一种有机垃圾热解方法
技术领域
本发明涉及有机垃圾处理领域，特别地涉及一种有机垃圾热解方法。
背景技术
固体有机废物的堆肥处理技术是指依靠细菌、放线菌、真菌等微生物，有控制地促进可被微生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程。根据堆质过程中的温度变化和微生物生长情况，堆质过程分为升温阶段(产热阶段)、高温阶段、降温阶段。
堆肥初期肥堆中嗜温性微生物利用可溶性和易降解性有机物作为营养和能量来源，迅速增殖并释放出热能，使堆肥温度不断上升，当肥堆温度上升到45℃以上时，即进入高温阶段。通常从堆积发酵开始，只需2-3天时间堆肥温度便能迅速地升高到55℃，1周内温度可达到最高值(最高值可达80℃)，除前一阶段残留的和新形成的可溶性有机物继续分解转化外，半纤维素、纤维素、蛋白质等复杂有机物也开始强烈分解。在高温阶段，嗜温性微生物受到抑制，嗜热性微生物逐渐取而代之。
生物强化技术是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果，投加后的微生物可以来源于原有的处理体系。研究者已把这项技术应用于工业废水、地表水及地下水中难降解有毒有害物质的治理或用于改善废水处理效果，可显著提高微生物活性。
在生物强化技术使用过程中，如何充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物的处理效果，如何抑制高温处理物料对于微生物的抑制，是这一技术在工业生产中亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种有机垃圾热解方法。
本发明是以如下技术方案实现的：
一种有机垃圾热解方法，包括在堆肥进入高温阶段时添加经改造的转基因细菌作为外源菌制剂。
进一步地，所述经改造的转基因细菌包括：
(a)具有SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20ID%20NO:2所示的核苷酸序列；
(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且编码与(a)相同的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)具有与SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20ID%20NO:2所示的核苷酸序列95％以上同源性且能够在宿主细胞中表达并使宿主细胞具有嗜热特性的核苷酸序列。
进一步地，所述表达盒包括在有效连接的调控序列调控下的上述核苷酸序列。
进一步地，所述重组载体包括上述核苷酸序列或上述表达盒。
进一步地，所述方法包括构建热泉样品嗜热基因文库，优选地，应用大肠杆菌表达系统构建热泉样品耐高温基因文库。
进一步地，分别在不同环境温度下培养插入外源基因的大肠杆菌，用常见通用引物和古菌特异性引物测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得耐高温相关基因，之后随机插入芽孢杆菌对芽孢杆菌进行基因改造。
进一步地，将重组克隆载体分别用热激方法转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑取白色菌落，培养后提取质粒，经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体中分别对应的插入上述核苷酸序列。
本发明具有以下有益效果：
1)嗜热微生物的基因序列同已知的微生物同源性存在着显著差异，接近半数的功能基因的序列还未确认。充分利用超嗜热古细菌的基因资源、发现和鉴定其未知基因的功能，对确定超嗜热酶的分子机制、酶学特性和对生命起源与生命进化的探索都有重要的理论意义。
2)外加嗜热微生物提高了堆肥微生物区系的丰度，增加高温堆肥过程中的细菌数量。
3)操作简单，成本低廉，处理过程无污染物产生，可以避免传统微生物接种剂易受堆肥条件影响或高温堆肥过程抑制传统菌剂生长的问题，显著提高了堆肥效率和堆肥产品品质。
4)本发明所述的微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法具有很好的应用价值，堆肥企业可利用该技术进行畜禽粪便、农作物秸秆的减量化处理和有机肥生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述，以下试剂或菌剂若无特殊说明，均为市售试剂或菌剂。
本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了%20DNA的其它互补链。
本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA%20的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA%20实际上是从DNA的“反义”链转录的。
“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA。
在一个方面中，本发明提供包含选自下组的DNA序列的DNA分子：%20(a)与SEQ%20IDNO:1、2中任一具有至少85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ%20ID%20NO:1、2中任一的序列；和(c)SEQ%20ID%20NO:1、2中任一的片段，其中所述片段具有基因调控活性，其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接。
在一个实施方案中，DNA分子与SEQ%20ID%20NO:1、2中任一的DNA序列具有至少约90％序列同一性。在另一个实施方案中，DNA分子与SEQ%20ID%20NO:1、2任一的DNA序列具有至少95％序列同一性。
基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、%2050℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在%2065℃下与SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2、SEQ%20ID%20NO:3发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
可通过载体例如质粒、杆状病毒、人工染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体将包含编码序列的重组核苷酸或重组DNA构建体递送到宿主细胞内。此类载体可用于实现编码序列在宿主细胞内的稳定或瞬时表达；并且如果可能，随后表达成多肽。包含编码序列并且引入到宿主细胞内的外源性重组多核苷酸或重组DNA构建体在本文中也被称为“转基因”。
因此还提供包含任何重组多核苷酸(即，转基因)的表达任何一种或多种编码序列的转基因细菌。“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于，土壤杆菌属%20(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属%20(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或者根瘤菌属(Rhizobium)细胞。
使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。
由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
