一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法。
背景技术
水产品加工过程中，可利用部分仅占50-70％，约有30％成为副产物，这些副产物包括鱼头、鱼排(刺)、碎肉、内脏、鱼尾、鱼皮等，富含蛋白质、脂肪、氨基酸等营养物质。在下脚料废弃蛋白中，鱼溶浆是常见的废弃物。其中鱼溶浆是在鱼粉制作过程中大量的水溶性物质在蒸煮、压榨后分体形成液体。经研究发现，鱼溶浆含有大量的小分子多肽、氨基酸，牛磺酸，以及矿物质等有益成分，保留了鱼粉特有的未知生长因子。如果能够利用这些废弃蛋白进行高值化资源利用做成产品，一方面解决了废弃蛋白的处置和环境问题，另一方面高值化提升了产品的价值，增加了收入。
鱼肽类的氨基酸液肥是作为海藻肥之后，又一种针对海洋生物资源综合利用的新型肥料，也是一种功能肥，可以用作基肥、追肥、可以灌根、滴管、冲施叶面喷雾。鱼肽类肥料有着丰富的有机质，氨基酸，多肽等等，施入土壤后可大大增加土壤有机质的含量，可以迅速促进土壤微生物的繁殖，很大程度活化土壤的养分。使用鱼肽生物肥可以促进作物根系发达，提高光合作用，促进植物生长，有利于花芽分化，提早成熟，而且品质会大大的改善，果树上喷施，树叶翠绿发亮，病害减少，落花落果减少，果型好，甜度高，瓜菜品质好，产量高，营养丰富，口感好，色泽鲜艳，是一种无公害的环保型绿色营养肥。另外对一些病虫害可以起到很好的抑制作用。
本世纪九十年代有国内企业开始研发鱼蛋白肥，但鱼蛋白肥正处于起跑阶段，行业正面临农户认识不足、等级品类不一，产品质量参差不齐等诸多发展瓶颈。总得来说，目前鱼蛋白肥的制备主要问题是：(1)发酵工艺研究严重滞后(2)高效的发酵菌种极度匮乏。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，本发明采用协同发酵技术，与传统的发酵工艺相比，使得原料大分子蛋白得到有序转化，控制转化路径，避免产生腐败，耐受力强。在产品指标上，氨基酸含量10％以上，几无异味，接受度好。
本发明的具体技术方案为：一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，包括以下步骤： 1)原料预处理：收集鱼肽肥原料并搅碎匀浆，添加外加剂，混匀后加热处理。
2)一次发酵：加入物料0.2-0.4wt％的1号菌剂进行一次发酵；发酵条件为32-35℃，发酵时间为2-4h：所述1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂。
3)二次发酵：一次发酵后搅拌均匀，加入物料0.1-0.3wt％的2号菌剂进行二次发酵，发酵条件为32-35℃，发酵时间为40-50h；所述2号菌剂产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株。
4)后处理：二次发酵后搅拌均匀，依次进行加热、过滤、罐装后获得成品。
本发明采用协同发酵技术，与传统的发酵工艺相比，使得原料大分子蛋白得到有序转化，控制转化路径，避免产生腐败，耐受力强。在产品指标上，氨基酸含量10％以上，几无异味，接受度好。
具体地，在本发明的二次发酵过程中分别采用了1号菌剂和2号菌剂，两种菌剂一前一后能够协同配合提升发酵效率。其中，1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂，一次发酵中通过菌株产酸营造了合适的酸性环境，保证产品品质不易坏，同时菌株代谢后产生活性物质利于植物生长。2号菌剂为产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，通过其产生的酸性蛋白酶，可以在酸性的条件下水解大分子蛋白使其变成小分子肽和氨基酸，使其更容易被植物吸收。
作为优选，步骤1)中，所述鱼肽肥原料为鱼溶浆、鱼粉、海产品下脚料、鱼糜清洗废水回收蛋白中的一种或多种。
本发明利用鱼溶浆、鱼粉、海产品下脚料、鱼糜清洗废水回收蛋白等作为鱼肽肥的生产原料，不仅来源稳定，充分利用废弃资源，更加节能环保，并且所得鱼肽肥更容易降解吸收，活性物质营养更加丰富。
作为优选，步骤1)中，所述外加剂包括糖蜜和葡萄糖。
作为优选，步骤1)中，所述鱼肽肥原料与外加剂的质量百分含量为：鱼肽肥原料40-60％，糖蜜8-12％，葡萄糖3-7％；所得混合料的pH为4-5。
作为优选，步骤1)中，加热至70-80℃，时间为0.5-1.5h。
