2g)，本发明的抗坏血酸可以有较高的浓度。
根据本发明的构想，上述组合物的剂型包括粉末、颗粒、锭剂、微米颗粒、液体、胶囊及喷剂。上述剂型也可设计为缓释剂型，如缓释锭剂、缓释微米颗粒或缓释胶囊，亦可以制成人类或动物的饮品、或添加于人或动物的饮水中、或制成土壤肥料的喷剂。
以下为本发明的实施例
(一)实验方法
尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 5.0)
1.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶(U7752，Sigma-Aldrich)置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL伯特洛(Berthelot)试剂A(称取5g苯酚、25mg亚硝基氰化钠，以纯水定容至500mL)及60μLBerthelot试剂B(称取2.5g氢氧化钠、4.2mL次氯酸钠，以纯水定容至500mL)，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
1.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
2.尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0)
2.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
2.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
3.尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 6.8)
3.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
3.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
4.尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 7.0)
4.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
4.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
5.尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 7.3)
5.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
5.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
6.尿素酶活性抑制实验(磷酸盐缓冲溶液，pH 8.0)
6.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
6.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
7.尿素酶活性抑制实验(柠檬酸盐缓冲溶液，pH 6.8)
7.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
7.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
8.尿素酶活性抑制实验(柠檬酸盐缓冲溶液，pH 7.0)
8.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
8.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
9.尿素酶活性抑制实验(柠檬酸盐缓冲溶液，pH 7.3)
9.1对照组
取20μL缓冲溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL20mM尿素溶液。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。
9.2抗坏血酸样品组
取10μL缓冲溶液、10μL抗坏血酸溶液及25μL 50ppm尿素酶置于96孔盘，经37℃反应5分钟后，加入40μL 20mM尿素溶液，使抗坏血酸最终浓度分别为120ppm、240ppm及480ppm。经37℃反应10分钟后，于每孔加入55μL Berthelot试剂A及60μL Berthelot试剂B，在37℃避光静置30分钟后，以连续式酵素免疫分析仪(ELISA)在波长625nm下测定吸光值。每样品至少一式三份。尿素酶活性抑制率(Inhibitory％)＝100-((样品组吸光值/对照组吸光值)×100)。
(二)实验结果
1.实验例一
在本实施例中，利用磷酸及磷酸盐形成磷酸盐缓冲溶液(PBS)，搭配不同浓度的抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)，在不同pH环境下测量各组别对尿素酶活性的抑制率。
请参阅表二和图1，其中显示对照组(含有尿素酶)及含有不同浓度抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)的实验组的尿素水解抑制率。由表二结果可观察到，尿素水解抑制率与抗坏血酸浓度呈现正相关，以50％抑制率为比较指标，含有480ppm抗坏血酸的组别在pH 6.0-8.0的抑制率>50％，且在pH 6.8-7.3的抑制率>93％，显示，含有480ppm抗坏血酸的组别相较于对照组有显著的抑制效果。
表二
2.实验例二
在本实施例中，利用柠檬酸及柠檬酸盐形成柠檬酸盐缓冲溶液(CBS)，搭配不同浓度的抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)，在不同pH环境下测量各组别对尿素酶活性的抑制率。
请参阅表三和图2，其中显示对照组(含有尿素酶)及含有不同浓度抗坏血酸(120ppm、240ppm及480ppm)的实验组的尿素水解抑制率。由表三和图2结果可观察到，尿素水解抑制率与抗坏血酸浓度呈现正相关，以50％抑制率为比较指标，含有480ppm抗坏血酸的组别在pH6.8-7.3的抑制率>50％，且在pH 6.8-7.0的抑制率>90％，显示含有480ppm抗坏血酸的组别相较于对照组有显著的抑制效果。
表三
对各pH环境的光密度值(OD)，光密度值越高代表所测得的氨浓度越高。在pH 5～8环境下，以对照组的光密度值作为比较指针，观察到抗坏血酸在pH 5～8环境下对尿素酶水解作用具有抑制效果，特别是在pH 6.8～7.3环境下对尿素酶水解作用的抑制率达90％以上。
由于本发明的组合物中不含药物成分，较无抗药性和食安的疑虑。本发明的组合物作为人类或动物的营养补充品的添加剂时，具可抑制尿素酶活性的效能。
本发明实属难能的创新发明，深具产业应用价值，援依法提出申请。此外，本发明可以由所属技术领域中具有通常知识的人做任何修改，但不脱离如所附权利要求书所要保护的范围。