在本发明中，与SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2或SEQ%20ID%20NO:3所表达的氨基酸序列具有一定同源性。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于78％，优选的大于85％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于%2095％，并且可以大于99％。
根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、%2084％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、%2095％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。
实施例1：
为实现上述目的，构建热泉样品嗜热基因文库。具体地，样品取自德仲温泉水体及周边泥土，水体取样1000mL，土壤取样量为1000g，运输过程中保持55℃的温度环境，将水体与土壤充分混合后，取上清液置于液体富集培养基中，55℃培养5天，采取冻融法裂解细胞并提取微生物总DNA，纯化DNA样品。
将纯化获得的DNA样品进行测序，应用大肠杆菌表达系统(购自上海邦景实业有限公司)构建热泉样品耐高温基因文库。具体地，将基因组总%20DNA随机打断至50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、500bp、1.0kb、%201.5kb、2.0kb长度的片段，将打断后的DNA片段与接头连接，之后上机测序获得短序列文库(50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、500bp序列)，采用Cre-Lox建库技术构建大片段文库(1.0kb、1.5kb、2.0kb序列)，在大片段两端连接LoxP接头后进行环化测序，通过SOLEXA测序平台完成基因组测序(南京金斯瑞)。
实施例2：
分别在不同环境温度下培养实施例1中插入外源基因的大肠杆菌。具体地，将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至LB培养基(固体培养基)进行耐高温测试，温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，培养%203天，每个温度条件设置3个培养皿，3天后，每个培养皿挑取30-40个长势旺盛的克隆进行测序。
分别用常见通用引物和古菌特异性引物测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得耐高温相关基因Rq-01、Rq-02、%20Rq-03、Rq-04、Rq-05、Rq-06、Rq-07，经过BLAST比对，将与芽孢杆菌同源性较高的Rq-05、Rq-06进行密码子改造，之后随机插入芽孢杆菌对芽孢杆菌进行基因改造。
实施例3：
获得改造后的基因Rq-05核苷酸序列如SEQ%20ID%20NO:1所示，Rq-06核苷酸序列如SEQID%20NO:2所示，上述序列5’端还连接有NcoI酶切位点，3’端还连接有SwaI酶切位点，所述Rq-05、Rq-06的核苷酸序列由南京金斯瑞合成，克隆载体pGEM-T(购自Promega)中分别连接所述合成的Rq-05、%20Rq-06核苷酸序列，连接过程参考说明书，得到重组克隆载体pGEM-Rq-05、pGEM-Rq-06(载体结构：Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体%20f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；%20T7为T7RNA聚合酶启动子；Rq-05/Rq-06为Rq-05/Rq-06核苷酸序列；%20MCS为多克隆位点)。
将重组克隆载体pGEM-Rq-05、pGEM-Rq-06分别用热激方法转化枯草芽孢杆菌感受态细胞(市售)。挑取白色菌落，培养后提取质粒，经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pGEM-Rq-05、%20pGEM-Rq-06中分别对应的插入所述Rq-05/Rq-06核苷酸序列。
实施例4：转基因枯草芽孢杆菌的耐高温测试
将上述插入外源基因的枯草芽孢杆菌分别接于50ml%20LB液体培养基中，插入Rq-05核苷酸序列接种21瓶，分7组，每组3瓶，插入Rq-06核苷酸序列接种21瓶，分7组，每组3瓶，取未经改造的枯草芽孢杆菌接于50ml%20LB液体培养基中，分8组，每组1瓶；上述菌体接种量为1g，分别于45℃、%2050℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃培养2h，测定OD值，测定结果如表1所示：
表1不同温度条件下2小时OD值测定
结果表明，转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌44℃-65℃增殖较快， 55℃长势旺盛；转入Rq-06核苷酸序列的枯草芽孢杆菌50℃-70℃均能保持较快的增殖速度，在60℃具有旺盛涨势；转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌在75℃下明显观察到高温对其生长发育起到了抑制作用。
实施例5：
测试转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入Rq-06核苷酸序列的枯草芽孢杆菌对混合易腐有机垃圾的处理效果。将待处理的混合易腐有机垃圾进行分拣，去除塑料等。在混合易腐有机垃圾中加入转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入Rq-06核苷酸序列的枯草芽孢杆菌菌体，质量比例为1:1，制成固体菌剂，固体菌剂与混合易腐有机垃圾的质量比为 1：200，总量1kg，混合物搅拌均匀后在55℃下进行好氧发酵，取等质量混合易腐有机垃圾作为对照CK组，在相同温、湿度条件下发酵，过程中保持通风。连续监测混合物的质量，每隔12h进行称重，得到混合易腐有机垃圾的湿重减量数据，减量数据如表2所示。
表2.混合易腐有机垃圾减量数据
48h内混合有转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入Rq-06核苷酸序列的枯草芽孢杆菌的混合易腐有机垃圾湿重减量率高达87.8％，且在 36h后就已经接近最大值，而不接菌种的对照组的湿重减量率为45.6％。相比对照组，菌株FH-JW1将混合易腐有机垃圾的湿重减量率提高了42.2％。由此可见，转入Rq-05核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入Rq-06核苷酸序列的枯草芽孢杆菌在好氧条件下可以提高混合易腐有机垃圾湿重减量率，具有很高的应用价值和广阔的应用前景。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 上海国璨环境科技有限公司
<120> 一种有机垃圾热解方法
<130> CZGZhuanC-sanhuan-2020042303
<141> 2020-04-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgtgagcg tgtgccgtcc ggattggagc gtggtggcgc gtaacgatcg tgtggaagat 60
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