作为优选，步骤2)中，所述酵母菌为安琪酿酒酵母，所述乳酸菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
作为优选，步骤2)中，所述酵母菌与乳酸菌的质量比为(40∶60)-(60∶40)；植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为(40∶60)-(60∶40)。
本发明团队在前期经过大量试验后发现，当1号菌剂为上述组合时，与2号菌剂的配合效果最佳。
作为优选，步骤3)中，所述巴斯德毕赤酵母菌株命名为ZJU-c，已在2018年10月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。
本发明的巴斯德毕赤酵母菌株与其他同类菌株相比，具有高产酸性蛋白酶特性；将本发明的巴斯德毕赤酵母菌株应用于鱼肽肥的制备，发酵时所产的酶活更高，最终所得发酵液中氨基酸含量更高。在此基础上与本发明的1号菌剂配合，效果更佳。
作为优选，步骤3)中，步骤3)中，向发酵液中补充营养成分，使发酵液中NaH2PO4的浓度为11-12g/L，硫酸镁的浓度为1.0-1.2g/L，锰离子0.8-1.0g/L；培养基的盐度22-23，pH为3-4；通气量为3-5L/min，搅拌速率为300-500r/min。
作为优选，步骤4)中，加热温度为70-80℃，时间为0.5-1.5h。
作为优选，步骤4)中，在搅拌过程中还添加有鼠李糖脂，添加量为0.5-1.5wt％。
当本发明的鱼肽肥作为叶面肥时，需要施加到植物叶片表面，但是由于植物叶片的表面通常包覆有一层蜡质，导致肥料通常无法有效附着于叶片表面，使得施肥效果不佳。为此，本发明特意在液体肥料中添加鼠李糖脂，鼠李糖脂能够有效提高肥料在植物叶片表面的附着力，从而显著提升施肥效果。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用协同发酵技术，与传统的发酵工艺相比，使得原料大分子蛋白得到有序转化，控制转化路径，避免产生腐败，耐受力强。在产品指标上，氨基酸含量10％以上，几无异味，接受度好。
(2)选用本发明特定的1号菌剂和2号菌剂先后进行发酵处理，两种菌剂能够协同配合，大幅提高发酵效率。
(3)本发明利用鱼溶浆、鱼粉、海产品下脚料、鱼糜清洗废水回收蛋白等作为鱼肽肥的生产原料，不仅来源稳定，充分利用废弃资源，更加节能环保，并且所得鱼肽肥更容易降解吸收，活性物质营养更加丰富。
附图说明
图1为实施例1(左侧)以及实施例5所得鱼肽肥(右侧)作为叶面肥施加于植物叶片表面的效果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：收集鱼肽肥原料并搅碎匀浆，添加外加剂，混匀后加热至70-80℃，时间为 0.5-1.5h。所述鱼肽肥原料为鱼溶浆、鱼粉、海产品下脚料、鱼糜清洗废水回收蛋白中的一种或多种。所述鱼肽肥原料与外加剂的质量百分含量为：鱼肽肥原料40-60％，糖蜜8-12％，葡萄糖3-7％；所得混合料的pH为4-5。
2)一次发酵：加入物料0.2-0.4wt％的1号菌剂进行一次发酵；发酵条件为32-35℃，发酵时间为2-4h；所述1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂。酵母菌为安琪酿酒酵母，乳酸菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，酵母菌与乳酸菌的质量比为(40∶60)-(60∶40)；植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为(40∶60)-(60∶40)。
3)二次发酵：一次发酵后搅拌均匀，加入物料0.1-0.3wt％的2号菌剂进行二次发酵，发酵条件为32-35℃，发酵时间为40-50h；所述2号菌剂产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母ZJU-c，已在2018年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
4)后处理：二次发酵后搅拌均匀，依次进行加热至70-80℃，时间为0.5-1.5h、过滤、罐装后获得成品。
作为优选，步骤3)中，向发酵液中补充营养成分，使发酵液中NaH2PO4的浓度为 11-12g/L，硫酸镁的浓度为1.0-1.2g/L，锰离子0.8-1.0g/L；培养基的盐度22-23，pH为3-4；通气量为3-5L/min，搅拌速率为300-500r/min。
作为优选，步骤4)中，在搅拌过程中还添加有鼠李糖脂，添加量为0.5-1.5wt％。
实施例1
一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：收集鱼肽肥原料并搅碎匀浆，添加外加剂，混匀后加热至75℃，时间为1h。所述鱼肽肥原料为鱼溶浆。所述鱼肽肥原料与外加剂的质量百分含量为：鱼溶浆50％，糖蜜 10％，葡萄糖5％；所得混合料的pH调节为4.5。
2)一次发酵：加入物料0.3wt％的1号菌剂进行一次发酵；发酵条件为32-35℃，发酵时间为3h；所述1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂。酵母菌为安琪酿酒酵母(安琪白酒曲)，乳酸菌为植物乳杆菌(江门金远洋生物科技有限公司产)和嗜酸乳杆菌(江门金远洋生物科技有限公司产)，酵母菌与乳酸菌的质量比为50∶50；植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为50∶50。
3)二次发酵：向发酵液中补充营养成分，使发酵液中NaH2PO4的浓度为11.55g/L，硫酸镁的浓度为1.14g/L，锰离子0.9g/L；培养基的盐度22.76，pH为3.5；通气量为4L/min，以400r/min搅拌均匀；然后加入物料0.2wt％的2号菌剂进行二次发酵，发酵条件为32-35℃，发酵时间为48h；所述2号菌剂产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母ZJU-c，已在2018年10月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
4)后处理：二次发酵后搅拌均匀，依次进行加热至75℃，时间为1h、过滤、罐装后获得成品。
如下所示为发酵前后物料中蛋白质/氨基酸的分子量分布范围：
由上表中数据可知，经过本发明发酵处理后物料中1000分子量以下的占比明显增多。
实施例2
一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：收集鱼肽肥原料并搅碎匀浆，添加外加剂，混匀后加热至70-80℃，时间为 0.5-1.5h。所述鱼肽肥原料为鱼粉。所述鱼肽肥原料与外加剂的质量百分含量为：鱼粉40％，糖蜜12％，葡萄糖7％；所得混合料的pH调节为5。
2)一次发酵：加入物料0.2wt％的1号菌剂进行一次发酵；发酵条件为32-35℃，发酵时间为4h；所述1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂。酵母菌为安琪酿酒酵母，乳酸菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，酵母菌与乳酸菌的质量比为40∶60；植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为60∶40。
3)二次发酵：向发酵液中补充营养成分，使发酵液中NaH2PO4的浓度为11.55g/L，硫酸镁的浓度为1.14g/L，锰离子0.9g/L；培养基的盐度22.76，pH为3.5；通气量为3L/min，以500r/min搅拌均匀；然后加入物料0.1wt％的2号菌剂进行二次发酵，发酵条件为32-35℃，发酵时间为50h；所述2号菌剂产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母ZJU-c，已在2018年10月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
4)后处理：二次发酵后搅拌均匀，依次进行加热至70℃，时间为1.5h、过滤、罐装后获得成品。
实施例3
一种基于二次发酵技术的鱼肽肥制备方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：收集鱼肽肥原料并搅碎匀浆，添加外加剂，混匀后加热至70-80℃，时间为 0.5-1.5h。所述鱼肽肥原料为海产品下脚料。所述鱼肽肥原料与外加剂的质量百分含量为：海产品下脚料60％，糖蜜8％，葡萄糖3％；所得混合料的pH调为4。
2)一次发酵：加入物料0.4wt％的1号菌剂进行一次发酵；发酵条件为32-35℃，发酵时间为2h；所述1号菌剂为酵母菌和乳酸菌的混合菌剂。酵母菌为安琪酿酒酵母，乳酸菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，酵母菌与乳酸菌的质量比为60∶40；植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为40∶60。
3)二次发酵：向发酵液中补充营养成分，使发酵液中NaH2PO4的浓度为11.55g/L，硫酸镁的浓度为1.14g/L，锰离子0.9g/L；培养基的盐度22.76，pH为3.5；通气量为3L/min，以500r/min搅拌均匀；然后加入物料0.3wt％的2号菌剂进行二次发酵，发酵条件为32-35℃，发酵时间为40h；所述2号菌剂产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母ZJU-c，已在2018年10月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
4)后处理：二次发酵后搅拌均匀，依次进行加热至80℃，时间为0.5h、过滤、罐装后获得成品。
对比例1
对比例1采用与实施例1相同配方、同一批次的原料。区别在于省略了一次发酵的步骤，总发酵时长相同。
如下所示为发酵前后物料中蛋白质/氨基酸的分子量分布范围：
由上表中数据可知，与实施例1中的数据相比，对比例1发酵产物中大分子量的占比明显要更高，说明发酵不够彻底。
对比例2
对比例2采用与实施例1相同配方、同一批次的原料。与实施例1的区别在于采用不同的2 号菌剂(盔状毕赤酵母菌株CGMCC24056)。
如下所示为发酵前后物料中蛋白质/氨基酸的分子量分布范围：
由上表中数据可知，与实施例1中的数据相比，对比例2发酵产物中大分子量的占比明显要更高，说明发酵不够彻底。
实施例1以及对比例1-2所得发酵产物中氨基酸(采用NYT 1975-2010水溶肥料 游离氨基酸含量的测定)含量如下所示：
由上表中数据可知，实施例1所得发酵产物中氨基酸的含量要显著优于对比例1-2。其中，与对比例1相比说明了本发明在二次发酵工艺上具有显著提升；与对比例2相比说明了本发明特定的2号菌株与其他同类菌株相比，由于其产酸性蛋白酶的能力更强，因此能够显著提升发酵产物中氨基酸含量。
实施例4
为了进一步验证本发明菌株与普通同类菌株相比具有更高的产酸性蛋白酶能力，进行如下实验：
7.5L发酵罐的发酵试验
在通气量为4L/min、400r/min的条件下，以3％的接种量转接发酵24h，培养基配方为废糖蜜50g/L，豆粕粉50g/L，NaH2PO4 11.55g/L；硫酸镁1.14g/L；培养基的盐度22.76；pH调为3-4。最后粗酶液酶活达到9854.4±4.5U/mL，为获得较好的氨基酸液肥研制效果，对粗酶液酶活性质进行进一步研究，研究结果表明，在pH 3.5、45℃条件下，加入0.9g/L锰离子可以使粗酶液蛋白酶酶活达到10542.9±2.7U/mL。
在同样工艺条件下，本发明菌株与市购菌株的数据对比如下表所示：
注：市售菌株信息如下：CGMCC-24056，拉丁学名Pichia galeiformis，中文译名盔状毕赤酵母。
酶活定义：在pH＝3.0、40℃条件下，1毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸对应消耗的酶量为1个蛋白酶活力单位，用U/mL表示。
通过上述的数据对比可知，本发明与现有的市售同类菌株相比，在发酵后所得粗酶液的酶活提升了205％左右。可知本发明菌株在产酸性蛋白酶效果以及发酵制备氨基酸液肥效果上具有显著的优势。
实施例5
本实施例5与实施例1相比，区别仅仅在于步骤4)中，在搅拌过程中还添加有鼠李糖脂，添加量为1％。
将实施例1(左侧)以及实施例5所得鱼肽肥(右侧)作为叶面肥施加于植物叶片表面，效果如图1所示。由图1可知，不含有鼠李糖脂的鱼肽肥在植物叶片表面呈液滴状，非常容易流失，而实施例5含有鼠李糖脂的鱼肽肥则能够在植物叶片表面充分铺展润湿，因此更加容易渗透进入植物叶片内部。
此外，本发明团队还发现在鱼肽肥中添加鼠李糖脂后能够对真菌类病害进行有抑制，包括灰霉，稻瘟，赤霉，腐烂，镰刀菌等真菌类病害具有明显的抑菌作用。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
